Meningkatkan Proteomik Top-Down Jaringan Otak Dengan FAIMS Bagian 2

Analisis Data

Identifikasi proteoform dilakukan dengan TopPIC versi 1.3.53 Pengaturan untuk TopPIC mencakup jendela prekursor 3 m/z (untuk memperhitungkan selubung isotop), toleransi kesalahan massa 15 ppm, pergeseran massa maks/mnt yang tidak diketahui sebesar 500 Da, dan maksimum jumlah modifikasi tidak diketahui yang diizinkan sebesar 1.

Dalam beberapa tahun terakhir, semakin banyak penelitian yang menunjukkan bahwa terdapat hubungan erat antara morfologi protein dan memori. Protein merupakan molekul paling dasar dalam aktivitas kehidupan. Mereka mampu mengontrol aktivitas vital sel dan menjaga fungsi normal tubuh manusia. Penelitian menemukan bahwa morfologi protein tidak hanya berperan penting dalam aktivitas kehidupan sel tetapi juga memiliki hubungan yang tidak terpisahkan dengan fungsi memori di otak. Begitu morfologi protein berubah maka akan mempengaruhi hubungan antar neuron sehingga mempengaruhi kemampuan memori seseorang.

Pada tahap awal kehidupan, perubahan morfologi protein berperan penting dalam perkembangan dan fungsi otak. Jika morfologi protein tidak sebagaimana mestinya maka akan menimbulkan serangkaian masalah neurologis yang pada akhirnya menyebabkan hilangnya memori, gangguan kognitif, dan sebagainya.

Namun, tidak perlu khawatir. Teknologi medis modern telah memungkinkan orang untuk menyesuaikan morfologi protein melalui pola makan untuk meningkatkan daya ingat mereka. Pola makan yang kaya dan bervariasi memang kaya akan protein, namun dalam memilih protein, usahakan untuk memilih makanan yang rendah lemak, rendah kolesterol, dan rendah karbohidrat untuk menghindari dampak buruk dari asupan berlebihan pada tubuh.

Singkatnya, morfologi protein dan memori tidak dapat dipisahkan. Kita harus memperhatikan pola makan yang sehat dan asupan protein yang seimbang untuk menjaga kesehatan sekaligus menjaga daya ingat yang baik. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena memiliki efek antioksidan, anti-inflamasi, dan anti-penuaan, yang dapat membantu mengurangi reaksi oksidasi dan inflamasi di otak, sehingga melindungi kesehatan otak. sistem saraf. Selain itu, Cistanche juga dapat mendorong pertumbuhan dan perbaikan sel saraf, sehingga meningkatkan konektivitas dan fungsi jaringan saraf. Efek tersebut dapat membantu meningkatkan daya ingat, kemampuan belajar, dan kecepatan berpikir, serta dapat mencegah terjadinya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik Tahu untuk meningkatkan memori jangka pendek

Spektrum MS2 dicari berdasarkan database yang digabungkan dengan entri dari Homo sapiens Swiss-Prot (20.352), varian splice Swiss-Prot (22,000), dan TrEMBL (54.436), serta kontaminan umum. Proteoform yang teridentifikasi disaring ke tingkat penemuan palsu (FDR) sebesar 1% melalui TopPIC.

Analisis data hilir dilakukan di lingkungan R untuk komputasi statistik dan pembuatan angka.54 Dalam analisis hilir, proteoform dari gen yang sama dengan asam amino awal dan akhir yang sama yang ditemukan berada dalam kisaran ±5 Da digabungkan sebagai proteoform tunggal untuk meningkatkan keketatan. dari tugas kami.

Meskipun ambang batas 5Da bersifat arbitrer, pendekatan ini mengkompensasi kesalahan penetapan puncak monoisotop, ambiguitas dalam pergeseran massa yang tidak diketahui, dan penyimpangan artefaktual lainnya. Untuk menentukan deviasi standar relatif (RSD) proteoform dalam ulangan, kami menggunakan keluaran "intensitas fitur" dari TopPIC.

