Glikoprotein E Terpotong Dari Virus Varicella-zoster Merupakan Imunogen Ideal Untuk Desain Vaksin Berbasis Escherichia Coli

Virus Varicella-zoster (VZV) adalah agen yang sangat menular yang menyebabkan penyakit varicella dan herpes zoster. Meskipun kemanjurannya tinggi, masih ada kekhawatiran mengenai keamanan dan aksesibilitas terhadap vaksin berlisensi. Di sini, kami berusaha menghasilkan imunogen VZV gE menggunakan sistem ekspresi E. coli. Kami menemukan bahwa ekspresi terlarut dan hasil protein gE dapat ditingkatkan melalui pemotongan terminal-C pada protein tersebut, sehingga memfasilitasi proses pemurnian yang kuat dan terukur untuk pembuatan vaksin. GE terpotong timbal (aa 31–358), selanjutnya disebut sebagai tgE, adalah monomer homogen dalam larutan dan menunjukkan antigenisitas yang sangat baik. Terakhir, kami menilai dan membandingkan imunogenisitas tgE dengan vodka LAV komersial dan vaksin Shingrix. Kami menemukan bahwa tgE yang diberi ajuvan aluminium bersifat imunogenik dibandingkan dengan vodka LAV. Ketika ditambah dengan AS01B, imunisasi tgE dua dosis menunjukkan potensi yang sebanding atau lebih baik dalam respons antibodi dan imunitas seluler dengan vaksin Shingrix pada dosis yang sama, terutama dalam hal proporsi ekspresi IFN- - CD4+ sel T. Kesimpulannya, metode ekspresi tgE yang dimediasi E. coli ini menawarkan strategi yang hemat biaya dan terukur untuk menghasilkan imunogen VZV gE yang ideal untuk pengembangan vaksin varicella dan zoster.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

