Waktu Dan Efek Iskemia Pada Fibrosis Ginjal Setelah Nefrektomi Kontralateral

Perkenalan

Insidencedera ginjal akut(AKI) telah meningkat secara dramatis di seluruh dunia dalam beberapa tahun terakhir [1]. AKI dapat disebabkan oleh transplantasi organ, perfusi pasca operasi, perdarahan, dehidrasi, syok dan sepsis dalam praktik klinis [2]. Studi epidemiologi dan eksperimental baru-baru ini menunjukkan bahwa tingkat keparahan, frekuensi, dan durasi AKI berhubungan erat dengan kejadian selanjutnyapenyakit ginjal kronis(CKD). Fibrosis ginjal setelah AKI dapat menyebabkan CKD atau bahkanpenyakit ginjal stadium akhir(ESKD) [3-5], menyiratkan bahwa AKI dan CKD adalah sindrom terkait [6]. Namun, mekanisme yang mendasari transisi dari AKI ke CKD masih belum diketahui meskipun banyak penelitian eksperimental dan klinis. Model hewan adalah alat penting untuk menyelidiki mekanisme AKI yang menyebabkan CKD. Cedera reperfusi iskemia ginjal (IRI) adalah salah satu penyebab utama AKI, dan beberapa model hewan dari AKI yang diinduksi IRI telah dikembangkan [7], termasuk model IRI bilateral (bIRI), model IRI unilateral dengan ginjal kontralateral yang utuh. , model uIRI dengan nefrektomi kontralateral simultan, dan model uIRI dengan nefrektomi kontralateral tertunda.

Model bIRI kurang konsisten karena bila cedera iskemik pada kedua ginjal terlalu ringan, tidak ada perubahan fibrotik yang signifikan dalam jangka panjang. Jika AKI terlalu parah, tikus bisa mati pada fase cedera akut. Selain itu, perbedaan kecil pada cedera kedua ginjal dapat menyebabkan perbedaan signifikan pada patologi ginjal kronisnya setelah beberapa minggu [8,9]. Model uIRI dengan nefrotomi kontralateral simultan mirip dengan model bIRI karena hanya ginjal yang terluka yang tersisa akibat nefrektomi sisi lain [10]. Pada model IRI dengan ginjal kontralateral yang utuh, fibrosis pada ginjal iskemik sangat parah [11,12]. Model ini sangat konsisten dan dapat diandalkan untuk observasi jangka panjang oleh peneliti. Namun, karena adanya ginjal kontralateral yang tidak rusak, pemeriksaan ini tidak dapat digunakan untuk evaluasi perkiraan laju filtrasi glomerulus (eGFR), kreatinin serum (SCr), dan nitrogen urea darah (BUN) [11-14]. Dibandingkan dengan dua model uIRI yang disebutkan di atas, model uIRI dengan nefrektomi kontralateral tertunda mengatasi masalah ini dan dapat digunakan baik untuk observasi jangka panjang setelah AKI maupun pemantauan fungsi ginjal. Oleh karena itu, model ini cocok untuk mempelajari transisi AKI-CKD [15].

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHECEDERA GINJAL AKUT

Namun demikian, kondisi iskemik yang berbeda dan interval antara nefrektomi kontralateral dan uIRI mungkin mempunyai dampak yang signifikan terhadap perkembangan dan keparahan CKD setelah AKI. Penelitian sebelumnya berfokus pada pengaruh durasi iskemik pada fibrosis ginjal pasca AKI dan belum terlalu memperhatikan suhu inti tubuh selama iskemia. Misalnya, Skrypnyk dkk. [12] mengontrol suhu iskemik pada 38 C dengan sistem waterbath, dengan durasi iskemik 30 menit, dan ginjal kontralateral yang utuh diangkat 8 hari setelah uIRI. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ginjal iskemik mengalami perubahan fibrotik yang signifikan 28 hari setelah uIRI. Dengan durasi iskemik yang sama, Xiao et al. [8] menunjukkan bahwa perubahan fibrotik yang signifikan terjadi 11 hari setelah uIRI ketika suhu iskemik dikontrol pada 37 C 38 C dan interval waktu antara uIRI dan nefrektomi kontralateral adalah 10 hari. Beberapa peneliti, seperti Colombaro dkk. [14] dan Li dkk. [16] tidak menyebutkan suhu iskemik dalam penelitian mereka.

