Pengaruh Cistanche Obat Ramuan Cina pada Perkembangan Embrio-Jin Di Dini
Mar 08, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*
[Abstrak]Gunakan babiembriodari fertilisasi in vitro untuk penelitian dan perbandingan. Efek menambahkanCinaobat-obatanbahanBentengdan Astragalus untuk pengembanganembrio awaldalam media NCSU{{0}} terbukti. Percobaan membuktikan bahwa: (1) Perbandingan volume 0,10 persenBentengdan 0.10 persen Astragalus ditambahkan ke kaldu kultur, danBentengkelompok tambahan Tingkat blastokista (15,76 persen) secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kosong (9,26 persen) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), menunjukkan bahwaBentengdeserticoladapat secara signifikan mempromosikanembrio awalperkembangan. (2) Ketika konsentrasi (V/V) dariBentengadalah {{0}}.05 persen dan 0,10 persen , laju blastokista (17,02 persen dan 16,75 persen ) secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kosong (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">Cinaobat-obatanBentengdalam media kultur pada 2-tahap sel, tingkat perkembangan blastokista (13,81 persen ) secara signifikan lebih tinggi daripada pada 4-tahap sel (7,53 persen ) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Bentengbefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
Karena perbedaan dalam lingkungan perkembangan in vivo dan in vitro,embrioakan dirusak oleh radikal bebas selama kultur in vitro babi awalembrio, menyebabkan gangguan metabolisme sel, atau kerusakan DNA, RNA, dan protein [1]. Untuk lebih meningkatkan laju perkembangan fertilisasi in vitro dengan semen beku, percobaan ini mengeksplorasi penambahan konsentrasi tertentu dariBentengdan Astragalus untuk meningkatkanembriolingkungan pengembangan secara in vitro.
1. Bahan dan metode
1. 1 Kondisi budaya:
Pematangan in vitro oosit babi, fertilisasi in vitro, dan kultur in vitro embrio awal semuanya dilakukan dalam inkubator dengan 5 persen CO2 dan kelembaban jenuh maksimum 39 derajat .
1.2 Reagen dan media kultur:
Cairan dasar pematangan oosit adalah NCSU{{0}}, cairan pencuci oosit adalah cairan PVA-TL-HEPES, cairan pembuahan adalah buffer Tris (mTBM) yang mengandung 0.1 persen BSA, dan cairan pencuci sperma adalah Dubecco dengan 0.1 persen BSA. Phosphate buffered saline (DPBS), cairan thawing sperma adalah BTS, cairan cumulus adalah 1 mg/mL hyaluronidase PBS, cairan operasi oosit adalah NCSU buffer HEPES-23, dan cairan kultur dasar embrio awal dilengkapi dengan 0 0,4 persen BSA NCSU-23, tambahkan (V/V) 0,05 persen ~0,15 persen Cistanche sesuai kebutuhan, gunakan BTS untuk mencairkan semen. Sebelum digunakan, panaskan dan seimbangkan selama lebih dari 4 jam dalam inkubator yang mengandung 5 persen udara CO2 dan kelembaban jenuh maksimum 39 derajat [2].
1.3 Metode perebusan Cistanche pengobatan Cina:
Larutan Cistanche: Ambil 5 g dan masukkan ke dalam gelas kimia 100 ml, tambahkan air ultra murni dan rendam dalam air ultra murni, rebus dengan api besar, dan biarkan mendidih selama 20 menit, lalu kumpulkan Sup; ulangi proses di atas, kumpulkan 3 kali berturut-turut, volume konstan hingga 100 mL, filter cadangan 0,22 m. Larutan Astragalus: Ambil 5 g dan masukkan ke dalam gelas kimia 100 ml, tambahkan air ultra murni dan rendam, rebus dengan api besar, dan biarkan mendidih selama 20 menit, lalu kumpulkan sup obat; ulangi proses di atas, kumpulkan 3 kali berturut-turut, atur volume menjadi 100 mL, saring cadangan 0,22 m.
Pengobatan CinaHerbal:Benteng
1.4 Pematangan in vitro oosit babi:
Ovarium induk babi dikumpulkan dari Rumah Pemotongan Makanan Pengcheng Beijing, ditempatkan di 0,9 persen salin normal yang mengandung antibiotik pada suhu sekitar 38 derajat , diangkut kembali ke laboratorium dalam waktu 4 jam, dan dicuci dengan salin normal tiga kali. Gunakan spuit 10 mL dengan jarum pengukur 12-untuk mengekstrak oosit dengan folikel berdiameter 2-6 mm pada permukaan ovarium. Cuci 3~4 kali dalam larutan TL-HEPES dan 3~4 kali dalam NCSU-23 yang telah diseimbangkan dalam inkubator karbon dioksida selama lebih dari 4 jam. Pindahkan 20~30 oosit sebagai satu kelompok ke 100 L, tambahkan 10 persen PFF, 10 IU/mL HCG, 10 IU/mL PMSG, 10 ng/mL EGF NCSU-23 tetesan dan kultur selama sekitar 22 jam , Ubah medium hingga tetesan NCSU-23 dengan 10 persen PFF, 10 ng/mL EGF dan lanjutkan kultur selama 44~46 jam[3].