Peta cakupan urutan fragmentasi dan spektrum terkait dihasilkan menggunakan perangkat lunak LCMsSpectator.55

Pengaturan khusus untukLCMsSpectator mencakup toleransi ion prekursor sebesar 10 ppm, toleransi produksi sebesar10 ppm, ambang batas S/N minimum sebesar 1,5, ambang batas korelasi Pearson sebesar 0,7, penghalusan default sebesar 9 poin, dan ambang intensitas relatif isotop prekursor 0,1.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penambahan FAIMS Secara Kuat Meningkatkan Cakupan Proteom

Sampel jaringan korteks dari pasien yang didiagnosis dengan Alzheimer diproses mengikuti alur kerja, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Pertama-tama kami berupaya menganalisis kinerja FAIMS pada berbagai CV dibandingkan dengan CV tanpa FAIMS (disebut sebagai "Tanpa FAIMS").

Perlu diingat bahwa antarmuka FAIMS menghasilkan sedikit kehilangan transmisi ion, mungkin karena jalur ion yang lebih panjang melalui sumbernya.56 Oleh karena itu, untuk lebih mewakili kondisi umum dan memastikan perbandingan yang adil, data "Tanpa FAIMS" dikumpulkan menggunakan sampel yang sama tanpa unit FAIMS terpasang.

Data "Tanpa FAIMS" ini dikumpulkan dalam rangkap tiga dan dianalisis sesuai dengan alur kerja, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1 dengan analisis 6 DDA MS2 teratas. Kumpulan data "Tanpa FAIMS" rata-rata mengidentifikasi 754 ± 35 proteoform (Gambar 2A dan Tabel S1) dan secara kolektif mengidentifikasi 1073 proteoform unik (tidak berlebihan) (Gambar 2B) yang berasal dari 293 gen unik (Gambar 2C), mencakup 29.359 asam amino di seluruh proteom (Gambar 2D).

Metrik "cakupan proteom" (Gambar 2D) didefinisikan sebagai asam amino non-redundan yang dicakup oleh setiap rangkaian proteoform. Pada dasarnya, metrik ini memperhitungkan panjang dan keragaman proteoform yang teridentifikasi.

Kami menganggap ini sebagai metrik yang lebih seimbang dibandingkan dengan jumlah proteoform dan gen mentah karena metrik ini menghindari bias terhadap proteoform yang lebih kecil. Meskipun penghitungan sederhana proteoform atau gen bersifat intuitif, metrik ini tampaknya sangat dipengaruhi oleh fragmen proteolitik pendek. Kumpulan data FAIMS dikumpulkan dari −50 hingga −20 CV yang dipindai dalam langkah 5 V.

Masing-masing dari 7 CV yang dihasilkan dikumpulkan rangkap tiga. Mengenai proteoform dan gen, FAIMS mengungguli "Tanpa FAIMS" untuk semua CV yang diuji dalam rentang CV −50 hingga −30 (Gambar 2A – C).

Misalnya, tiga kumpulan data pada −50 CV mengidentifikasi 1833 ± 17proteoform, peningkatan rata-rata ∼140% per proses dibandingkan dengan "Tanpa FAIMS". Secara kolektif, ketiga kumpulan data pada −50 CV ini mengidentifikasi 2.564 proteoform unik dari 530 gen unik yang mencakup total 43.437 asam amino, masing-masing meningkat sebesar 95, 69, dan 69% dibandingkan tiga kumpulan data "NoFAIMS" (Gambar 2B – D dan Tabel S1).

Selain itu, meskipun FAIMS pada −25V mengamati lebih sedikit proteoform dan gen unik dibandingkan dengan "Tanpa FAIMS", proteoform itu sendiri rata-rata lebih panjang. Jadi, ketika mempertimbangkan panjang proteoform, (Gambar 2D), kumpulan data −25 V mencakup jumlah asam amino dari proteom yang hampir sama banyaknya (28.398) dibandingkan dengan "Tanpa FAIMS" (29.359), sehingga hanya mencakup separuh jumlah proteoform (Gambar 2B ).