virus varicella-zoster, glikoprotein E, Escherichia coli, vaksin

PERKENALAN

Virus Varicella-zoster (VZV) adalah virus herpes alfa manusia yang patogenik dan menginduksi dua kategori utama penyakit: infeksi primer varicella, penyakit yang sangat menular yang ditandai dengan ruam seperti lepuh pada kulit dan gejala sistemik ringan seperti demam dan malaise. terutama pada anak-anak; dan herpes zoster (HZ), reaktivasi virus secara laten sebagai respons terhadap melemahnya sistem kekebalan seluler akibat penuaan yang menyebabkan ruam vesikular (HZ) yang terlokalisasi dan menyakitkan dengan atau tanpa beberapa komplikasi lain (Cohen, 2013; Heininger dan Seward, 2006; Zerboni dkk., 2014). Varicella dan HZ dapat dicegah dengan vaksin virus hidup yang dilemahkan (LAV). LAV pertama untuk pencegahan varicella dikembangkan oleh Takahashi et al. (1974) berdasarkan strain virus vOka dan kemudian dilisensikan sebagai Varivax untuk penggunaan rutin di Amerika Serikat. Hal ini diikuti dengan pengembangan dan perizinan Zostavax untuk pencegahan HZ (Tseng et al., 2011). Sayangnya, dalam 10 tahun sejak inokulasi Varivax dimulai, hampir 1/3 kasus HZ telah dipastikan terkait dengan strain vOka (Galea et al., 2008), yang menunjukkan bahwa vOka dapat menginfeksi dan menimbulkan latensi, seperti virus liar. -tipe virus, lalu aktif kembali sehingga menimbulkan HZ. Selain itu, kemanjuran Zostavax berbanding terbalik dengan usia pasien pada saat pemberian, dengan peningkatan usia berhubungan dengan kemanjuran yang lebih rendah (Oxman et al., 2005). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan glikoprotein E (gE) VZV menjadi glikoprotein virus yang paling melimpah pada selubung virion dan permukaan sel yang terinfeksi. GE juga merupakan salah satu antigen pelindung VZV terpenting yang mampu menginduksi imunitas seluler dan humoral selama infeksi varicella alami serta setelah vaksinasi vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Baru-baru ini, vaksin subunit HZ rekombinan, Shingrix (HZ/su), disetujui untuk pencegahan HZ dan neuralgia postherpetik (PHN) terkait pada orang dewasa berusia lebih dari atau sama dengan 50 tahun (Shah et al., 2019; Syed, 2018). Dalam uji klinis, Shingrix menginduksi imunitas seluler (CMI) spesifik VZV yang efisien, dengan kemanjuran vaksin secara keseluruhan sebesar 97,2% pada peserta berusia lebih dari atau sama dengan 50 tahun dan tingkat perlindungan sebesar 91,3% pada peserta berusia lebih dari atau sama dengan hingga 70 tahun. Temuan-temuan ini secara kolektif menunjukkan penurunan risiko HZ secara signifikan pada individu yang divaksinasi tanpa memandang usia, dan dengan demikian merupakan pilihan vaksin yang lebih manjur dibandingkan dengan ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Shingrix dirancang dari antigen gE rekombinan yang diekspresikan dalam sel ovarium hamster Cina (CHO) dan sistem adjuvan berbasis liposom (AS01B) yang mengandung 3-Odesacyl-4′-monofosforil lipid A (MPL) dan Quillaja saponaria Molina, pecahan 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Namun, sel CHO rekombinan memerlukan siklus produksi yang panjang dan berhubungan dengan proses pemurnian yang kompleks sehingga mengakibatkan biaya produksi yang tinggi dan pasokan yang terbatas. Oleh karena itu, Shingrix bukanlah solusi vaksinasi yang ideal untuk digunakan secara luas, khususnya di negara-negara berkembang (Kim et al., 2012). Sistem ekspresi mikroba menawarkan beberapa keunggulan dibandingkan sistem ekspresi mamalia, termasuk pertumbuhan yang cepat, kemudahan budidaya, dan biaya produksi yang lebih rendah (Overton, 2014), sehingga banyak digunakan dalam ekspresi dan produksi berbagai biofarmasi (Adkins dan Wagstaff, 1998; Monie dkk., 2008; Wu dkk., 2012). Namun, beberapa kesulitan selama produksi perlu diatasi agar ekspresi protein eukariotik rekombinan berhasil dalam sistem prokariotik, seperti lipatan yang salah dan kurangnya modifikasi pasca-translasi (Singh dan Panda, 2005). Terlepas dari kesulitan-kesulitan ini, sistem ekspresi mikroba dapat menawarkan sistem yang ideal untuk pembuatan vaksin yang tersebar luas dan hemat biaya, dan oleh karena itu, memerlukan penyelidikan antigen dari sistem ekspresi E. coli untuk desain vaksin VZV. Dalam penelitian sebelumnya, kami menunjukkan keberhasilan ekspresi protein gE (rgE) rekombinan dalam sel serangga dan memperoleh protein murni untuk imunisasi tikus dan produksi mAb (Liu et al., 2015). Berdasarkan penelitian ini, di sini kami menyelidiki apakah protein gE dapat diekspresikan dalam E. coli. Kami mengeksplorasi ekspresi antigen kandidat gE yang tidak larut dalam fusi dengan pemotongan terminal-C (selanjutnya disebut sebagai gE terpotong (tgE) atau tgE) dalam E. coli dan mengkarakterisasi protein tgE yang dimurnikan. Kami menunjukkan bahwa tgE yang dimurnikan bersifat antigenik mirip dengan gE asli, dan mampu menginduksi titer antibodi tinggi dengan aktivitas penetral vOka pada tikus. Ketika membandingkan imunogenisitas antigen tgE yang dihasilkan dalam penelitian kami dengan LAV dan Shingrix, kami menemukan bahwa antigen kami tidak hanya menunjukkan respons humoral yang efisien tetapi juga menginduksi CMI spesifik antigen. Secara keseluruhan, strategi E. coli kami untuk produksi protein tgE dapat membuka jalan bagi imunogen alternatif yang diproduksi secara industri untuk vaksinasi varicella dan HZ.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

HASIL

Ekspresi dan pemurnian tgE rekombinan di E. coli

Urutan DNA yang mengkode domain ekstraseluler VZV gE disiapkan sebagai konstruksi dengan berbagai pemotongan terminal N atau C, dan dikloning ke vektor pTO-T7 untuk ekspresi protein dalam E. coli. Domain ekstraseluler gE dengan panjang penuh cenderung membentuk badan inklusi di E. coli selama ekspresi, dan ini dapat ditingkatkan dengan pemotongan terminal-C. Dari berbagai protein terpotong, kelarutan terbaik dicapai dengan konstruk gE (aa 31–358) (Gambar 1A), selanjutnya disebut sebagai gE terpotong atau tgE. Kandidat tgE berhasil diekspresikan sebagai protein rekombinan terlarut dan dimurnikan dari supernatan bakteri lisat menggunakan kromatografi tiga langkah pada skala laboratorium untuk penilaian dan pengembangan lebih lanjut sebagai vaksin potensial. Kromatografi penukar anionik kuat digunakan untuk penangkapan diikuti dengan tahap hidroksiapatit keramik dan kromatografi hidrofobik (Gambar 1B). Tahapan proses pemurnian yang berurutan menunjukkan peningkatan kemurnian tgE pada SDS-PAGE (Gambar 1C). tgE bermigrasi sebagai pita sekitar 40 kD dan menunjukkan reaktivitas yang baik dengan antibodi spesifik 1B11 (Gambar 1D). Hasil keseluruhannya adalah sekitar 500 ug tgE murni per gram bakteri.

