UTX Regulator Epigenetik terkait-X Mengontrol Perbedaan Jenis Kelamin Intrinsik Sel NK
Dec 27, 2023
Hasil dari infeksi virus didasarkan pada jenis kelamin, dimana laki-laki umumnya lebih rentan dibandingkan perempuan. Paradoksnya, jumlah sel antivirus pembunuh alami (NK) meningkat pada pria. Kami menunjukkan bahwa meskipun jumlah sel NK meningkat pada tikus jantan, fungsi efektornya menurun dibandingkan dengan tikus betina dan manusia. Perbedaan ini tidak semata-mata bergantung pada hormon gonad, karena perbedaan tersebut tetap ada pada tikus yang menjalani gonadektomi. Kdm6a (yang mengkode protein UTX), sebuah regulator epigenetik yang lolos dari inaktivasi X, lebih rendah pada sel NK jantan, sedangkan defisiensi UTX intrinsik sel NK pada tikus betina meningkatkan jumlah sel NK dan mengurangi respons efektor. Selain itu, tikus dengan defisiensi UTX intrinsik sel NK menunjukkan peningkatan kematian terhadap sitomegalovirus tikus. Analisis multi-omics integratif mengungkapkan peran penting UTX dalam mengatur aksesibilitas kromatin dan ekspresi gen yang penting untuk homeostasis sel NK dan fungsi efektor. Secara kolektif, data ini mengimplikasikan UTX sebagai penentu molekuler penting dari perbedaan jenis kelamin dalam sel NK.
Perbedaan jenis kelamin yang dilestarikan secara evolusi terdapat pada respons imun bawaan dan adaptif1,2. Meskipun laki-laki kurang rentan terhadap autoimunitas, mereka juga memiliki respons imun antiviral yang kurang kuat dibandingkan perempuan. Misalnya, laki-laki memiliki beban human cytomegalovirus (HCMV) yang lebih tinggi setelah terinfeksi, sehingga menunjukkan peningkatan kerentanan terhadap ancaman virus4. Hal ini juga baru-baru ini diilustrasikan selama pandemi penyakit virus corona 2019 (COVID-19), di mana bias yang kuat pada laki-laki terhadap penyakit yang parah diduga mencerminkan perbedaan jenis kelamin dalam respons imun5. Berbagai penelitian pada manusia dan tikus baru-baru ini melaporkan perbedaan distribusi dan/atau fungsi sel kekebalan pada pria dibandingkan wanita6,7. Namun, dasar molekuler dari perbedaan-perbedaan ini, dan mekanisme bagaimana perbedaan-perbedaan ini mempengaruhi hasil penyakit, masih kurang dipahami. Perbedaan jenis kelamin pada mamalia ditentukan tidak hanya oleh perbedaan hormon gonad tetapi juga oleh dosis kromosom seks1. Ekspresi subset gen terkait-X, misalnya, lebih tinggi pada perempuan (XX) dibandingkan laki-laki (XY)8. Meskipun betina menjalani inaktivasi kromosom X secara acak (XCI) untuk mempertahankan tingkat ekspresi protein terkait-X yang serupa antar jenis kelamin, XCI tidak lengkap, dengan 3–7% gen kromosom X lolos dari inaktivasi pada tikus dan 20–30% lolos dari inaktivasi pada tikus. manusia8,9. Dengan demikian, perbedaan tingkat ekspresi gen terkait-X pada perempuan versus laki-laki telah dikaitkan dengan perbedaan jenis kelamin dalam berbagai kondisi termasuk cacat tabung saraf10 dan penyakit autoimun11,12. Sebagai limfosit bawaan tipe 1 yang bersirkulasi, sel NK berfungsi sebagai garis pertahanan awal terhadap anggota keluarga virus herpes13. Pentingnya sel NK dalam kekebalan antivirus diilustrasikan pada pasien dengan jumlah atau fungsi sel NK yang rusak, yang sangat rentan terhadap infeksi virus herpes seperti HCMV dan virus Epstein-Barr14. Pada tikus, sel NK diperlukan untuk mengendalikan sitomegalovirus tikus (MCMV) dan infeksi virus lainnya15. Tikus dengan defisiensi genetik pada fungsi sel NK atau hilangnya jumlah sel NK mengalami peningkatan titer virus dan mortalitas yang signifikan setelah infeksi MCMV15-18. Dengan demikian, sel NK sangat penting dalam kekebalan antivirus pada tikus dan manusia.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Mengingat fungsi antivirus yang kuat dari sel NK, maka tidak diduga bahwa laki-laki yang rentan terhadap virus menunjukkan jumlah sel NK yang lebih tinggi6,7. Di luar jumlah sel NK, fitur sel NK dimorfik seksual lainnya yang sebelumnya tidak dihargai mungkin menyebabkan perbedaan jenis kelamin selama infeksi virus. Kami menunjukkan bahwa meskipun sel NK jantan menunjukkan peningkatan kebugaran seluler pada tikus, sel tersebut menunjukkan penurunan fungsi efektor pada tikus dan manusia. Bias jenis kelamin dalam komposisi dan fungsi sel NK ini tidak sepenuhnya disebabkan oleh perbedaan hormonal, karena bias tersebut tetap ada pada tikus yang menjalani gonadektomi. Melalui skrining ekspresi diferensial, kami mengidentifikasi regulator epigenetik terkait-X dan UTX escapee XCI yang dikenal, yang diekspresikan pada tingkat yang jauh lebih rendah pada sel NK tikus dan manusia jantan. UTX mengatur kebugaran sel NK dan fungsi efektor dengan cara yang bergantung pada dosis karena haploinsufisiensi UTX pada sel NK wanita cukup untuk meningkatkan jumlah sel NK sekaligus mengganggu produksi sitokin dan sitotoksisitas. Sel NK wanita yang kekurangan UTX menunjukkan peningkatan persistensi in vivo dan resistensi terhadap apoptosis ex vivo, serta peningkatan kerentanan terhadap infeksi MCMV. Efek ini tidak bergantung pada aktivitas demetilase intrinsik UTX, karena jumlah sel NK dan produksi interferon (IFN) tidak berubah pada tikus yang mengekspresikan mutan UTX 'mati demetilase'. Analisis integratif menggunakan uji kromatin yang dapat diakses transposase menggunakan sekuensing (ATAC-seq), sekuensing RNA massal (RNA-seq), dan anti-UTX CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation Assay) tipe liar (WT) dan UTX- kekurangan sel NK mengungkapkan peran penting UTX dalam mengatur ekspresi lokus gen yang terlibat dalam kebugaran sel NK dan respons efektor. Temuan kami mengidentifikasi UTX sebagai pendorong utama perbedaan jenis kelamin dalam homeostasis sel NK dan fungsi efektor melalui modulasi ekspresi gen yang tidak bergantung pada demetilase.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas
