Efek Terapi Dan Mekanisme Cistanche Phenylethanol Glycosides Terhadap Spermatogenesis Induksi Siklofosfamid Pada Mencit

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Ringkasan]

Tujuan:Untuk mengeksplorasi efek terapeutik dariGlikosida fenilethanoid Cistanchepada tikus dengan spermatogenesis yang diinduksi siklofosfamid dan untuk memperjelas mekanisme kerjanya.Metode:Metode ekstraksi etanol untuk mengekstrakGlikosida fenilethanoid Cistanche. Empat puluh tikus BALB/C secara acak dibagi menjadi kelompok kontrol, kelompok model, kelompok dosis rendahCistanche fenilethanoid glikosidakelompok (50 mg·kg-1), dan kelompok dosis tinggi (100 mg·kg-1), dengan 10 tikus di setiap kelompok. Kecuali untuk kelompok kontrol, tikus dalam kelompok lain disuntik dengan siklofosfamid (80 mg·kg{-1) setiap hari selama 5 hari berturut-turut untuk mempersiapkan model tikus yang mengalami gangguan spermatogenesis. Setelah pemberian terakhir, tikus dalam kelompok dosis rendah dan dosis tinggiGlikosida fenilethanoid Cistanchediberi dosis yang sesuai dengan gavage, dan tikus dalam kelompok kontrol dan kelompok model diberi volume yang sama dari normal saline dengan gavage, sekali sehari selama 30 hari. Dua puluh empat jam setelah gavage terakhir, jaringan testis tikus diambil. Uji imunosorben terkait-enzim digunakan untuk menentukan tingkat testosteron dalam homogenat jaringan testis tikus. Kepadatan sperma, motilitas sperma, dan tingkat abnormalitas sperma dari masing-masing kelompok dibandingkan. Perubahan morfologi jaringan testis diamati dengan pewarnaan HE. Hasil: Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kepadatan sperma dan tingkat motilitas sperma dari kelompok model menurun (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Glikosida fenilethanoid Cistanchemeningkat secara signifikan (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche fenilethanoid glikosidakelompok meningkat secara signifikan, Lapisan-lapisannya berbeda, sel-sel spermatogenik tersusun rapi, rapat dan teratur, dan sperma dapat terlihat di dalam lumen.Kesimpulan: Glikosida fenilethanoid Cistanchememiliki efek terapeutik yang signifikan pada gangguan spermatogenesis yang disebabkan oleh siklofosfamid pada tikus, dan mekanismenya mungkin terkait dengan peningkatan kadar testosteron dalam jaringan testis.

[Kata Kunci]Glikosida fenilethanoid Cistanche; siklofosfamid; gangguan spermatogenesis; tikus, BALB/C

Klik untuk produk Cistanche

Karena percepatan ritme sosial, kebiasaan hidup yang buruk dan pencemaran lingkungan, serta faktor lainnya, kualitas sperma yang tidak normal seperti oligospermia dan asthenospermia menjadi penyebab utama infertilitas pria [1]. Saat ini, ada lebih sedikit obat untuk mengobati oligospermia dan asthenospermia, dan efek terapeutiknya tidak jelas. Resep obat tradisional Cina atau bahan aktif memiliki efek yang baik dalam meningkatkan fungsi reproduksi pria [2-6]. Namun, karena berbagai macam obat resep, hubungan antara efek farmakologis dan bahan efektif obat tidak jelas, yang membatasi promosi dan penerapan obat spermatogenik. Penelitian dan pengembangan bahan-bahan pengobatan Cina yang efektif dan studi tentang efek terapeutiknya pada cedera reproduksi memiliki nilai aplikasi yang baik.Glikosida fenilethanoid Cistancheadalah salah satu bahan aktif terpenting dalamCistanche deserticola. Mereka biasanya glikosida alami yang mengandung ikatan ester dan ikatan okso-glikosidik dengan -glukosa sebagai nukleus. Mereka banyak ditemukan pada tanaman dikotil [7]. Studi [8] telah menunjukkan bahwaBentengfeniletanoidglikosidadapat melindungi sperma tikus dari kerusakan oksidatif in vitro, tetapi tidak ada laporan tentang spermatogenesisnya. Eksperimen ini mempelajari efek terapeutik glikosida fenilethanoid Cistanche pada fungsi spermatogenik mencit dengan spermatogenesis yang diinduksi siklofosfamid dan memberikan dasar eksperimental dan teoritis untuk penerapanGlikosida fenilethanoid Cistanchedalam pengobatan gangguan spermatogenesis.