Karakterisasi gE terpotong

Kromatografi eksklusi ukuran kinerja tinggi (HPSEC) dan ultrasentrifugasi analitik (AUC) digunakan untuk menganalisis homogenitas dan koefisien sedimentasi protein murni. Protein rgE yang dimurnikan dari sistem sel serangga (Liu et al., 2015) digunakan sebagai kontrol. Dalam HPSEC, tgE muncul puncak yang tajam pada waktu retensi dominan 16,1 menit (Gambar 2A), mencerminkan homogenitas yang tinggi untuk protein tgE yang dimurnikan. Dalam percobaan AUC, puncak sedimentasi yang dominan diamati pada ~2,3 S (Gambar 2B), yang setara dengan ~39,4 kD, menunjukkan bahwa tgE hadir sebagai monomer dalam larutan. Kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) digunakan untuk menguji stabilitas termal protein tgE dengan memantau kapasitas panas selama proses pembukaan termal. Profil DSC hanya menunjukkan satu transisi termal selama pembukaan protein pada nilai suhu transisi (Tm) 63,80 derajat untuk tgE, sebanding dengan rgE (63,64 derajat ) (Gambar 2C). Untuk menyelidiki integritas konformasi protein tgE yang dimurnikan, kami menganalisis antigenisitas tgE menggunakan uji ELISA, dengan protein rgE yang dimurnikan diekspresikan dalam sel serangga yang berfungsi sebagai kontrol. Sembilan mAb yang dapat mengenali epitop konformasi (mAb 1B11, 4G4, 14G1) atau epitop linier (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) digunakan dalam uji ELISA (Gambar 3). Kami menemukan nilai konsentrasi efektif median (EC50, ng mL−1) yang serupa untuk protein tgE dan rgE untuk sebagian besar antibodi kecuali 1B11, yang memiliki reaktivitas hampir 10-kali lipat lebih rendah, yang menunjukkan antigenisitasnya serupa. Hasil ini menunjukkan bahwa epitop kunci pada rgE terawetkan dengan baik dalam protein tgE.

Gambar 1 (Warna online) Ekspresi dan pemurnian protein. Representasi skema desain konstruksi tgE. Sel E. coli ditransformasikan dengan plasmid rekombinan yang membawa gen terpotong gE (aa 31–358). B, Representasi skematis dari proses pemurnian tgE. tgE dimurnikan dari supernatan yang dilisiskan menggunakan kromatografi tiga langkah. C, profil SDS-PAGE tgE selama proses pemurnian. Berat molekul tgE kira-kira 40 kD. M: penanda berat molekul. Jalur 1: supernatan dipisahkan dari sel lisat; jalur 2: fraksi mengandung tgE dari kromatografi Q-FF; jalur 3: fraksi mengandung tgE dari kromatografi CHT; jalur 4: fraksi dari kromatografi Butil, mengandung protein tgE dengan kemurnian tinggi. D, Immunoblotting dari tgE yang dimurnikan.

Analisis respon imun yang disebabkan oleh tgE pada tikus

Untuk membandingkan imunogenisitas tgE dengan rgE, kami memformulasikan protein dengan dua bahan pembantu yang biasa digunakan untuk penelitian: bahan pembantu berbasis aluminium Al-001 dan bahan pembantu Freund. Tikus diimunisasi tiga kali pada minggu 0, 2, dan 4 dengan dosis 1 ug untuk tgE dan rgE tambahan. Titer antibodi spesifik gE dan respons sel T pada minggu ke 5 pasca imunisasi pertama digunakan untuk menentukan imunogenisitas formulasi bahan pembantu yang berbeda. Tikus yang diimunisasi dengan vaksin tgE yang diformulasikan dengan Al-001 menunjukkan profil antibodi yang serupa dengan tikus pada kelompok rgE, dan bahan pembantu Freund menunjukkan efek stimulasi yang lebih baik bila diformulasikan dengan tgE dibandingkan dengan rgE (Gambar 4A). Titer netralisasi tidak menunjukkan perbedaan pada tikus yang diimunisasi dengan vaksin tgE atau rgE, dengan titer netralisasi ~103 untuk tgE yang diformulasikan dengan bahan pembantu yang berbeda (Gambar 4B). Namun, dalam analisis sel T CD4+ dari splenosit dengan pewarnaan sitokin intraseluler (ICS), baik vaksin tgE maupun rgE menghasilkan tingkat IFN- spesifik gE yang serupa dibandingkan dengan kelompok saline (Gambar 4C, ~{ {22}}.1% untuk kelompok vaksin atau kelompok saline), dan hanya simulasi moderat IL spesifik gE{{20}} (Gambar 4D, ~0.2% untuk kelompok vaksin vs. ~0.1 % untuk kelompok garam). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa bahan pembantu tgE/Al-001 dan tgE/Freund menghasilkan respons imun spesifik gE yang sebanding dengan yang ditimbulkan oleh rgE, dengan respons humoral yang sangat kuat.