【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Hasil
Dimorfisme seksual NK tidak bergantung pada hormon seks gonad
Investigasi baru-baru ini yang memeriksa limpa tikus C57BL/6 melaporkan peningkatan jumlah sel NK pada pria dibandingkan wanita19. Konsisten dengan data ini, kami mengamati bahwa sel NK limpa (diidentifikasi sebagai CD3− TCR − NK1.1+; Gambar Data Tambahan 1a) meningkat frekuensinya (Gambar 1a,b) dan angka absolut (Gambar 1c ) pada tikus C57BL/6 jantan dibandingkan dengan betina. Temuan ini menunjukkan bahwa ciri-ciri dimorfik seksual lain selain jumlah sel NK mungkin menyebabkan peningkatan kerentanan pria terhadap infeksi virus. Sebagai respons terhadap infeksi virus, sel NK sangat penting untuk produksi awal sitokin proinflamasi, khususnya IFN- 20–22. Untuk menguji apakah ada perbedaan jenis kelamin dalam fungsi intrinsik sel NK, kami membandingkan produksi sitokin efektor dalam sel NK yang diisolasi dari tikus betina dan tikus jantan secara ex vivo. Stimulasi dengan sitokin pro-inflamasi interleukin (IL)-12 dan IL-15 menghasilkan produksi IFN- yang lebih rendah oleh sel NK pria (Gambar 1d,e dan Extended Data Gambar. 1b). Hasil serupa diamati dalam respons terhadap IL-12 dan IL-18 (Extracted Data Gambar. 1c,d), menunjukkan adanya defek pada respons sel NK pria terhadap stimulasi sitokin. Selain itu, sel NK manusia (TCR − CD3− CD56+ ) yang diisolasi dari sel mononuklear darah tepi (PBMC) yang diaktifkan dengan sel leukemia IL-12 dan K562 menghasilkan persentase IFN- + yang lebih rendah (Gambar 1f dan Gambar Data Diperluas. 1e) dan intensitas fluoresensi rata-rata IFN (MFI; Gambar. 1g) pada sel NK pria versus wanita. Jadi, meskipun jumlah sel NK meningkat, produksi sitokin efektor sel NK jantan secara konsisten berkurang baik pada tikus maupun manusia sebagai respons terhadap sitokin proinflamasi yang diinduksi selama infeksi virus.
Jenis kelamin perempuan atau laki-laki didasarkan pada gabungan hormon gonad (misalnya estrogen atau androgen) dan kromosom seks (misalnya 46XX atau 46XY)1. Penelitian sebelumnya menunjukkan efek langsung hormon gonad dalam regulasi produksi IFN oleh sel NK23, namun masih ada kemungkinan bahwa perbedaan jenis kelamin sel NK juga dapat dikaitkan dengan faktor intrinsik sel. Untuk mengidentifikasi efek yang dimediasi hormon seks, kami memeriksa kelimpahan dan fungsi sel NK pada tikus yang digonadektomi. Gonadektomi gagal menghilangkan perbedaan jenis kelamin dalam frekuensi sel NK (Gambar 1h dan Gambar Data Diperluas 1f), angka absolut (Gambar 1i) dan produksi protein IFN sebagai respons terhadap stimulasi sitokin (Gambar 1j,k dan Gambar Data Diperluas. 1g), menunjukkan hormon gonad tidak semata-mata bertanggung jawab atas perbedaan jenis kelamin dalam sel NK. Sementara himpunan bagian pematangan sel NK yang diidentifikasi dengan ekspresi CD11b dan CD27 memiliki kapasitas berbeda untuk bertahan hidup dan fungsi efektor, sel NK limpa yang berasal dari WT atau tikus betina dan jantan yang digonadektomi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam frekuensi himpunan bagian pematangan sel NK (Data Diperpanjang Gambar .1 jam–k). Hasil ini menunjukkan bahwa bias jenis kelamin yang diamati dalam jumlah sel NK dan fungsi efektor bukan disebabkan oleh perbedaan kondisi maturasi. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa dosis kromosom seks dapat berkontribusi terhadap perbedaan kelimpahan dan fungsi sel NK antar jenis kelamin.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
UTX lolos dari inaktivasi X dan lebih banyak diekspresikan pada wanita
Sementara 46XX perempuan menjalani XCI untuk mengontrol dosis gen terkait-X, sebagian gen yang lolos dari XCI (disebut pelarian XCI), seringkali menghasilkan ekspresi yang lebih tinggi pada perempuan dibandingkan laki-laki25,26. Dengan demikian, peningkatan ekspresi escapee XCI pada wanita dibandingkan pria berpotensi memediasi perbedaan jenis kelamin dalam sel NK. Meskipun gen yang berbeda lolos dari inaktivasi X pada manusia dan tikus, lima gen (XIST, DDX3X, KDM6A, EIF2S3, KDM5C) sebelumnya telah diidentifikasi sebagai gen yang lolos dari XCI pada keduanya27. XIST dikeluarkan dari analisis lebih lanjut karena tidak diekspresikan dalam sel pria karena perannya yang diketahui dalam XCI pada sel wanita1. Keempat gen yang tersisa secara signifikan diturunkan regulasinya pada sel NK pria dan wanita, baik pada manusia (Gambar 2a) dan tikus (Gambar 2b). Tingkat transkrip Kdm6a (yang mengkode UTX) menampilkan ekspresi dimorfik paling seksual pada sel NK manusia dan tikus (Gbr. 2a,b). Sel NK jantan juga menunjukkan kadar protein UTX yang lebih rendah dibandingkan sel NK betina pada tikus (Gambar 2c, d). Perbedaan dalam tingkat transkrip Kdm6a dan tingkat protein UTX ini bertahan pada tikus yang digonadektomi (Gambar 2e-g) dan tikus Four Core Genotypes (FCG) (Data Diperpanjang Gambar 2a) di mana komplemen kromosom seks (XX atau XY) tidak digabungkan dari alat kelamin gonad (ovarium atau testis)28. Data ini menunjukkan tingkat ekspresi Kdm6a (UTX) berdasarkan jenis kelamin dalam sel NK dan terutama ditentukan oleh dosis kromosom X daripada hormon gonad.