1.5 Kapasitasi sperma dan fertilisasi in vitro:
Siapkan larutan mTBM tanpa kafein dan BSA dan seimbangkan selama 48 jam dalam inkubator dengan 5 persen CO2 dan kelembaban jenuh maksimum 39 derajat , sesuaikan nilai pH dalam kisaran 7,2~7,8; tambahkan kafein dan BSA 44 jam sebelum digunakan, dan teruskan keseimbangan. Semen diuji kualitasnya, dan 10 mL disentrifugasi pada 900 putaran/menit selama 3 menit, 10 mL larutan DPBS yang mengandung 0,1 persen BSA ditambahkan untuk suspensi, dan disentrifugasi pada 900 putaran/menit selama 3 menit [3]; setelah 1 mL larutan TBM disuspensikan, dimiringkan 60 derajat Perlakuan pemanenan energi hulu dilakukan dalam inkubator dengan 5 persen udara CO2 dan kelembaban jenuh maksimum 39 derajat selama 1 jam[3~5]. Kompleks sel oosit-kumulus yang matang hingga 44~46 ditempatkan dalam larutan pencuci oosit yang mengandung 0,1 persen hyaluronidase, dan sel-sel kumulus dikeluarkan dengan pipet, dan kemudian oosit diekspos. Cuci 3 kali dalam TBM seimbang, dan terakhir masukkan masing-masing 10-15 potongan dalam kelompok 50 L TBM, dan tunggu sperma [6, 7]. Suntikkan 50 L semen hulu dari kapasitasi ke dalam tetesan oosit yang mengandung TBM, dan lakukan pembuahan selama 6 jam dalam inkubator dengan 5 persen CO2 dan kelembaban jenuh maksimum 39 derajat .
1.6 Perkembangan dini dan deteksi telur yang telah dibuahi:
Setelah 6 jam pembuahan, oosit diperlakukan dengan NCSU-23 buffer dengan cairan operasi HEPES atau NCSU- 23 dengan 0,4 persen BSA dalam cairan kultur embrio. 23 Bilas 3 kali, ganti media dengan tetesan 0.4 persen BSA NCSU-23 yang seimbang dan inkubasi selama lebih dari 8 hari. Periksa kecepatan pemecahan telur hipotetis yang dibuahi pada hari ke-2, periksa laju morula ( ditambah laju blastokista) pada hari ke-6, dan periksa laju blastokista pada hari ke-8 [8]. Semua diperiksa dan direkam di bawah cermin tubuh.
1.7 Desain eksperimental:
1.7.1 Pengaruh ramuan obat tradisional Cina Cistanche pada perkembangan embrio awal.
Babi Wuzhishan[8] Setelah kapasitasi, fertilisasi in vitro, pembuahan selesai, dan setelah pembelahan terjadi, embrio dipertukarkan sampai ditambahkan 0.1 persen (V/V). Cistanche, 0.1 persen astragalus, dan NCSU-23 (0.4 persen BSA) tanpa bahan penting (kelompok kosong) dibudidayakan untuk mengamati perkembangan telur yang dibuahi dan embrio awal , dan menilai efek dari dua komponen pengobatan tradisional Tiongkok pada Pengaruh perkembangan embrio in vitro awal.
1.7.2 Pengaruh konsentrasi Cistanche pada perkembangan awal embrio.
Semen babi Wuzhishan dikapasitaskan dan menjalani fertilisasi in vitro. Setelah pembuahan selesai, cairan diubah menjadi {{0}} persen (kelompok kosong), 0.05 persen , 0.1 persen , dan 0,1 persen, masing-masing. Dalam 15 persen Cistanche NCSU-23 (0,4 persen BSA), amati perkembangan telur yang dibuahi dan nilai pengaruh berbagai konsentrasi komponen obat Cina Cistanche pada perkembangan embrio in vitro awal.
1.7.3 Pengaruh periode penambahan Cistanche pada perkembangan embrio awal.
Semen babi Wuzhishan adalah kapasitasi dan mengalami fertilisasi in vitro. Setelah akhir pembuahan, sel telur yang dibuahi membelah ke {{0}}tahap sel, dan telur yang dibuahi membelah ke 4-tahap sel, cairan dipertukarkan dan ditambahkan secara terpisah. 0.1 persen Cistanche NCSU-23 (0,4 persen BSA), mengamati perkembangan telur yang dibuahi dan menilai pengaruh penambahan cistanche pada perkembangan embrio in vitro awal pada tahap yang berbeda.