Evaluasi kandidat vaksin varicella tgE dibandingkan dengan LAV

Kami selanjutnya mengevaluasi produksi antibodi dan persistensi protein tgE yang didukung aluminium pada tikus BALB/c. Dua kelompok mencit (n=5 per kelompok) diimunisasi sebanyak tiga kali pada minggu 0, 2, dan 4 dengan dosis berbeda yaitu 00,5 ug dan 5 ug tgE/Al{{ 8}} (Gambar 5A dan B). Profil respons antibodi menunjukkan bahwa inokulasi primer protein tgE menghasilkan titer antibodi yang tinggi, dengan peningkatan yang berkelanjutan setelah dua imunisasi booster pada minggu ke-2 dan ke-4, dan mencapai tingkat maksimum pada minggu ke-6 sebelum perlahan-lahan turun menjadi lebih dari 1{{ 20}}4 selama periode pemantauan. Kelompok dosis yang berbeda memiliki profil titer antibodi yang serupa selama periode pemantauan, dengan titer penetralisir tinggi yang serupa pada minggu ke 6. Imunogenisitas tgE dievaluasi dan dibandingkan dengan vodka. Dosis setengah efektif (ED50) pada tikus digunakan sebagai ukuran serokonversi, dengan ED50 yang lebih rendah menunjukkan imunogenisitas yang lebih baik. Tikus Balb/c dipisahkan menjadi beberapa kelompok dan diimunisasi secara intraperitoneal dengan tgE yang ditambah aluminium (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625, atau 0.03125 ug; n{{30}}) atau vaksin vOka (1,000, 500, 250, 125, atau 62,5 pfu; n=6) dalam pengenceran serial. Sera dikumpulkan setelah 4 minggu dan diuji menggunakan ELISA. Serokonversi dianalisis menurut metode Reed dan Muench (Gambar 5C). Pada kelompok umur, tikus memiliki tingkat serokonversi sebesar 83%, 100%, 100%, 100%, 50%, dan 17% untuk dosis 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, dan 0,03125 ug, masing-masing. Pada kelompok vodka, tikus memiliki tingkat serokonversi yang lebih rendah yaitu 67%, 50%, 33%, 17%, dan 0% untuk masing-masing dosis 1,000, 500, 250, 125, atau 62,5 pfu. Nilai ED50 adalah 0,063 ug untuk tgE dan 449,425 pfu untuk vOka, yang menunjukkan bahwa imunogenisitas tgE pada dosis lebih rendah yaitu 0,3 ug setara dengan yang dicapai dengan dosis tunggal vaksin varicella yang mengandung vOka (biasanya lebih dari 2,{{78} } pfu per dosis).

Gambar 2 Karakterisasi protein tgE dan rgE. A, profil HPSEC dari tgE yang dimurnikan. Waktu retensi gE ditunjukkan. B, Analisis kecepatan sedimentasi protein tgE yang dimurnikan. Koefisien sedimentasi dan berat molekul tgE ditentukan dengan metode c(s) dan c(M) secara independen. Pada (A) dan (B), tgE ditampilkan dalam warna hitam dan merah dengan warna biru. C, Profil kalorimetri pemindaian diferensial dari protein tgE dan rgE yang dimurnikan.

Gambar 3 Reaktivitas tgE dan rgE dengan mAb. mAb diencerkan secara serial dan direaksikan dengan protein tgE atau rgE yang dilapisi dalam uji ELISA. Reaksi dideteksi menggunakan antibodi anti-tikus berlabel HRP. Sumur duplikat diukur pada pelat yang sama untuk setiap pengenceran. Nilai EC50 dihitung dengan penyesuaian tren sigmoid menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism.

Gambar 4 Imunogenisitas tgE dan rgE diuji pada tikus BALB/c 1 minggu setelah imunisasi tiga dosis. A, Produksi antibodi pada tikus untuk tgE dan rgE diformulasikan dengan bahan pembantu yang berbeda. B, Menetralkan titer antibodi pada tikus untuk tgE dan rgE yang diformulasikan dengan bahan pembantu yang berbeda. C dan D, Evaluasi respons IFN- dan IL-2 spesifik gE yang disebabkan oleh vaksin tgE atau rgE.