UTX menekan kebugaran sel NK
Untuk menentukan apakah UTX memediasi perbedaan jenis kelamin yang diamati dalam sel NK, kami menghasilkan serangkaian tikus dengan hilangnya UTX yang bergantung pada dosis. Pertama, kami menghasilkan tikus betina dengan penghapusan UTX heterozigot dalam sel NK (Kdm6afl/WT Ncr1Cre+, selanjutnya disebut UTXHet; Tabel Data Tambahan 1) untuk meniru salinan tunggal UTX yang diekspresikan pada pria. Kami mengkonfirmasi ekspresi protein UTX sel NK yang serupa antara tikus UTXHet betina dan tikus WT jantan (Kdm6afl/y Ncr1Cre-) (Extracted Data Gambar. 2b). Tikus UTXHet betina menunjukkan jumlah sel NK limpa yang serupa dibandingkan dengan WT jantan (Gambar 3a,b), dan keduanya menunjukkan peningkatan jumlah sel NK dibandingkan dengan WT betina. Tidak ada perbedaan signifikan dalam pematangan ekspresi CD11b dan CD27 yang diamati antara sel NK dari tikus WT betina, WT jantan, dan tikus UTXHet betina (Extracted Data Gambar. 2c). Dengan demikian, hilangnya satu salinan UTX sudah cukup untuk meningkatkan jumlah sel NK dengan cara yang tidak tergantung pada maturasi. Kami selanjutnya memproduksi tikus dengan penghapusan UTX homozigot (Kdm6afl/flNcr1Cre+, selanjutnya disebut UTXNKD; Tabel Data Tambahan 1), yang mengakibatkan hilangnya kedua salinan UTX dalam sel NK. Ekspresi protein UTX secara signifikan lebih rendah pada sel UTXNKD NK betina dibandingkan dengan sel WT NK betina dengan flow cytometry (Extracted Data Gambar. 2b), serta lebih rendah dibandingkan dengan sel NK dengan salinan UTX tunggal (yaitu, WT jantan dan UTXHet betina ). Tidak adanya protein UTX pada ukuran yang diprediksi (180 kD) pada UTXNKD wanita dibandingkan dengan sel WT NK dikonfirmasi oleh western blot (Extracted Data Gambar. 2d). Frekuensi sel NK dan angka absolut meningkat dengan menurunnya jumlah salinan UTX (Gbr. 3c,d dan Extended Data Gambar. 3a). Data ini mengimplikasikan UTX dalam mengatur frekuensi sel NK dan angka absolut dengan cara yang bergantung pada dosis.
Gambar 1|Perbedaan jenis kelamin dalam produksi IFN- dan jumlah sel NK tidak bergantung pada hormon gonad. a – c, Plot titik representatif (a), frekuensi (b), dan jumlah absolut (c) sel NK limpa (CD3− TCR − NK1.1+ ) pada tikus C57BL/6 betina dan jantan (n { {7}} per grup). d,e, Persentase IFN- + (d) dan IFN-MFI (e) yang dinormalisasi dari total sel NK limpa dari tikus betina versus tikus jantan yang dikultur tanpa pengobatan (NT) atau IL{{10} } (50 ng ml−1) dan IL-12 (20 ng ml−1) selama 4 jam, dinormalisasi menjadi MFI IL-15/IL{ betina {18}} perlakuan (n=8 per kelompok). f,g, Persentase IFN{{20}} (f) dan IFN-MFI yang dinormalisasi (g) dari CD3− CD56+ perempuan (n=6) dan laki-laki (n { {25}}) sel NK manusia dikultur dan distimulasi dengan 10 ng ml−1 IL-12 selama 16 jam di hadapan sel K562, dinormalisasi menjadi MFI IL betina-12 perlakuan. h, i, Frekuensi (h) dan jumlah absolut (i) sel NK limpa pada tikus betina dan jantan yang mengalami gonadektomi (n=18 per kelompok). j,k, Persentase IFN- + (j) dan IFN-MFI (k) yang dinormalisasi dari total sel NK limpa yang diisolasi dari tikus betina dan jantan yang digonadektomi dan dikultur dengan NT atau IL-15 (50 ng ml− 1) dan IL-12 (20 ng ml−1) selama 4 jam (n=12 per grup). Data mewakili 2–4 percobaan independen. Sampel dibandingkan menggunakan uji-t Student dua sisi yang tidak berpasangan dan titik data disajikan sebagai tikus individu dengan rata-rata ± sem (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001; ****P < 0,0001). Nilai P spesifiknya adalah sebagai berikut: b=0.0002; c=0.006; d=0.0036; e=0.0013; f=0.04; g=0.03; jam <0,0001; saya=0.0006; j=0.0234; k=0.0019.