Kami juga menyelidiki apakah FAIMS dapat memberikan analisis yang kuat dan dapat direproduksi dibandingkan tanpa FAIMS. Kami menilai reproduktifitas kuantifikasi dengan menghitung RSD (setara dengan koefisien variasi) dari intensitas fitur masing-masing proteoform, asalkan proteoform memenuhi kriteria untuk diamati di ketiga set data replikasi untuk setiap pengaturan CV.

Karena kumpulan data FAIMS dan "Tanpa FAIMS" semuanya dikumpulkan dari satu sampel biologis, perbedaan di antara ulangan harus secara eksklusif dikaitkan dengan faktor-faktor instrumental.

Plot kotak pada Gambar 3 (serta histogram individual pada Gambar S1) menunjukkan bagaimana distribusi RSD dibandingkan antara kumpulan data FAIMS dan "Tanpa FAIMS".

Berdasarkan median RSD, penambahan FAIMS menghasilkan kualitas kuantifikasi yang serupa atau sedikit lebih baik dibandingkan dengan "Tanpa FAIMS". Peningkatan RSD di antara tegangan rendah (−20 hingga −30 CV) mungkin terkait dengan pengamatan bahwa lebih sedikit proteoform yang ditransmisikan dalam rentang tersebut, memberikan spektrum MS1 berkualitas lebih tinggi dan oleh karena itu estimasi intensitas fitur lebih baik.

Selain itu, perlu dicatat bahwa RSD yang ditentukan dari ulangan ini serupa dengan eksperimen top-down55 dan bottom-up57,58 sebelumnya yang dilakukan dengan instrumentasi serupa.

Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa penambahan FAIMS ke TDP secara kuat meningkatkan identifikasi proteoform, tanpa mengorbankan kualitas kuantifikasi.

Kami selanjutnya menyelidiki tumpang tindih dalam identifikasi antar CV, yang dapat memberikan kumpulan observasi non-redundan terbesar.

Dengan menggunakan koefisien tumpang tindih, yang didefinisikan sebagai perpotongan antara dua kumpulan dibagi dengan yang lebih kecil dari kedua kumpulan tersebut, kami menentukan kesamaan antara setiap kumpulan data. Koefisien tumpang tindih rata-rata keseluruhan untuk identifikasi gen proteoform dan dalam setiap CV FAIMS adalah 0,76.

Hal ini sebanding dengan koefisien tumpang tindih dari kumpulan data "Tanpa FAIMS" (0.77), yang menunjukkan bahwa replikasi teknis menunjukkan reproduktifitas yang serupa. Peta panas yang menampilkan koefisien tumpang tindih proteoform dan gen FAIMS masing-masing ditunjukkan pada Gambar 4 dan S2.

Khususnya, tumpang tindih identifikasi gen di seluruh ruang CV jauh lebih besar dibandingkan dengan proteoform, meskipun hal ini terutama terlihat ketika membandingkan jarak CV terpanjang.

Misalnya, tumpang tindih antara CV −50 dan −20 adalah 0,64 pada tingkat gen dan 0,06 pada tingkat proteoform. Hal ini diharapkan karena setiap gen berpotensi diwakili oleh banyak proteoform.

Gambar 4 menunjukkan bahwa meskipun perbedaan CV sebesar 5−10 V menghasilkan koefisien tumpang tindih sebagian besar di atas 0,5, jarak yang lebih besar dari 15 V menghasilkan derajat ketidaksamaan yang lebih besar dan oleh karena itu jaraknya lebih baik untuk menangkap kumpulan proteoform yang cukup berbeda.

Dengan kumpulan data ini, kami selanjutnya menentukan kombinasi CV mana yang optimal untuk mencapai identifikasi gen maksimal, identifikasi proteoform, dan cakupan urutan dengan batasan jumlah CV untuk setiap kombinasi.