Sementara itu, hanya sedikit orang yang meneliti pengaruh interval waktu antara nefrektomi kontralateral dan uIRI dalam model ini, sehingga menghasilkan hasil yang sangat bervariasi di berbagai laboratorium, yang juga sangat memengaruhi eksperimen selanjutnya. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki pengaruh faktor utama yang mempengaruhi fibrosis ginjal setelah AKI, termasuk interval waktu antara nefrektomi kontralateral dan uIRI, suhu inti tubuh selama iskemia, dan durasi iskemik. Tujuan kami adalah memberikan referensi untuk membuat model hewan yang tepat untuk mempelajari transisi AKI CKD

Bahan dan Metode Model hewan

Tikus C57BL/6J jantan (usia 8–10 minggu, berat sekitar 22 g; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Cina) diberikan akses gratis ke makanan dan air di Pusat Eksperimen Hewan Universitas Kedokteran Shanxi. Kondisi perkembangbiakannya adalah sebagai berikut: kelembaban 40–70%, suhu 23 C, kelas kebersihan udara 7, siklus terang/gelap 12-jam terkontrol dalam kondisi bebas patogen, iradiasi pakan Co60, dan air murni. Semua prosedur untuk penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etika Hewan Rumah Sakit Kedua Universitas Kedokteran Shanxi (nomor etika: DW2022028).

Protokol

Mengingat durasi iskemik, suhu inti tubuh selama iskemia, dan waktu reseksi ginjal kontralateral yang tidak cedera mungkin berdampak pada tingkat keparahan AKI dan fibrosis ginjal selanjutnya, kami menyelidiki efek dari ketiga faktor di atas secara individual, dengan dua faktor lainnya tetap. Tiga percobaan dilakukan sebagai berikut.

Protokol 1: Untuk mengamati pengaruh interval antara nefrektomi kontralateral dan uIRI pada fungsi ginjal dan fibrosis pasca AKI, waktu iskemik ginjal kiri ditetapkan pada 24 menit dan suhu inti tubuh ditetapkan pada 37 C selama ginjal sementara itu iskemia. Reseksi ginjal kanan dilakukan masing-masing pada hari ke 7, hari ke 10, dan hari ke 14 (n ¼ 8 per kelompok) setelah IRI ginjal kiri. Kami menentukan durasi iskemia dan reseksi ginjal berdasarkan hasil penelitian sebelumnya [8,10,12,15] dan hasil pra-eksperimental kami. Lihat Gambar 1 (A – C) untuk protokol penelitian.

Protokol 2: Untuk mengamati pengaruh suhu inti tubuh selama iskemia pada transisi AKI-CKD, waktu iskemik ginjal kiri ditetapkan pada 24 menit, dan ginjal kanan diangkat 14 hari setelah IRI ginjal kiri. Suhu inti tubuh dikontrol masing-masing pada 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C, dan 38 C (n ¼ 8 per kelompok). Lihat Gambar 1(D) untuk protokol penelitian.

Protokol 3: Untuk mengamati pengaruh durasi iskemik ginjal pada transisi dari AKI ke CKD, suhu inti tubuh ditetapkan pada 37 C selama iskemia, dan ginjal kanan diangkat 14 hari setelah IRI ginjal kiri. Kami memilih titik waktu ini karena fibrosis ginjal, yang merupakan perubahan khas setelah AKI menjadi CKD, sangat jelas berdasarkan laporan [8,10,12,15] dan hasil pra-eksperimental kami. Waktu iskemik ginjal kiri dikontrol masing-masing pada 21 menit, 24 menit, 27 menit dan 30 menit (n ¼ 8 per kelompok). Lihat Gambar 1 (E) untuk protokol penelitian.

Semua tikus di-eutanasia pada 8 minggu setelah IRI ginjal kiri. Sebagian jaringan ginjal kiri disimpan pada suhu 70 C untuk selanjutnya dilakukan RT-PCR dan analisis western blot, dan sebagian lagi difiksasi dalam formalin netral untuk analisis histopatologi. Sampel darah dikumpulkan melalui sinus retro-orbital untuk pengujian biokimia.

Gambar 1. Protokol cedera reperfusi iskemia unilateral (uIRI) dengan nefrektomi kontralateral tertunda. (A – C): Ginjal kiri dikenakan IRI pada hari 0, dan reseksi ginjal kanan dilakukan pada titik waktu yang berbeda (hari ke 7, hari ke 1 0, dan hari ke 14) dengan durasi iskemik ditetapkan pada 24 menit dengan suhu inti tubuh ditetapkan pada 37 C selama iskemia ginjal. (D): Ginjal kiri dikenakan IRI pada hari 0, dan reseksi ginjal kanan dilakukan pada suhu inti tubuh yang berbeda (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C, dan 38 C) dengan iskemik waktu ginjal kiri difiksasi pada 24 menit, dan ginjal kanan diangkat 14 hari setelah IRI ginjal kiri. (E): Ginjal kiri dikenakan IRI pada hari ke 0, dan reseksi ginjal kanan dilakukan pada durasi iskemik yang berbeda (21 menit, 24 menit, 27 menit, dan 30 menit) dengan suhu inti tubuh ditetapkan pada 37 C selama ginjal iskemia, dan ginjal kanan diangkat 14 hari setelah IRI ginjal kiri. Berat ginjal, fungsi ginjal, cedera histologis ginjal, dan fibrosis ginjal dinilai hingga hari ke-56.