1. Bahan dan metode

1.1. Hewan laboratorium, reagen utama, dan instrumen

40 tikus BALB/C dewasa kelas SPF, 6-8 minggu, dengan massa tubuh 20-22g, dibeli dari Pusat Eksperimen Hewan Sekolah Kedokteran Dasar Universitas Jilin, dan nomor sertifikat hewan : SCXK (Kyrgyzstan) 2008-005. Tikus dibiakkan secara adaptif selama 5 hari sebelum percobaan. Kondisi makan: 22 derajat ~ 25 derajat, ritme sirkadian (12 jam/12 jam), air minum dan makanan gratis. Cistanche adalah produk dari Xinjiang Dakang Trading Company. Siklofosfamid untuk injeksi dibeli dari Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (nomor batch 11061921). Kit immunoassay terkait-enzim testosteron homogenat jaringan testis dibeli dari Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (nomor batch) 20120812), reagen lainnya semuanya adalah nilai analitik yang diproduksi di dalam negeri. PLUS384 pembaca pelat mikro (MDC di Amerika Serikat), mikroskop terbalik TE2000U (Nikon, Jepang), dan sentrifus J-26XP (Nanodrop, Amerika Serikat).

1.2 Persiapan Cistanche Phenylethanol Glucoside

10g bubuk cistanche diekstraksi dengan refluks dengan 70 persen etanol, dua kali, 2 jam setiap kali, untuk mendapatkan konsentrat glikosida fenetil alkohol. Larutan pekat dikromatografi pada kolom resin berpori D101 dan dielusi dengan etanol 70 persen untuk mendapatkan alkohol fenekosida Cistanche. Spektrofotometer UV mengidentifikasi ekstrak pada panjang gelombang 333 nm.

1.3 Penyusunan model hewan dan metode pemberian obat

Setelah 40 ekor mencit BALB/C jantan diberi pakan adaptif selama 5 hari, mencit dibagi secara acak menjadi 4 kelompok (10 ekor dalam setiap kelompok): kelompok kontrol, kelompok model, CistancheGlikosida fenilethanoid Cistanchekelompok dosis rendah, danGlikosida fenilethanoid Cistanchekelompok dosis tinggi. Kecuali kelompok kontrol, tiga kelompok tikus lainnya diberi injeksi siklofosfamid 80 mg·kg-1 intraperitoneal untuk setiap tikus selama 5 hari berturut-turut untuk mempersiapkan model hewan gangguan spermatogenesis. Setelah model disiapkan, tikus dalam kelompok dosis rendah dan tinggiBentengfeniletanoid masing-masing diberi 50 dan 100 mg·kg-1·d-1. Tikus dalam kelompok kontrol dan kelompok model diberi volume yang sama dari normal saline. Sekali sehari selama 30 hari. Semua tikus dikorbankan 24 jam setelah pemberian obat terakhir dan tes bilateral dilakukan. Testis kanan difiksasi dengan formaldehida. Epididimis dan testis diambil dari sisi kiri. Testis dihomogenkan dan disentrifugasi pada 3,000 menit selama 10 menit. Supernatan diambil dan disimpan dalam lemari es pada derajat -20 untuk pengujian. Epididimis kiri diuji kepadatan sperma, motilitas sperma, dan tingkat deformitas.