Untuk menentukan mekanisme yang mendasari peningkatan jumlah sel NK pada tikus UTXNKD (CD45.2+ ), rasio 1:1 dari tikus chimeric sumsum tulang campuran (mBMC) dengan WT (CD45.1+ ) diproduksi . Enam minggu setelah pemulihan, kami mengamati keunggulan kompetitif yang nyata dari sel UTXNKD (CD45.2+ ) NK perempuan dibandingkan dengan WT pada penerima perempuan (CD451x2 ) setelah transplantasi sumsum tulang (Data Diperluas Gambar. 3b, c). Berbeda dengan sel NK, sel T dari donor yang sama (UTXNKD, CD45.2+ ), yang cukup UTX karena penghapusan UTX spesifik NK, menampilkan rasio injeksi asli (1:1; Gambar Data yang Diperluas .3b,c). Data ini menunjukkan bahwa UTX menekan jumlah sel NK secara intrinsik sel selama pengembangan. Untuk menguji apakah fenotip ini didorong oleh perbedaan proliferasi, kami menganalisis penanda pembelahan sel Ki67 dalam sel NK limpa pada tikus WT: UTXNKD mBMC, disuntikkan dengan rasio 4:1 untuk menormalkan jumlah sel antar genotipe. Paradoksnya, sel UTXNKD NK menampilkan frekuensi sel Ki67+ yang lebih rendah dan menunjukkan pengenceran CFSE yang lebih sedikit sebagai respons terhadap IL-15 (Data Diperpanjang Gambar 3d,e). Hasil ini menunjukkan bahwa jumlah sel NK yang lebih tinggi yang diamati pada tikus UTXNKD bukan disebabkan oleh peningkatan proliferasi. Dengan adanya hasil ini, kami berhipotesis bahwa peningkatan frekuensi sel NK pada tikus UTXNKD (Gambar 3c, d) dapat disebabkan oleh peningkatan kebugaran seluler sel NK tanpa adanya ekspresi UTX. Untuk menguji kemungkinan ini, sel NK limpa WT (CD451x2 ) dan UTXNKD (CD45.2+ ) yang berbeda secara kongenik diberi label dengan Cell Trace Violet (CTV) dan ditransfer ke penerima WT (CD45.1+ ) di a Rasio 1:1 (Data Diperluas Gambar 3f). Pada hari ke 7 setelah transfer, populasi yang ditransfer condong ke arah sel UTXNKD NK di limpa penerima (Gambar 3e, f), menunjukkan penekanan UTX sel-intrinsik terhadap homeostasis sel NK dewasa. Perbedaan ini bukan disebabkan oleh perubahan proliferasi, karena pengenceran CTV oleh kedua populasi yang ditransfer minimal pada hari ke 7 setelah transfer (Data Tambahan Gambar 3g). Untuk menguji apakah UTX menekan homeostasis sel NK melalui regulasi apoptosis, kami membandingkan ekspresi caspase 3 yang terpecah dalam sel NK yang diurutkan yang diinkubasi dengan IL-15 saja atau dengan IL-15 dan penginduksi apoptosis, Nutlin{{42 }}a29. Ekspresi UTX yang lebih rendah berkorelasi dengan penurunan sel caspase 3+ NK yang dibelah dengan adanya pengobatan IL-15 dosis rendah dan Nutlin-3a (Gbr. 3g,h). Selain itu, sel NK jantan juga menunjukkan penurunan frekuensi pembelahan sel NK caspase 3+ yang sederhana namun signifikan sebagai respons terhadap Nutlin-3a dibandingkan dengan sel NK betina, yang juga bertahan pada tikus yang mengalami gonadektomi (Data Tambahan Gambar 3h–k). Selain itu, regulasi apoptosis dan kelangsungan hidup sel NK bergantung pada tingkat ekspresi relatif Bcl-2 (faktor anti-apoptosis)30, yang dapat dilawan oleh Bim (faktor pro-apoptosis)31. Sel UTXNKD NK menunjukkan peningkatan ekspresi protein intraseluler Bcl-2 dan sedikit peningkatan Bim (Gambar 3i,j dan Extended Data Gambar. 3l) dibandingkan dengan sel WT NK. Hal ini menghasilkan peningkatan rasio Bcl-2:Bim yang signifikan dalam sel UTXNKD NK (Gbr. 3k). Sel NK pria juga menunjukkan peningkatan signifikan dalam rasio Bcl-2:Bim (Gambar 3l), yang bertahan setelah gonadektomi (Gambar 3m). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa perubahan level UTX mungkin mendasari perbedaan jenis kelamin dalam kebugaran sel NK melalui regulasi ekspresi Bcl-2.
Gambar 2|UTX terkait-X menampilkan ekspresi gen dimorfik seksual yang tidak bergantung pada hormon seks.a Ekspresi gen pelarian XCI yang dinormalisasi menggunakan database DICE Data RNA-seq pada sel NK yang diurutkan dari manusia perempuan (n=36) versus laki-laki (n {{4 }}) dinormalisasi menjadi perempuan. b, Ekspresi gen pelarian XCI yang dinormalisasi dengan PCR kuantitatif dengan transkripsi terbalik (RT – qPCR) dalam sel NK limpa dari tikus betina versus jantan (C57BL/6; umur 8 minggu, n=5 per kelompok). Gen diurutkan berdasarkan peningkatan perubahan lipatan antara betina dan jantan dari kiri ke kanan. c,d, Histogram representatif (c) dan MFI (d) yang dinormalisasi dari ekspresi protein UTX dalam sel NK limpa dari tikus betina versus jantan yang naif dengan flow cytometry, dinormalisasi menjadi MFI tikus betina (C57BL/6; berusia 8 minggu; n { {12}} per grup). e, Ekspresi relatif Kdm6a (UTX) oleh RT-qPCR sel NK limpa terisolasi yang dinormalisasi menjadi wanita (n=6 per kelompok). f,g Histogram representatif (f) dan MFI UTX relatif (g) sel NK berdasarkan aliran sitometri dari limpa tikus betina dan jantan yang digonadektomi (n=6 per kelompok) dinormalisasi menjadi betina. Sampel dibandingkan menggunakan uji-t Student dua sisi yang tidak berpasangan dan titik data disajikan sebagai tikus individu dengan rata-rata ± sem (*P < 0.{{20}}5; **P < 0.01; ***P < 0,001). Nilai P spesifiknya adalah sebagai berikut: a < 0,001; b: Ddx3x=0.03, Kdm5c=0.0017, Eif2s3 = 0.0113, Kdm6a=0.000087; d=0.003; e=0.008; g=0.0029).
UTX meningkatkan fungsi efektor sel NK
Karena sel NK laki-laki menunjukkan penurunan produksi IFN (Gambar 1d, e) tidak tergantung pada hormon gonad (Gambar 1j, k), kami selanjutnya berusaha untuk menentukan apakah fenotip ini diatur oleh tingkat UTX. Setelah stimulasi sitokin, frekuensi dan jumlah absolut sel penghasil IFN- -(Gambar 4a dan Gambar Data Diperluas. 4a,b) serta IFN-MFI (Gambar 4a) serupa antara WT jantan dan UTXHet NK betina sel. Produksi IFN- oleh sel UTXHet NK betina merupakan perantara antara sel WT betina dan sel UTXNKD NK betina (Gambar 4a dan Gambar Extended Data. 4a,b). Tren ini juga diamati dengan membandingkan akumulasi IFN sel NK dengan ELISA (Gambar 4b). Selain itu, fenomena ini tidak spesifik untuk IFN-, karena produksi faktor perangsang koloni granulosit-makrofag (GM-CSF), sebuah molekul efektor NK pro-inflamasi, juga berkurang dengan menurunnya jumlah salinan UTX dalam sel NK wanita (Gbr. 4c ).