Prosedur bedah

Sebelum operasi, semua tikus berpuasa selama 12 jam dengan akses gratis ke air dan disuntik dengan 3% natrium pentobarbital 50 mg/kg secara intraperitoneal. Selama anestesi, suhu rektal dipertahankan masing-masing pada 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C, atau 38 C, pada kelompok eksperimen yang berbeda. Untuk mencapai hal ini, tikus ditempatkan dengan punggung di atas bantalan pemanas (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, China) dalam posisi dengan kepala dan leher diluruskan untuk memastikan jalan napasnya tetap ada. tidak terhalang, dan mata ditutup dengan kasa saline hangat untuk menghindari kekeringan selama prosedur. Setelah dibius, rambut di punggung kiri tikus dicukur dengan alat pemotong rambut. Kulit di area bedah kemudian dibersihkan dengan kapas alkohol 75%. Umumnya suhu tubuh tikus turun setelah mencukur bulunya. Prosedur pembedahan dilakukan ketika suhu inti tubuh menjadi konstan, yang dapat memakan waktu sekitar 15 menit. Ginjal kiri dapat dilihat dengan menyayat kulit punggung kiri 0,5 cm di sebelah garis tengah dan 0,5 cm di tepi bawah tulang rusuk mencit. Kemudian kita remas perut kiri dengan satu tangan agar ginjal kiri keluar dari rongga tubuh, angkat ginjal dengan tang lengkung tumpul (hati-hati jangan sampai merusak ginjal), lepaskan pedikel ginjal dan cepat dijepit, lalu dipasang penjepit. ginjal di bawah kulit agar tetap hangat dan lembab. Iskemia yang berhasil ditandai dengan perubahan warna ginjal secara bertahap dari merah menjadi ungu tua, yang masing-masing berlangsung selama 21 menit, 24 menit, 27 menit, dan 30 menit, pada kelompok eksperimen yang berbeda. Warna ginjal berubah kembali menjadi merah dalam waktu 2-5 menit setelah penjepit dilepas. Lalu kami menutup rongga perut dengan jahitan berlapis. Kulit dan otot punggung kanan diinsisi masing-masing pada hari ke 7, hari ke 10, dan hari ke 14 setelah uIRI, pada kelompok eksperimen yang berbeda, dan ginjal kanan direseksi. Kemudian tutup lukanya dengan jahitan standar. Setelah setiap operasi, 500 lL saline disuntikkan secara intraperitoneal untuk mengkompensasi kehilangan cairan selama operasi. Pada saat yang sama, tikus diletakkan di atas bantalan pemanas selama sekitar 2-3 jam hingga ia sadar sepenuhnya sebelum dipindahkan ke kandang. Kelompok palsu tidak menjepit pedikel ginjal, dan operasi bedah lainnya sama dengan kelompok uIRI. Semua operasi bedah dilakukan oleh orang yang sama dengan pengalaman lebih dari 2 tahun dalam pengoperasian model ini.

Uji fungsi ginjal

Kadar SCr diukur dengan Kit Kreatinin (Metode Jaffe, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Kadar BUN diukur dengan Urea Kit (Metode Urease-Glutamat Dehidrogenase, Bioteknologi dan Sains Biosino).

Uji berat ginjal

Setelah buang air kecil, berat badan tikus diukur dengan timbangan elektronik yang presisi. Ginjal segar dibilas tiga kali dalam larutan garam yang sudah didinginkan sebelumnya, kemudian kelebihan air pada ginjal dihilangkan dengan kertas saring. Kapsul ginjal dikupas di atas es dan ginjal segera ditimbang. Rasio berat ginjal terhadap berat badan dihitung untuk mengevaluasi berat ginjal yang dikoreksi dalam mg/g.