1.4 Penentuan kepadatan sperma, motilitas sperma, dan tingkat deformitas

Tempatkan tabung reaksi yang berisi 10 mL larutan nutrisi sperma [9] dalam penangas air suhu konstan untuk memanaskannya hingga 37 derajat, ambil epididimis unilateral untuk menghilangkan jaringan ikat dan lemak, memotong jaringan, dan memasukkannya ke dalam tabung reaksi di 37 derajat selama 10 menit Setelah sperma benar-benar bebas, ambil 1 tetes pada pelat penghitung sel darah dan hitung kepadatan sperma sesuai dengan metode penghitungan sel. Hasilnya dinyatakan sebagai jumlah sperma per mililiter; Selain itu, ambil 5μL suspensi sperma dan eosin-Y dalam jumlah yang sama dari tabung reaksi. Aduk rata, letakkan pada suhu kamar selama 10 menit, tambahkan kaca penutup, dan amati dengan mikroskop cahaya. Sperma mati berwarna merah muda, sperma hidup tidak terwarnai dan sitoplasma transparan. Setiap spesimen menghitung 200 sperma, menghitung viabilitas sperma, hasilnya dinyatakan dalam persentase, viabilitas sperma=sejumlah sperma hidup / jumlah total sperma × 100 persen . 5 L suspensi sperma lainnya difiksasi dalam metanol selama 5 menit, dikeringkan dan diwarnai dengan larutan berair eosin 2 persen selama 1 jam, dibilas, dan dikeringkan. Cari bagian dengan sedikit sperma yang tumpang tindih di bawah lensa berdaya rendah, dan gunakan lensa berdaya tinggi untuk memeriksa morfologi sperma secara berurutan. Setiap tikus memeriksa 1,000 sperma lengkap. Kepala sperma tanpa kait, berbentuk pisang, amorf, kepala gemuk dan kepala ganda dinilai sebagai kelainan bentuk. Tingkat deformitas sperma dihitung dan hasilnya dinyatakan sebagai persentase. Tingkat kelainan bentuk sperma=jumlah sperma cacat / jumlah total jumlah sperma × 100 persen .

1.5 Penentuan hormon reproduksi

Testis dikupas dari membran dan ditempatkan dalam cawan vial, dan media homogenisasi yang telah didinginkan sebelumnya (0.01mol·L-1 sukrosa, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0.1mmol·L-1 larutan EDTA-Na2, pH 7,4), potong jaringan testis dengan gunting oftalmologi, tuangkan ke dalam tabung gelas homogenisasi, dan sentrifus pada 4, 000×g selama 10 menit pada suhu rendah, dan ambil supernatannya, Gunakan kit uji imunosorben terkait-enzim untuk mengukur kadar testosteron dalam homogenat jaringan testis dan uji 3 sampel paralel untuk setiap sampel. Langkah-langkah dan metode eksperimental diselesaikan sesuai dengan instruksi kit.

1.6 Pengamatan morfologi testis

Ambil bagian parafin testis tikus, diwarnai dengan HE, dan amati distribusi spermatogonia dan sel spermatogenik pada jaringan testis di bawah mikroskop cahaya.

1.7 Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS17.0 perangkat lunak statistik. Kepadatan sperma, laju motilitas sperma, laju deformitas sperma, dan kadar testosteron testis mencit pada masing-masing kelompok dinyatakan sebagai x±s, dan perbandingan antar kelompok dilakukan dengan analisis varians faktor tunggal.

2. hasil

2.1. Kepadatan sperma, motilitas sperma, dan tingkat deformitas sperma masing-masing kelompok mencit

Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kepadatan sperma dan viabilitas sperma dari kelompok model menurun (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoksietanol glikosidameningkat (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Kadar testosteron pada jaringan testis mencit pada masing-masing kelompok

Tingkat testosteron dalam homogenat jaringan testis dari kelompok kontrol dan kelompok model adalah (10.26±0.57) dan (5.33±0.84) nmol·L-1, masing-masing. Tingkat testosteron kelompok model secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Bentengcistanche phenethyl glycoside kelompok dosis tinggi secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok dosis rendah (P<>

2.3 Morfologi testis tikus pada masing-masing kelompok

Dilihat dengan mikroskop cahaya, tubulus seminiferus pada testis kelompok normal tersusun rapat, tingkat dan jumlah sel germinal banyak, epitel seminiferus tersusun rapi, dan tubulus seminiferus semua terlihat pembentukan sperma. Pada kelompok model, tubulus seminiferus pada testis mencit mengalami atrofi dan degenerasi, epitel seminiferus menipis secara signifikan, jumlah lapisan epitel berkurang, susunan tidak teratur, dan jumlah sperma dalam rongga berkurang. Dibandingkan dengan kelompok model, dosis rendahCistanche phenethyl alkohol glikosida.