Selain produksi sitokin, aktivitas sitolitik sel NK sangat penting untuk pertahanan antivirus33 dan antitumor34. Untuk menilai perbedaan jenis kelamin dalam sitotoksisitas sel NK, kami melakukan uji pembunuhan dengan sel MC38 yang kekurangan histokompatibilitas kompleks (MHC) kelas I sebagai target. Pada efektor 4: 1: rasio target, sel WT NK jantan menunjukkan lisis sel target yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan WT betina (Gambar 4d), yang dipertahankan pada tikus yang digonadektomi (Data Diperpanjang Gambar 4c). Gangguan pembunuhan sel target oleh sel NK laki-laki bukan disebabkan oleh perbedaan degranulasi, karena kadar CD107a serupa antara sel NK perempuan dan laki-laki (Data Diperpanjang Gambar 4d, e). Namun, laki-laki menghasilkan tingkat molekul sitotoksik perforin dan granzim B yang jauh lebih rendah sebagai respons terhadap ligasi reseptor pengaktif IL-15 dan anti-NK1.1 (Data Diperpanjang Gambar 4d,e). Khususnya, sel UTXHet dan WT NK jantan menunjukkan kapasitas membunuh yang serupa (Gambar 4d), yang merupakan perantara antara sel WT betina dan UTXNKD NK (Gambar 4d). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa UTX meningkatkan sitotoksisitas sel NK dengan cara yang bergantung pada dosis.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Mempertimbangkan efek kehilangan UTX yang diamati pada fungsi efektor sel NK, kami memeriksa apakah tikus UTXNKD lebih rentan terhadap infeksi virus. Produksi IFN- dan GM-CSF yang cepat sangat penting untuk pengendalian antivirus yang dimediasi sel NK20. Yang mengejutkan, tikus UTXNKD dengan cepat menyerah pada infeksi (n=3/8 selamat) setelah ditantang dengan dosis MCMV yang subletal (Gbr. 4e). Selain itu, sel NK limpa yang kekurangan UTX menunjukkan cacat yang nyata pada produksi IFN- dan produksi granzim B dalam total sel NK pada hari ke 1,5 setelah infeksi (Gambar 4f dan Gambar Data Tambahan 4f,g). Selain itu, cacat serupa dalam produksi IFN- oleh UTXNKD diamati di semua subset maturasi (Data Diperpanjang Gambar 4h), yang melibatkan UTX dalam mengendalikan produksi IFN- dengan cara yang tidak bergantung pada maturasi. Untuk mengkonfirmasi apakah dosis ekspresi UTX dalam sel NK dewasa berhubungan dengan produksi IFN- selama infeksi virus in vivo, kami menghasilkan tikus transgenik untuk mencapai penghapusan UTX yang diinduksi tamoxifen (Kdm6afl/fl Rosa26ERT2CRE+, selanjutnya disebut sebagai iUTX−/ −;Data Tambahan Tabel 1). tikus mBMC diproduksi dengan campuran WT (CD45.1+ ) 1:1 dan iUTX−/− (CD45.2+ ) untuk membatasi penghapusan UTX pada kompartemen hematopoietik. WT: tikus iUTX−/− mBMC diobati dengan tamoxifen segera sebelum infeksi MCMV untuk mengurangi ekspresi UTX (Gbr. 4g). IDX−/− (CD45.2+ ) Sel NK menghasilkan lebih sedikit IFN- dibandingkan dengan sel WT (Gbr. 4h dan Extended Data Gambar. 4i). Pemberian tamoxifen pada tikus WT:iUTX−/− mBMC menghasilkan tingkat kehilangan protein UTX yang berbeda dan menunjukkan korelasi positif yang signifikan antara kadar UTX intraseluler dan produksi IFN pada hari ke 1,5 setelah infeksi (Gbr. 4i). Hasil ini menunjukkan bahwa tingkat UTX sel-intrinsik dalam sel NK dewasa mengatur produksi molekul efektor dan perlindungan selanjutnya terhadap infeksi MCMV.
Gambar 3|UTX menekan kebugaran sel NK. a,b, Frekuensi (F dan M WT: n=12; F UTXHet: n=16; a) dan bilangan absolut (F WT: n=6; M WT: n {{ 4}}; F UTXHet: n=9; b) sel NK di limpa tikus betina (F) WT, jantan (M) WT dan F UTXHet. c,d, Frekuensi (WT: n=12; UTXHet: n=16; UTXNKD: n=6; c) dan bilangan absolut (WT: n=8; UTXHet: n {{10}}; UTXNKD: n=6; d) sel NK di limpa tikus F WT, UTXHet dan UTXNKD. e, Plot kontur representatif dari sel NK WT (CD451x2 ) dan UTXNKD (CD45.2+ ) yang berbeda secara kongenik ditransfer ke penerima WT (CD45.1+ ) dengan rasio 1:1 sebelum injeksi (kiri) dan pada hari ke 7 setelah transfer (kanan). f, Frekuensi sel WT dan UTXNKD pada limpa mencit penerima sebelum injeksi dan hari ke 7 setelah transfer (n=6). g,h, Histogram representatif (g) dan persentase (h) sel caspase 3+ NK yang dibelah dari tikus WT, UTXHet, dan UTXNKD betina yang dikultur dengan IL-15 (5 ng ml−1) dan salah satunya dimetilsulfoksida (DMSO; F WT: n=7; F UTXHet: n=11; F UTXNKD: n=6) atau 2,5 μM Nutlin-3a (F WT: n { {33}}; F UTXHet: n=7; F UTXNKD: n=3) selama 24 jam. i – k, Bcl-2 MFI (i) yang dinormalisasi, Bim MFI (j), dan Bcl-2:Bim MFI rasio (k) dalam sel NK limpa dari tikus WT dan UTXNKD betina (n {{ 39}}). l,m, Bcl{{40}}:Rasio Bim MFI dalam sel NK limpa dari tikus WT betina dan WT jantan (n=6; l) dan tikus betina dan jantan yang mengalami gonadektomi (n {{ 42}};m). Data mewakili 2–4 percobaan independen. Sampel dibandingkan menggunakan analisis varians satu arah biasa (ANOVA; a – d), ANOVA dua arah dengan koreksi Tukey untuk beberapa perbandingan (h), atau uji t Student dua sisi yang tidak berpasangan (f, i – m). Titik data adalah tikus individu dengan rata-rata ± sem (NS, tidak signifikan; *P < 0.05; **P < 0.01; * **P < 0.001; ****P < 0,0001). Nilai P spesifiknya adalah sebagai berikut: a: F WT versus M WT=0.0201, M WT versus UTXHet=0.989, F WT versus UTXHet=0.0327, WT versus UTXNKD { {63}}.001; b: F WT versus M WT=0.0320, M WT versus UTXHet < 0.99, F WT versus UTXHet=0.0029, WT versus UTXNKD=0.001; c: WT versus UTXHet=0.0375, UTXHet versus UTXNKD dan WT versus UTXNKD < 0,0001; d: WT versus UTXHet=0.0191, UTXHet versus UTXNKD=0.0278, WT versus UTXNKD=0.001; f: Pra-injeksi=0.3304; hari 7=0.001918; h: DMSO < 0,0001, Nutlin-3a–F WT versus F UTXHet=0.0048, istirahat < 0,0001; saya < 0,0001; j=0.0004; k=0.0025; aku=0.0115; m=0.0227.