Gambar 5 Uji imunogenisitas vaksin tgE formulasi aluminium pada tikus BALB/c. A dan B, Persistensi antibodi dan respon antibodi penetralisir tgE/Al-001. Titer dipantau hingga 16 minggu. C, ED50 pada tikus untuk tgE dan vodka yang diformulasikan aluminium.

Evaluasi kandidat vaksin tgE Zoster dibandingkan dengan Shingrix

Untuk membandingkan imunogenisitas vaksin tgE kami dengan Shingrix, protein tgE terliofilisasi diformulasikan dengan bahan pembantu Shingrix, AS01B. Tikus C57BL/6 diimunisasi dengan dua dosis tgE/AS01B atau Shingrix secara intramuskular pada otot tibialis pada minggu ke 0 dan 4. Tingkat antibodi setelah imunisasi pertama menunjukkan bahwa imunisasi dengan Shingrix cukup untuk menginduksi antibodi anti-gE tingkat tinggi, jauh lebih tinggi dibandingkan yang dihasilkan oleh tgE/ AS01B; Namun setelah imunisasi kedua, tidak terdapat perbedaan produksi antibodi yang signifikan antara kedua kelompok (Gambar 6A). Mengenai tingkat antibodi penetralisir, imunisasi tgE/AS01B dosis tunggal menyebabkan produksi antibodi penetralisir dalam jumlah yang dapat diabaikan, jauh lebih rendah dibandingkan yang diproduksi oleh Shingrix. Namun, sekali lagi, setelah imunisasi booster, kami tidak melihat perbedaan yang signifikan dalam hal produksi antibodi penetral antara kedua kelompok (Gambar 6B). Untuk memverifikasi bagaimana imunisasi mempengaruhi CMI, kadar IFN-, dan IL-2 spesifik gE terdeteksi setelah imunisasi pertama dan kedua menggunakan uji enzim-linked immunosorbent spot (ELISPOT) dan pewarnaan sitokin intraseluler. Imunisasi tgE/AS01B menginduksi respon imun humoral yang buruk dibandingkan dengan dosis tunggal Shingrix tetapi menunjukkan potensi yang sebanding dalam hal menginduksi IFN- - dan IL-2-yang memproduksi splenosit (Gambar 6C). Memang benar, setelah imunisasi kedua, sejumlah besar sel penghasil sitokin spesifik gE terdeteksi pada kelompok tgE/AS01B dibandingkan dengan kelompok kontrol saline, yang juga sebanding atau lebih baik daripada kelompok Shingrix (Gambar 6D ). Hasil serupa diamati dalam analisis aliran sitometri, dengan pengamatan proporsi serupa dari IFN- -yang mengekspresikan sel CD4+ T (Gambar 6E), IL-2-yang mengekspresikan CD4+ T sel (Gambar 6F), dan sel T IFN- -CD8+ (Gambar 6G) antara tikus yang diimunisasi tgE/AS01B- dan Shingrixi, terlepas dari imunisasi dosis tunggal atau dosis tambahan. Hasil ini menunjukkan bahwa protein tgE yang berasal dari sistem ekspresi bakteri dapat menginduksi respon imun humoral dan seluler ketika diformulasikan dengan bahan pembantu yang tepat, dan dengan demikian dapat dianggap sebagai kandidat antigen untuk pembuatan vaksin melawan VZV.

Gambar 6 Imunogenisitas tgE pada tikus C57BL/6. Dosis 5 ug tgE yang diformulasikan dengan bahan pembantu 50 μL AS01B diberikan. Ini adalah 1/10 dosis vaksin Shingrix. Imunisasi dilakukan pada minggu ke 0 dan 4. A, Perbandingan produksi antibodi yang diinduksi oleh vaksin tgE/AS01B dibandingkan dengan Shingrix. Titer serum ditentukan dengan uji ELISA menggunakan pelat berlapis rgE. B, Perbandingan respon antibodi penetral terhadap vOka setelah vaksinasi dengan vaksin tgE/AS01B atau Shingrix. Titer netralisasi antiserum pada minggu ke 2 (panel kiri) dan minggu ke 6 (panel kanan) dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran serum yang menghasilkan penghambatan 50%. C, Evaluasi respons IFN- dan IL-2 spesifik gE yang diinduksi oleh vaksin tgE/AS01B atau Shingrix pada minggu ke-2. Jumlah splenosit yang memproduksi IFN- - dan IL-2-dihitung dari Uji ELISPOT setelah restimulasi dengan kumpulan peptida gE. D, Evaluasi respons IFN- dan IL-2 spesifik gE yang diinduksi oleh vaksin tgE/AS01B atau Shingrix pada minggu ke 8. Jumlah splenosit yang memproduksi IFN- - dan IL-2-dihitung dari Uji ELISPOT setelah restimulasi dengan kumpulan peptida gE. E – G, Uji aliran sitometri untuk sel CD4+ dan CD8+ yang mengekspresikan sitokin spesifik gE. Proporsi IFN- -yang memproduksi sel T CD4+, IL-2-yang memproduksi sel T CD4+, dan IFN- -yang memproduksi CD8+ T sel di antara splenosit ditentukan.