Dalam kelompok, jumlah lapisan epitel seminiferus tubulus seminiferus meningkat, susunan epitel lebih teratur, dan kerusakan tubulus seminiferus jelas membaik; struktur tubulus seminiferus dalam dosis tinggiCistanche fenilethanoid glikosidakelompok meningkat lebih signifikan, dan jumlah dan jumlah lapisan epitel seminiferus meningkat secara signifikan. Tersusun rapi, terdapat sperma matang di tubulus seminiferus, dan struktur dasarnya sudah kembali normal. Lihat Gambar 1 (Inset 6).

3 Diskusi

Siklofosfamid adalah obat anti tumor dan imunosupresan yang umum digunakan, yang terutama mengganggu berbagai fungsi biologis intraseluler melalui alkilasi DNA. Toksisitas reproduksi adalah salah satu efek samping utama dari siklofosfamid [3], yang dapat dengan mudah menyebabkan kerusakan DNA sperma dan perkembangan sperma yang abnormal. Studi klinis [10-11] menunjukkan bahwa toksisitas reproduksi siklofosfamid dapat menyebabkan azoospermia atau oligospermia. , Menyebabkan infertilitas atau terjadinya cacat genetik atau malformasi pada keturunannya.

Cistanche tubulosaadalah tanaman parasit tinggi abadi dalam keluarga Leiden. Ini adalah obat Cina terkenal yang memelihara ginjal dan Yang, memelihara darah, dan memelihara usus. Ini adalah obat resep yang umum digunakan untuk pengobatan tradisional disfungsi reproduksi pria [12].Glikosida feniletanoidadalah salah satu komponen aktif yang paling penting dariBenteng[13] dan memiliki berbagai efek farmakologis, seperti anti-oksidasi, anti-penuaan, dan anti-tumor [14].

Dalam penelitian ini, siklofosfamid digunakan untuk mempersiapkan model tikus gangguan spermatogenesis, dan efek terapi glikosida fenilethanoid Cistanche pada gangguan spermatogenesis yang disebabkan oleh siklofosfamid dipelajari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok normal, kepadatan sperma kelompok model menurun, tingkat kelangsungan hidup menurun, dan tingkat deformitas meningkat. Dibandingkan dengan kelompok model, semua kelompok dosis glikosida fenoksietanol Cistanche dapat secara efektif meningkatkan kepadatan sperma, meningkatkan motilitas sperma dan mengurangi tingkat deformitas sperma. Hasil di atas menunjukkan bahwa cistanche phenoxyethanol glikosida dapat meningkatkan spermatogenesis dan melindungi testis yang rusak. Hasil morfologi testis menunjukkan bahwa setelah perlakuan denganCistanche fenilethanoid glikosida, jumlah epitel seminiferus pada testis mencit model meningkat secara signifikan, lapisan yang berbeda, sel-sel spermatogenik tersusun rapi, rapat, dan teratur, dan sperma dapat terlihat di lumen, menunjukkan bahwaCistanche fenilethanoiddapat mengubah Shanhe mengembalikan struktur dan morfologi epitel seminiferus setelah cedera reproduksi.

Testosteron mengatur diferensiasi sel germinal pria dan merupakan kondisi yang diperlukan untuk perkembangan normal testis dan terjadinya sperma secara normal. Beberapa penelitian [15] melaporkan bahwa knockout selektif reseptor androgen di sel Sertoli testis menyebabkan gangguan perkembangan sperma dan kemandulan pria. Dalam penelitian ini, siklofosfamid digunakan untuk menghasilkan spermatogenik.

Setelah model cedera rintangan, tingkat testosteron dalam jaringan testis tikus secara signifikan lebih rendah daripada pada kelompok normal. Setelah aksi glikosida fenilethanoid Cistanche, kadar testosteron pada setiap kelompok dosis meningkat, dan tingkat testosteron pada kelompok dosis tinggi secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok dosis rendah. Disarankan bahwa cistanche phenoxyethanol glikosida dapat meningkatkan spermatogenesis dengan meningkatkan kadar testosteron dalam jaringan testis untuk mengobati disfungsi spermatogenik, tetapi mekanisme pengaruhnya terhadap testosteron memerlukan penelitian dan diskusi lebih lanjut.