Pertama, kami menetapkan kombinasi optimal untuk sejumlah CV dari 1 hingga 7 menggunakan metrik cakupan proteoform, gen, dan urutan proteom yang unik (Gambar 5).

Menggunakan kombinasi terbatas pada tiga CV sebagai contoh, Gambar 5A, B merinci bagaimana −35, −40, dan −50 V ideal jika seseorang ingin memaksimalkan jumlah proteoform atau gen.

Proteoform dan gen yang diidentifikasi dalam tiga CV ini (sembilan kumpulan data) mencakup 84% dari total proteoform unik dan 92% dari total gen pada keseluruhan kumpulan 21 kumpulan data.

Saat menimbang panjang proteoform dengan cakupan urutan sebagai metrik, kombinasi ideal adalah pada −30, −40, dan −50 CV, mencakup 88% asam amino unik dari seluruh 21 kumpulan data FAIMS dengan hanya sedikit kehilangan proteoform dan identifikasi gen ( 4221 proteoform dan 723 gen, Gambar 5C). Namun, kombinasi ini mencakup semua ulangan dan mewakili identifikasi maksimum yang dapat dicapai untuk kombinasi CV tertentu. Oleh karena itu, untuk mendemonstrasikan keuntungan dari langkah CV eksternal, kami memutuskan untuk menyelidiki berapa angka rata-rata yang dapat dicapai secara wajar hanya dengan tiga kali proses, dimana setiap proses merupakan CV yang berbeda.

Dengan menggunakan kumpulan data −50, −40, dan −30 V sebagai contoh, kami menentukan rata-rata proteoform unik, gen unik, dan cakupan urutan proteom berdasarkan 27 kombinasi unik dari tiga ulangan berbeda dalam setiap CV.

Berdasarkan analisis ini, kita dapat mencapai 2986 (±46) proteoform unik dan 618 (±12) gen unik yang mencakup rata-rata 64.534 (±1089) asam amino. Dibandingkan dengan kumpulan data rangkap tiga "Tanpa FAIMS", yang mengidentifikasi 1.073 proteoform unik dan 293 gen unik yang mencakup 29.359 asam amino, CV eksternal yang melangkah pada −50, −40, dan −30 V bisa lebih dari dua kali lipat setiap metrik.

Namun demikian, kombinasi CV yang optimal kemungkinan besar juga akan bergantung pada organisme dan jaringan asal sampel, langkah-langkah persiapan sampel yang diterapkan, serta fraksinasi offline tambahan yang diterapkan sebelum analisis LC-MS.

Secara keseluruhan, ketika digabungkan dengan analisis tumpang tindih (Gambar 4), menunjukkan bahwa jarak 15 V atau lebih besar antar CV memberikan jumlah tumpang tindih paling sedikit antar proteoform, sedangkan pemisahan 5−10 V dalam CV −50 hingga −30 memaksimalkan gen, proteoform, dan proteom. cakupan urutan.

Untuk menentukan lebih lanjut dampak FAIMS pada kedalaman cakupan proteom, kami membandingkan gen yang diidentifikasi dari kumpulan data top-down kami dengan analisis bottom-up pada otak manusia.

Kumpulan data bottom-up yang komprehensif dari jaringan otak manusia memungkinkan kami memperkirakan kelimpahan 8.528 protein menggunakan penghitungan spektral tertimbang.59–61 Protein digabungkan ke dalam 10 persentil kelimpahan yang berbeda berdasarkan jumlah spektral yang dikumpulkan dari beberapa kumpulan data bottom-up otak manusia.

Dengan melakukan referensi silang dengan kumpulan data top-down kami, kami dapat menentukan dari mana gen dan proteoform berasal dan memberi peringkat berdasarkan perkiraan kelimpahan protein (menggunakan jumlah spektral yang dinormalisasi kumpulan data) di otak manusia (Gambar 6).

Gen yang ditemukan dalam analisis top-down kami tetapi bukan kumpulan referensi bottom-up akan dibuang sebagai "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com