Pewarnaan hematoxylin-eosin (HE) dan skor cedera ginjal

Jaringan ginjal yang difiksasi dengan formalin netral secara rutin didehidrasi, ditanam dalam parafin, dibelah (3 lm), dan diwarnai dengan HE untuk mengamati kerusakan jaringan ginjal. Sepuluh bidang korteks ginjal yang dipilih secara acak dari setiap bagian ditangkap dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 400. Dua ahli patologi menilai cedera pada glomerulus dan tubulus ginjal secara terpisah. Cedera tubular dinilai pada skala {{20}}–4 menggunakan kriteria berikut [17]: 0, tidak ada cedera; 1, mempengaruhi 1–25% area ginjal; 2, mempengaruhi 26–50% area ginjal; 3, mempengaruhi 51–75% area ginjal; dan 4, mempengaruhi 75-100% area ginjal. Derajat cedera tubulus dievaluasi secara semikuantitatif dengan menghitung luas cedera tubulus ginjal. Cedera glomerulus dievaluasi dan diberi skor pada skala 0-4 sesuai dengan persentase area perluasan mesangial atau sklerosis dengan menggunakan kriteria berikut [17]: 0, glomeruli normal; 1, 1–25% area cedera; 2, 26–50% area terluka; 3, 51–75% area terluka; dan 4, 76–100% area terluka. Skor akhir kerusakan glomerulus ¼ 0 (% glomeruli grade 0) þ 1 (% glomeruli grade 1) þ 2 (% glomeruli grade 2) þ 3 (% glomeruli grade 3) þ 4 (% glomeruli grade 4). Lebih dari 50 glomeruli diberi skor per tikus.

Pewarnaan trikrom Masson

Jaringan ginjal yang difiksasi dengan formalin netral secara rutin didehidrasi, ditanam dalam parafin, dibelah (3 lm), dan diwarnai dengan trikrom Masson untuk mengamati fibrosis ginjal. Dalam irisan Masson yang diwarnai dengan trikrom, dua puluh bidang korteks ginjal yang tidak tumpang tindih ditangkap dengan pembesaran 200. Perangkat Lunak Analisis Gambar Image-Pro Plus digunakan untuk pengukuran dan analisis otomatis. Persentase area fibrotik digunakan untuk mengetahui tingkat fibrosis interstisial ginjal [8].

RT-PCR

Total mRNA diekstraksi dari jaringan ginjal masing-masing kelompok dengan Trizol dan diukur konsentrasinya, kemudian diubah menjadi cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Metode fluoresensi Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) digunakan untuk mengukur ekspresi RNA fibronektin (FN) dan kolagen I (COL-I) dalam jaringan ginjal. Primer spesifik digunakan untuk FN (maju: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 dan mundur: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ), dan COL-I (maju: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} dan sebaliknya: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (disediakan oleh Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Tiongkok). Kondisi amplifikasi sebagai berikut: 95 C selama 30 detik, 95 C selama 5 detik, 60 C selama 30 detik, 40 siklus; 95 C selama 10 detik, 65 C selama 5 detik, dan 95 C/5 C. Setelah menganalisis kurva amplifikasi dan kurva kelarutan produk, kadar mRNA relatif ditentukan dengan metode CT komparatif (2-DDCt) dengan 18SrRNA (maju: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 dan mundur: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) sebagai referensi internal.

noda barat

Buffer lisis radio-imuno-presisiasi (RIPA) digunakan untuk melisiskan jaringan ginjal dan konsentrasi protein ditentukan dengan metode BCA. Elektroforesis gel gradien digunakan untuk memisahkan protein dari 50 lg sampel. Kemudian protein dipindahkan ke membran nitroselulosa. Setelah diblokir dengan 5% susu tanpa lemak selama 2 jam, membran dihilangkan semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi monoklonal anti-tikus kelinci terhadap a-smooth-muscle actin (a-SMA) (1:1000, No.19245, Cell Signaling Technology ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam), atau COL-I (1:1000, No.72026, Teknologi Sinyal Sel), masing-masing. Keesokan harinya, membran dihangatkan kembali pada suhu kamar selama 0,5 jam. Setelah dicuci dengan TBST, membran diinkubasi dengan HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-kelinci IgG(H þ L)(1:1000, No.BA1054, BOSTER Biological Technology) selama 2 jam. Setelah dicuci dengan TBST lagi, mereka diwarnai dengan reagen chemiluminescence ECL dengan sensitivitas sangat tinggi untuk memvisualisasikan immunoblot. b-aktin diukur pada membran yang sama dengan referensi internal. Ekspresi protein ditentukan dengan mengukur ekspresi relatif protein target versus b-aktin.

Analisis data dan statistik

Semua data yang diperiksa dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan antara kedua kelompok diakses melalui uji-t independen. Perbandingan antara beberapa kelompok diakses dengan ANOVA satu arah ketika distribusi data normal, dan variansnya homogen, Welch ANOVA digunakan untuk menilai signifikansi statistik ketika variansnya heterogen, diikuti dengan uji post hoc Tukey untuk beberapa perbandingan. Semua analisis statistik dilakukan oleh perangkat lunak GraphPad Prism 8.0. p <0.05 dianggap signifikan secara statistik.