DISKUSI

VZV gE adalah target utama respon imun humoral dan seluler selama infeksi varicella alami dan setelah vaksinasi VZV Oka. Shingrix (GSK) adalah vaksin subunit rekombinan yang terdiri dari VZV gE yang diekspresikan dalam sel CHO dan bahan pembantu berbasis liposom AS01B. Penelitian lain telah dilakukan untuk menyelidiki vaksin subunit terhadap HZ menggunakan protein gE yang dihasilkan dari CHO atau sel serangga yang diformulasikan dengan bahan pembantu baru (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang dkk., 2021; Wui dkk., 2019; Wui dkk., 2021). Di sini, kami menyelidiki dan menunjukkan bahwa protein gE dapat diekspresikan secara larut dan dimurnikan dari E. coli, dan kemudian diformulasikan sebagai kandidat vaksin subunit dengan bahan pembantu yang sesuai untuk menghasilkan tidak hanya titer penetral yang kuat tetapi juga respons CMI yang kuat.

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

E. coli sebagai sistem ekspresi menawarkan beberapa keuntungan: laju pertumbuhan sel yang cepat, kondisi kultur yang murah, dan alat yang efisien dan serbaguna untuk memproduksi protein rekombinan. Penelitian antigen terkait virus herpes telah mencapai beberapa keberhasilan dengan menggunakan sistem ekspresi berbasis E. coli. Epitop linier penetral gE (aa 121–135) telah digabungkan dengan 149 aa protein inti virus hepatitis B (HBc) untuk menghasilkan VLP chimeric yang dapat menginduksi antibodi penetral spesifik VZV pada tikus (Zhu et al., 2016). Dalam penelitian lain, protein gE homolog dari virus Simian varicella (SVV) diekspresikan dalam E. coli menggunakan tag fusi GST untuk menghasilkan antiserum gE (Gray et al., 2001). Hingga saat ini, belum ada laporan mengenai protein VZV gE tanpa label fusi yang dimurnikan dari E. coli sebagai kandidat vaksin.