UTX mengatur sel NK dengan cara yang tidak bergantung pada demetilase
Sebagai histone demethylase, UTX dapat mengontrol homeostasis sel NK dan program ekspresi gen efektor dengan mengkatalisis penghapusan gugus metil dari histone trimetilasi H3 Lys27 (H3K27me3; tanda histone yang represif) untuk menyiapkan kromatin untuk ekspresi gen aktif . Namun, UTX juga memiliki aktivitas demethylase-independen dengan berinteraksi dengan regulator epigenetik dan pengubah kromatin untuk mengoordinasikan ekspresi gen36,37. Untuk mengeksplorasi peran aktivitas demetilase UTX dalam memodulasi homeostasis sel NK dan fungsi efektor, kami memanfaatkan tikus yang mengekspresikan UTX yang tidak aktif secara katalitik (tikus UTX 'demethylase-dead' atau UTXDMD; Tabel Data Tambahan 1) menyimpan p.His1146Ala dan p.Glu1148Ala mutasi titik dalam domain katalitik38. Menariknya, tikus UTXDMD dan WT betina menunjukkan frekuensi yang sama dan jumlah absolut sel NK limpa (Gambar 5a-c), sedangkan tikus UTXNKD menunjukkan peningkatan jumlah sel NK limpa dibandingkan keduanya. Temuan ini menunjukkan bahwa represi UTX terhadap jumlah sel NK tidak bergantung pada demetilase. Selain itu, tidak ada perbedaan yang diamati antara sel WT dan UTXDMD NK dalam kemampuan menghasilkan IFN- sebagai respons terhadap stimulasi sitokin (Gambar 5d-f). Hasil ini menunjukkan bahwa fungsi UTX dalam menahan jumlah sel NK dan meningkatkan produksi IFN tidak bergantung pada demetilase. Selain satu salinan UTX, laki-laki mengekspresikan Kdm6c yang tidak aktif secara katalitik (yang mengkode protein UTY), homolog UTX yang terkait dengan kromosom Y. Kami mengkonfirmasi bahwa UTY hanya diekspresikan dalam sel NK laki-laki dari manusia (Gambar Data Diperluas 5a) dan tikus (Gambar Data Diperluas 5b) dan tidak diubah oleh gonadektomi pada tikus (Gambar Data Diperluas 5b). Seperti dibahas di atas, tidak ada perbedaan yang terlihat dalam jumlah sel NK atau fungsi efektor antara tikus WT jantan (satu salinan UTX dan UTY) dan tikus betina UTXHet (satu salinan UTX) (Gambar 3a,b dan 4a,d), menunjukkan a peran terbatas UTY dalam mengatur homeostasis sel NK dan fungsi efektor. Selain itu, tikus UTXNKD jantan (Kdm6afl/y Ncr1cre+) menunjukkan peningkatan frekuensi sel NK dan angka absolut (Gambar Data Diperluas 5c,d) dan menghasilkan lebih sedikit IFN- (Gambar Data Diperluas 5e–h), dibandingkan dengan kontrol WT jantan, yang mana mencerminkan perubahan yang terlihat pada wanita dengan defisiensi sel NK UTX. (Gambar 3a,b dan 4a,b). Dengan demikian, hilangnya UTX pada sel NK memiliki efek serupa pada wanita dan pria.
UTX mengontrol transkriptom sel NK dengan merombak kromatin
Penelitian terbaru telah mengidentifikasi sirkuit pengatur (regulon) sel NK yang menjadi primadona sel limfoid bawaan untuk respons efektor yang cepat bahkan sebelum aktivasi sel NK 39. Sebagai pengubah epigenetik, UTX dapat mengubah transkripsi dengan mengatur kromatin pada elemen pengatur lokus gen target4{{23} }. Untuk menyelidiki modifikasi yang dimediasi UTX pada aksesibilitas kromatin dan ekspresi gen dalam sel NK, kami melakukan ATAC-seq bersama-sama dengan RNA-seq massal pada WT yang dimurnikan (CD45.1+ ) dan UTXNKD (CD45.{{ 9}} ) Sel NK dari 4:1 WT: tikus mBMC UTXNKD (Data Diperpanjang Gambar 6a). Penggunaan tikus mBMC memungkinkan dilakukannya eksperimen yang dikontrol secara internal dan meminimalkan faktor perancu lingkungan. Analisis komponen utama (PCA) dari data ATAC-seq dan RNA-seq mengungkapkan pengelompokan sampel berdasarkan genotipe (Extracted Data Gambar. 6b). ATAC-seq mengungkapkan 3.569 puncak menurun dan 2.113 puncak meningkat dalam aksesibilitas di UTXNKD dibandingkan dengan sel WT NK (perubahan kali lipat log2 > ±0.5, nilai P yang disesuaikan < 0.05 , tingkat penemuan palsu (FDR) < 0.05; Data Tambahan Tabel 2). Selain itu, RNA-seq mengidentifikasi 701 penurunan dan 554 peningkatan gen dalam UTXNKD versus WT (perubahan kali lipat log2> ±0,5, nilai P yang disesuaikan <0,05, FDR <0,05; Data Tambahan Gambar 6c dan Data Tambahan Tabel 3). Temuan ini menunjukkan perubahan besar pada lanskap kromatin dan transkriptom sel NK tanpa adanya UTX.
tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Analisis integratif ATAC-seq dan RNA-seq mengidentifikasi 395 gen yang dapat diakses secara berbeda dan diekspresikan dengan korelasi positif yang signifikan (korelasi Spearman: R=0.62, P <2.2 × 10−16) antara rata-rata log2 kali lipat perubahan puncak ATAC-seq dan log2 kali lipat perubahan ekspresi RNA-seq (Extracted Data Gambar. 6d). Pengelompokan fuzzy c-means dari kumpulan data ATAC-seq dan RNA-seq mengidentifikasi enam cluster utama yang secara signifikan menurun (cluster 1, 2, 3 dan 6) atau meningkat (cluster 4 dan 5) tidak dapat diaksesnya (Gbr. 6a) dan ekspresi (Gbr. 6b) dalam sel UTXNKD NK. Untuk analisis pengayaan fungsional, g: Profiler digunakan untuk menganalisis kelompok gen yang diekspresikan secara berbeda yang diidentifikasi oleh RNA-seq (Gambar 6c). Jalur utama seperti proses sistem kekebalan tubuh, produksi sitokin, produksi IFN, aktivasi limfosit dan proses efektor imun dikaitkan dengan penurunan ekspresi pada UTXNKD (klaster 1, 2, 3 dan 6; Gambar 6c). Sementara itu, jalur seperti proses perkembangan, proses biosintesis dan proses metabolisme secara signifikan dikaitkan dengan peningkatan ekspresi di UTXNKD (cluster 4 dan 5; Gambar 6c). Sebagai catatan, analisis gen jalur kematian sel mengungkapkan banyak gen diekspresikan secara berbeda (Extracted Data Gambar. 6e). Khususnya, ekspresi gen anti-apoptosis Bcl2 meningkat, sedangkan gen pro-apoptosis Casp3 menurun (Data Diperpanjang Gambar 6e). Secara kolektif, temuan ini berimplikasi pada hilangnya hasil UTX dalam modifikasi aksesibilitas kromatin dan ekspresi gen yang terkait dengan homeostasis sel NK dan fungsi efektor.
Gambar 4|UTX meningkatkan fungsi efektor sel NK dan diperlukan untuk bertahan hidup melawan infeksi virus. Persentase IFN- + dan IFN-MFI yang dinormalisasi dari sel NK dari WT betina (n=8), WT jantan (n=8), UTXHet betina (n=12) dan tikus UTXNKD betina (n=6) tanpa pengobatan (NT) atau IL-15 (5{{70}} ng ml−1) dan IL{{1{{8{ {82}}}}}} (20 ng ml−1) selama 4 jam, dinormalisasi menjadi MFI pengobatan IL-15/IL-12 wanita. konsentrasi b,c, IFN- (b) dan GM-CSF (c) diukur dengan ELISA dalam supernatan dari WT betina (n=4), UTXHet (n=5) dan UTXNKD (n {{2 0}}) sel NK dengan NT atau IL-12 (20 ng ml−1) dan IL-18 (1{{1{{1{{115} }8}}4}} ng ml−1) selama 4 jam. d, Lisis spesifik sel MC38 (target) yang kekurangan MHCI oleh WT betina (n {{30}}), WT jantan (n=8), UTXHet betina (n=12 ) atau sel UTXNKD (n=6) NK (efektor) betina selama 16 jam pada rasio efektor: target 4:1, dinormalisasi menjadi lisis oleh WT betina. e, kurva kelangsungan hidup Kaplan – Meier dari tikus WT dan UTXNKD yang terinfeksi MCMV (n=8). Uji Mantel–Cox (P=0.0093). f, Persentase IFN- + (n=14), IFN-MFI yang dinormalisasi (n=14) dan granzyme B (GzmB) MFI (n=8) relatif terhadap WT di limpa Sel NK pada D1.5 setelah infeksi MCMV pada tikus mBMC 4:1 WT:UTXNKD. g, Skema 1:1 WT (CD45.1+ ) dan iUTX−/− (CD45.2+ ) sumsum tulang (BM) ditransfer ke inang yang kekurangan busulfan dan diobati dengan 1 mg tamoxifen selama 3 d sebelum infeksi MCMV. h, Persentase IFN- + dan IFN-MFI sel NK yang dinormalisasi dari 1:1 WT:iUTX−/− mBMC tikus pada D1.5 setelah infeksi MCMV, dinormalisasi ke WT (n=6). i, Korelasi Pearson dua sisi dari IFN- versus UTX MFI sel NK (n=12; r 2=0.775; P <0.0001). Data mewakili 2–3 percobaan independen. ANOVA dua arah (a – c), ANOVA satu arah dengan koreksi Tukey untuk beberapa perbandingan (d), atau uji-t Student dua sisi berpasangan (f,h) digunakan. Titik data adalah tikus individu dengan rata-rata ± sem *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001; ****P <0,0001. Nilai P spesifik: a: F WT versus M WT=0.0027, F WT versus F UTXHet dan F WT versus F UTXNKD < 0.0001, M WT versus F UTXHet=0.269, F UTXHet versus F UTXNKD=0.0007; b: WT versus UTXHet=0.0037, UTXHet versus UTXNKD=0.0011, WT versus UTXNKD < 0,0001; c: WT versus UTXHet=0.0026, UTXHet versus UTXNKD=0.0349, WT versus UTXNKD < 0,0001; d: F WT versus M WT=0.0005, F WT versus F UTXHet dan F WT versus F UTXNKD < 0,0001, M WT versus F UTXHet=0.1616, F UTXHet versus F UTXNKD {{112 }}.0439; f: %IFN- + < 0,0001, IFN- MFI=0.0024, GzmB=0.0032; g: %IFN- + < 0,0001, IFN- MFI=0.0018. PI, pasca infeksi.