1.8 Analisis statistik:
Gunakan SPSS13.0 uji chi-square (χ2) dan analisis varians satu arah.
2. Hasil analisis
2. 1 Pengaruh ramuan obat tradisional Tiongkok pada perkembangan embrio awal
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>{}.05). Laju blastokista kedua kelompok lebih tinggi daripada kelompok blangko, dan laju blastokista kelompok Cistanche berbeda dengan kelompok blangko. Signifikan (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 Pengaruh konsentrasi ramuan obat Cina Cistanche pada perkembangan embrio awal
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, penambahan Cistanche pada konsentrasi volume 0.05 persen hingga 0,10 persen dalam cairan kultur embrio memiliki efek promosi yang lebih baik pada cairan sperma beku WZSP embrio fertilisasi in vitro , dan laju perkembangan blastokista berbeda secara signifikan dari kelompok kosong (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 Pengaruh penambahan periode Cistanche ramuan obat Cina pada perkembangan embrio awal
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>{}.05). Namun terdapat perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan penambahan 4 sel (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Diskusi
Dibandingkan dengan perkembangan normalembrioin vivo, lingkungan perkembangan IVF dibuahiembrioberbeda secara signifikan. Selama prosesembriopertumbuhan dan pembelahan, sejumlah besar No., radikal bebas, dan beberapa zat beracun diproduksi, yang tidak menguntungkan untuk pertumbuhan embrio. Embrio yang berkembang secara normal di dalam tubuh dapat menghilangkan faktor-faktor yang tidak menguntungkan ini melalui metabolisme lingkungan internal; faktor-faktor yang tidak menguntungkan ini akan selalu terakumulasi dalam lingkungan pertumbuhan embrio fertilisasi in vitro. TradisionalCinaobat-obatanbahanBentengmungkin memiliki fungsi mengurangi konsentrasi dan menghilangkan radikal bebas tertentu, untuk lebih meningkatkan laju perkembangan fertilisasi in vitro oleh semen beku. Eksperimen mengeksplorasi menambahkan konsentrasi tertentu dariBentengdan Astragalus. Hasilnya menegaskan bahwa Astragalus tidak memiliki efek yang efektif dalam meningkatkan lingkungan kultur in vitro. Konsentrasi yang tepat dariBentengmemiliki efek promosi tertentu padaembrio awalperkembangannya, tetapi ketika konsentrasiBentengmelebihi konsentrasi tertentu, ia juga memiliki efek penghambatan padaembrioperkembangan.
Kami lebih jauh mengeksplorasi efek yang berbeda dariBenteng, tradisionalCinaobat-obatankomponen, pada berbagai tahap, dan percobaan menemukan bahwaembrio awalmemiliki tingkat perkembangan yang lebih tinggi di tahap selanjutnya ketikacistancheditambahkan pada 2-tahap sel. Alasan yang mungkin adalah karena lingkungan eksternal reseptor. Nitric oxide (NO) adalah molekul sinyal dan faktor sitotoksik dengan berbagai aktivitas biologis. Efek NO padaembrio awalpembangunan harus ditelusuri kembali keembrio awaltahap perkembangan, yang mungkin disebabkan oleh salah satu penyebab 2-blok sel (2-blok sel) dalam kultur embrio mamalia, dan blok in vitro babi terjadi pada tahap 4-sel [ 9]. Penambahan tradisionalCinaobat-obatanbahan dapat menghilangkan radikal bebas NO sampai batas tertentu dan mengurangi faktor-faktor yang tidak menguntungkan dariembriopertumbuhan [10].
Benteng
Referensi
[1] Comport M. Tiga model kemarahan sel yang diinduksi radikal bebas[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72( 1/2) :1- 56.
[2] Pan Dengke. Studi tentang faktor-faktor yang mempengaruhi perkembangan kloning sel somatik babiembrio[D]. Beijing: Universitas Pertanian Cina, 2005.
[3] Zhang Yunhai. Penelitian tentang produksi kloning babiembriomenggunakan teknologi transfer nuklir sel somatik [D]. Beijing: Universitas Pertanian Cina, 2005.
[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun, dkk. Pengaruh penambahan serum sapi dan cairan folikel babi selama pematangan pada pematangan inti oosit babi danembrio awalperkembangan setelah fertilisasi in vitro [J]. Peternakan dan Kedokteran Hewan Heilongjiang, 2002, (8):1- 3.