gE terdiri dari tiga wilayah: ektodomain hidrofilik 544-aa dengan peptida sinyal (aa 1–30), wilayah transmembran hidrofobik 17-aa, dan wilayah ekor sitoplasma 62-aa. Kami menyelidiki beberapa kandidat molekul dengan pemotongan berbeda di daerah terminal N atau C dari ektodomain gE dan menemukan bahwa ekspresi eksogen protein ini dalam E. coli paling baik menggunakan bagian yang terpotong (data tidak ditampilkan). Ektodomain gE utuh tanpa tag fusi cenderung membentuk badan inklusi ketika diekspresikan oleh E. coli dan sulit untuk dimurnikan. Di antara kandidat pemotongan yang diuji, protein gE (aa 31–358) menunjukkan ekspresi kelarutan yang tinggi dengan sedikit kesulitan dalam pemurniannya, serta kemurnian tinggi dan homogenitas tinggi (Gambar 1). Oleh karena itu, konstruksi pemotongan ini dianggap sebagai kandidat vaksin yang ideal antigen. Strategi pemotongan ini mungkin mempunyai dampak potensial pada sifat-sifat protein, khususnya antigenisitasnya. Kami sebelumnya telah mengekspresikan gE rekombinan dalam sel serangga dan memurnikan konstruksi ini untuk mengimunisasi tikus BALB/c, memperoleh 70 gE antibodi monoklonal untuk analisis epitop (Liu et al., 2015). Melalui analisis kami, kami mengidentifikasi aa 1–194 sebagai wilayah imunodominan (data tidak ditampilkan). Hasil serupa diperoleh di tempat lain, dengan mAb spesifik gE menunjuk ke wilayah 109–123 dan 160–316 sebagai wilayah yang bertanggung jawab atas pengikatan antibodi stabil di antara varian isolat (Vafai, 1994). Dalam penelitian lain, dengan menggunakan fragmen-VLP gE hibrid rekombinan, penulis mengidentifikasi residu 1–134 sebagai daerah paling antigenik dari protein gE dan menunjukkan bahwa terminal C gE (residu 303–623) yang mengandung beberapa residu sistein gagal menghasilkan partikel. dalam ragi (Fowler et al., 1995), menyarankan bahwa ekspresi gE yang heterolog harus mempertimbangkan tidak hanya antigenisitas tetapi juga kemudahan ekspresi. Di sini, kami mengoptimalkan panjang protein gE untuk ekspresi larutnya yang efisien dengan penurunan antigenisitas yang minimal. TgE menunjukkan reaktivitas serupa dengan sebagian besar antibodi pada Gambar 3 seperti halnya rgE yang diproduksi dalam sel serangga, menunjukkan bahwa epitop kunci terawetkan dengan baik dalam protein tgE yang dimurnikan dari E. coli. Namun, sebuah penelitian menunjukkan bahwa epitop sel T CD4+ imundominan yang dikenali oleh donor vaksin Shingrix tersebar di seluruh protein gE (Voic et al., 2020). Imunogenisitas tgE dalam penelitian kami identik dengan yang ditemukan untuk gE yang berasal dari sel CHO di Shingrix ketika antigen dikombinasikan dengan bahan pembantu AS01B, dengan respons humoral dan respons CMI yang sama efisiennya, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5. Hasil ini menunjukkan bahwa gE terpotong berasal dari sistem prokariotik sama baiknya dengan ektodomain gE utuh dari sistem eukariotik dalam hal antigenisitas.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Ada perbedaan besar antara protein gE yang berasal dari sistem ekspresi berbeda. Perbedaan paling menonjol terlihat pada modifikasi pascatranslasional, khususnya glikosilasi. Glikan terkait-O dari glikoprotein membran memiliki relevansi dalam hal pengenalan sel T dan antibodi terhadap epitop glikopeptida virus, dan pengenalan ini memiliki potensi signifikansi biomedis yang tinggi dalam upaya kami untuk memediasi perlindungan kekebalan terhadap virus menggunakan vaksin subunit. Penghapusan glikans dalam gE yang diproduksi dalam sel CHO-K1 menghasilkan penurunan reaktivitas sebesar 17% dengan serum VZV-positif. Sebaliknya, O-glikosilasi dapat mengganggu imunoreaktivitas epitop sel B: beberapa epitop penting dihambat oleh glikan terkait-O tambahan (Nordén et al., 2019). Dalam penelitian kami, tgE yang dihasilkan dari E. coli tampaknya berperilaku sama baiknya dengan rgE yang berasal dari sel serangga dalam hal imunoreaktivitas dan imunogenisitasnya, menunjukkan bahwa protein tgE "telanjang" menjanjikan sebagai kandidat vaksin. Vaksin dengan tgE sebagai antigen cenderung menginduksi tidak hanya titer IgG yang tinggi, yang menunjukkan potensinya sebagai vaksin varicella subunit tanpa potensi risiko latensi virus, namun juga CMI yang tinggi, yang menunjukkan potensinya sebagai vaksin zoster. Secara keseluruhan, antigen gE yang berasal dari sistem ekspresi bakteri dalam penelitian ini menawarkan strategi yang jauh lebih ekonomis untuk pengembangan vaksin VZV.

Referensi

Adkins, JC, dan Wagstaff, AJ (1998). Vaksin hepatitis B rekombinan: tinjauan imunogenisitas dan kemanjuran perlindungannya terhadap hepatitis B. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Imunitas seluler terhadap virus varicella-zoster. J Menginfeksi Dis 166, S35–S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N., dan Liu, C. (2021). Imunogenisitas glikoprotein E virus varicella-zoster yang diformulasikan dengan nanopartikel lipid dan imunostimulator nukleat pada tikus. Vaksin 9, 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T., dan Xia, N. (2014). Pengembangan uji netralisasi virus varicella-zoster menggunakan uji spot imunosorben terkait-enzim antibodi glikoprotein K. J Metode Virol 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Praktek klinis: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255– 263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S., dan Giannini, SL (2012). Respon imun yang dimediasi sel terhadap vaksin glikoprotein E virus varicella-zoster menggunakan agonis TLR dan QS21 pada tikus. Vaksin 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ, dan Layton, GT (1995). Identifikasi daerah imunodominan dan epitop sel B linier dari protein selubung gE virus varicella-zoster. Virologi 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA, dan Sharrar, RG (2008). Profil keamanan vaksin varicella: tinjauan 10-tahun. J Menginfeksi Dis 197, S165–S169.

Gray, WL, Mullis, LB, dan Soike, KF (2001). Ekspresi glikoprotein virus varicella Simian E. Virus Res 79, 27–37.