Testosteron mengatur diferensiasi sel germinal pria dan merupakan kondisi yang diperlukan untuk perkembangan normal testis dan terjadinya sperma secara normal. Beberapa penelitian [15] melaporkan bahwa knockout selektif reseptor androgen di sel Sertoli testis menyebabkan gangguan perkembangan sperma dan kemandulan pria. Dalam penelitian ini, siklofosfamid digunakan untuk menghasilkan spermatogenik.

Setelah model cedera rintangan, tingkat testosteron dalam jaringan testis tikus secara signifikan lebih rendah daripada pada kelompok normal. Setelah aksiGlikosida fenilethanoid Cistanche, kadar testosteron pada setiap kelompok dosis meningkat, dan kadar testosteron pada kelompok dosis tinggi secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok dosis rendah. Disarankan bahwa cistanche phenoxyethanol glikosida dapat meningkatkan spermatogenesis dengan meningkatkan kadar testosteron dalam jaringan testis untuk mengobati disfungsi spermatogenik, tetapi mekanisme pengaruhnya terhadap testosteron memerlukan penelitian dan diskusi lebih lanjut.

[referensi]

[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Kemajuan baru dalam penelitian infertilitas pria [J]. Jurnal Andrologi Cina, 2006, 12(9): 771-774.

[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming, dkk. Pengaruh Kapsul Guilingji pada Tikus Model dengan Oligospermia. Peran produksi sperma dan dampaknya terhadap hormon seks [J]. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2011, 28(6): 621-623.

[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, dkk. Flavonoid total epimedium menyebabkan minimalisasi siklofosfamid Penelitian tentang efek perlindungan penghalang sperma lahir tikus [J]. Obat paten Cina, 2010, 32 (12): 2052-2055.

[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, dkk. Butiran Shengjing pada Penurunan Sperma yang diinduksi Siklofosfamid Menghalangi efek terapeutik tikus [J]. Jurnal Universitas Zhengzhou: Edisi Ilmu Kedokteran, 2008, 43(2): 267-270.

[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, dkk. Pengaruh Butiran Shengjing Pengobatan Cina pada Gangguan Spermatogenesis Tikus Penelitian eksperimental tentang efek terapeutik [J]. Jurnal Andrologi Cina, 2008, 14 (11): 1046-1049.

[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, dkk. Pengaruh Rebusan Heshouwu pada Jaringan Testis Tikus Tua Pengaruh jalur transduksi sinyal sel Rb/p53 [J]. Jurnal Anatomi, 2010, 41(3): 435-439.

[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Pengaruh Ekstraksi Refluks Cistanche Phenylethanol Glucoside dengan Penelitian Faktor Etanol [J]. Ilmu Pertanian Jiangsu, 2009 (1): 250-251.

[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, dkk. Pengaruh Cistanche Phenylethanol Glucoside pada Sperma Tikus Penelitian tentang efek perlindungan dari kerusakan oksidatif eksternal [J]. Pengobatan Tradisional Tiongkok Lishizhen dan Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.

[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong, dll. Antibodi anti-air mani pada fungsi mitokondria sperma Dampak dari [J]. Jurnal Fakultas Kedokteran Universitas Shantou, 2008, 21(1): 4-6.

[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, dkk. Info risiko tinggi Highdoseccyclophaphamiddeforsarcomaduringchildhood [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.

[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, dkk. Fungsi testis Dan pelestarian subur di malleccancerparty [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.

[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Kemampuan Cistanche untuk menahan kelelahan olahraga pada tikus Dan pengaruh radikal bebas otak [J]. Ilmu Pertanian Anhui, 2011, 39(16): 9592-9595.

[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, dkk. Glikosida feniletanol dalam penelitian ekstraksi dan pemurnian Cistanche cistanche yang dibudidayakan [D]. Wuxi: Universitas Jiangnan, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Kemajuan dalam penelitian farmakologis Pameran glikosida fenoksietanol [J]. Kedokteran Lishizhen dan Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.

[15] ChangC, ChenYT, YehSD, dkk. Infomedia musim semi TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101 (18): 6876-6881.