Heininger, U., dan Seward, JF (2006). Varisela. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG, dan Lee, GM (2012). Sel CHO dalam bioteknologi untuk produksi protein rekombinan: keadaan saat ini dan potensi lebih lanjut. Aplikasi Mikrobiol Bioteknologi 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., dkk. (2015). Kemanjuran vaksin subunit herpes zoster adjuvan pada orang dewasa yang lebih tua. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H., dan Nam, JH (2020). Evaluasi subunit glikoprotein E dan vaksin virus varicella-zoster hidup yang dilemahkan yang diformulasikan dengan bahan pembantu berbasis RNA untai tunggal. Peradangan Imun Dis 8, 216–227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., dkk. (2015). Uji kuantitatif glikoprotein E VZV berbasis antibodi monoklonal dan penerapannya pada kuantisasi antigen dalam vaksin VZV. Aplikasi Mikrobiol Bioteknologi 99, 4845– 4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K., dan Liu, C. (2022a). Nanopartikel lipid yang dapat terionisasi meningkatkan efek adjuvan sinergis dari CpG ODNs dan QS21 dalam vaksin subunit glikoprotein E virus varicella-zoster. Farmasi 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K., dan Liu, C. (2022b). Glikoprotein E virus varicella-zoster yang diberi adjuvan LNP-CpG ODN menginduksi tingkat kekebalan yang sebanding dengan Shingrix™ pada tikus dengan prima VZV. Virol Dosa 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R., dan Wu, TC (2008). Cervarix: vaksin untuk pencegahan HPV 16, 18-yang berhubungan dengan kanker serviks. Biologis 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S., dan Bergström, T. (2019). Glikoprotein E rekombinan dari virus varicella-zoster mengandung motif glikan-peptida yang memodulasi epitop sel B menjadi tanda imunologis tersendiri. Int J Mol Sci 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E., dan Arvin, AM (2016). Glikoprotein virus varicella-zoster: masuk, replikasi, dan patogenesis. Rep Mikrobiol Curr Clin 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Produksi protein rekombinan pada inang bakteri. Penemuan Narkoba Hari Ini 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE, dkk. (2005). Vaksin untuk mencegah herpes zoster dan neuralgia postherpetik pada orang dewasa lanjut usia. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannunu, CE, Patel, RR, Mui, UN, dan Tyring, SK (2019). Shingrix untuk herpes zoster: ulasan. Terapi Kulit Lett 24, 5–7. Singh, SM, dan Panda, AK (2005). Pelarutan dan pelipatan kembali protein tubuh inklusi bakteri. J Biosci Bioeng 99, 303–310.

Syed, YY (2018). Vaksin zoster rekombinan (Shingrix®): tinjauan pada herpes zoster. Narkoba Berusia 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T., dan Isomura, S. (1974). Vaksin hidup digunakan untuk mencegah penyebaran varicella pada anak-anak di rumah sakit. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS, dan Jacobsen, SJ (2011). Vaksinasi herpes zoster pada orang dewasa lanjut usia dan risiko penyakit herpes zoster berikutnya. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Situs pengikatan antibodi pada bentuk terpotong glikoprotein virus varicella zoster gpI(gE). Vaksin 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., dkk. (2020). Identifikasi dan karakterisasi epitop sel CD4+ T setelah vaksinasi Shingrix. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H., dan Liu, C. (2021). Respon imun terhadap virus varicella-zoster glikoprotein E yang diformulasikan dengan nanopartikel poli(asam laktat-koglikolat) dan bahan pembantu asam nukleat pada tikus. Virol Dosa 36, ​​122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS, dan Zhao, Q. (2012). Pengembangan vaksin Hepatitis E: pengembaraan 14-setahun. Imun Vaksin Hum 8, 823–827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ, dkk. (2019). Induksi yang efisien dari imunitas yang diperantarai sel terhadap virus varicella-zoster glikoprotein E yang diliofilisasi dengan bahan pembantu berbasis liposom kationik pada tikus. Vaksin 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H., dan Lee, NG (2021). Pengaruh agonis TLR4/bahan pembantu liposom kationik pada kemanjuran vaksin glikoprotein E virus varicella-zoster: presentasi antigen, serapan, dan pengiriman ke kelenjar getah bening. Farmasi 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL, dan Arvin, AM (2014). Mekanisme molekuler patogenesis virus varicella zoster. Nat Rev Mikrobiol 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T., dan Xia, N. (2016). Kandidat vaksin epitop yang sangat terpelihara terhadap virus varicella-zoster menginduksi antibodi penawar pada tikus. Vaksin 34, 1589–1596.