Gambar 5|UTX mengontrol homeostasis sel NK dan produksi IFN yang tidak bergantung pada aktivitas demetilase. a – c, Plot kepadatan representatif (a), frekuensi (b), dan jumlah absolut (c) sel NK di limpa tikus betina WT, UTXDMD, dan UTXNKD (n=5 per kelompok). d – f, Plot kontur representatif (d), persentase IFN- + (e), dan IFN-MFI yang dinormalisasi (f) sel WT, UTXDMD, dan UTXNKD NK betina (n=5 per grup) dinormalisasi ke WT. Data mewakili 2–3 percobaan independen. Sampel dibandingkan menggunakan ANOVA satu arah dengan koreksi Tukey untuk beberapa perbandingan. Titik data disajikan sebagai tikus individu dengan rata-rata ± sem *P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001. Nilai P spesifiknya adalah sebagai berikut: b: WT versus UTXDMD=0.7353, WT versus UTXNKD dan UTXDMD versus UTXNKD < 0,0001; c: WT versus UTXDMD=0.4888, WT versus UTXNKD dan UTXDMD versus UTXNKD < 0,0001; e: WT versus UTXDMD=0.855, WT versus UTXNKD=0.0030, UTXDMD versus UTXNKD=0.0380; f: WT versus UTXDMD=0.1382, WT versus UTXNKD=0.0079, UTXDMD versus UTXNKD=0.0166.
Mempertimbangkan perbedaan genom dalam aksesibilitas dan ekspresi gen yang kami amati oleh ATAC-seq dan RNA-seq, kami juga mengeksplorasi efek langsung yang dimediasi UTX. Kami melakukan CUT&Tag anti-UTX yang diikuti dengan pengurutan, memungkinkan deteksi daerah DNA yang terikat pada UTX menggunakan metode imunopresipitasi berbasis antibodi41. CUT&Tag Anti-UTX pada sel WT dan UTXNKD NK yang dimurnikan mengungkapkan 5.746 puncak terikat UTX (FDR < 0.01, nilai P yang disesuaikan < 0.05; Gbr. 6d dan Data Tambahan Tabel 4). PCA dari data ATAC-seq dan RNA-seq mengungkapkan pengelompokan sampel berdasarkan genotipe (Extracted Data Gambar. 6f). Kami mengidentifikasi 191 gen yang terikat UTX, dapat diakses secara berbeda oleh ATAC-seq dan diekspresikan secara berbeda oleh RNA-seq (Gambar 6d). Dalam 191 gen ini, sebagian besar puncak yang terikat UTX terletak di daerah promotor (20,58%), intronik (46,94%) dan intergenik (27,4%) (Gambar 6e). Gen penting yang terlibat dalam homeostasis sel NK (Bcl2 dan Thy1; Gambar 6f) dan fungsi efektor (Ifng dan Csf2) terikat dengan UTX, dapat diakses secara berbeda dan diekspresikan secara berbeda (Gambar 6g). Selain itu, dari 191 gen yang terikat UTX, 140 gen mengalami penurunan ekspresi, sedangkan 51 gen sisanya meningkat (Data Tambahan Tabel 3) menguatkan laporan sebelumnya dalam sel T bahwa UTX berfungsi dalam mengaktifkan dan menekan transkripsi gen43. Analisis jalur pengayaan pada 191 gen yang terikat UTX ini menunjukkan penurunan respons inflamasi, pensinyalan IFN, dan jalur sitotoksisitas sel NK dalam sel UTXNKD NK (Data Diperpanjang Gambar 6g). Sebaliknya, peningkatan proses katabolik seluler dan jalur pensinyalan apoptosis, yang mencakup gen pro-apoptosis dan anti-apoptosis (misalnya, Bcl2, Bbc3 dan Gadd45g), terlihat pada sel UTXNKD NK. Di antara 865 puncak terikat UTX dengan ekspresi bergantung UTX dan perbedaan aksesibilitas kromatin (191 gen unik), analisis regresi linier menunjukkan korelasi positif yang signifikan (Pearson's R=0.5165, P <0.0001) antara kromatin aksesibilitas dan ekspresi gen (Data Diperluas Gambar 6h, i). Wilayah yang ditempati UTX dalam lokus gen Bcl2, Thy1, Ifng, dan Csf2 berhubungan dengan wilayah di mana perbedaan aksesibilitas dan ekspresi gen juga dicatat (Gambar 6f,g). Data ini menunjukkan bahwa UTX mengatur aksesibilitas kromatin dan jalur transkripsi gen yang penting dalam mengatur homeostasis dan fungsi sel NK.
UTX diketahui berinteraksi dengan faktor transkripsi (TF) untuk mengatur transkripsi gen target40. Untuk mengidentifikasi motif TF yang diduga dengan aksesibilitas diferensial karena hilangnya UTX, kami melakukan HOMER (Hypergeometric Optimization of Motif Enrichment)45 analisis motif TF pada puncak yang dapat diakses secara berbeda yang diidentifikasi oleh ATAC-seq (Extended Data Gambar. 6j). TF yang terkait dengan fungsi efektor sel NK (misalnya, Runt (Runx1 dan Runx2)46 dan T-box (Eomes, T-bet, Tbr1 dan Tbx6)47 anggota keluarga) lebih signifikan dan memiliki persentase motif target yang lebih tinggi terkait dengan penurunan aksesibilitas di UTXNKD (cluster 1, 2, 3 dan 6; Extended Data Gambar. 6j). Sebaliknya, TF yang terkait dengan proliferasi, diferensiasi dan metabolisme pada jari seng dan keluarga ETS TF48 lebih signifikan dikaitkan dengan peningkatan aksesibilitas (cluster 4 dan 5; Extended Data Gambar. 6j). Lebih lanjut, analisis motif TF dari puncak terikat UTX oleh UTX CUT&Tag menguatkan hasil ini dengan mengungkap TF yang penting dalam proses efektor sel NK (T-bet, Eomes, Runx1 dan Tbx5) dan program pengembangan (ETS1 dan AP-1; Data yang Diperluas Gambar 6k). Data ini menunjukkan aksesibilitas diferensial dan pengikatan UTX langsung dari motif pengikatan TF penting yang terlibat dalam mengatur kebugaran sel NK dan proses efektor. Analisis ini menunjukkan bahwa UTX memodulasi lanskap kromatin untuk mengontrol ekspresi gen penting dalam homeostasis sel NK (Bcl2 dan Thy1) dan fungsi efektor (Ifng dan Csf2). Pada akhirnya, temuan ini menunjukkan model di mana tingkat ekspresi UTX yang berbeda dapat mendasari dimorfisme seksual dalam sel NK sebagai pengatur pusat kebugaran sel NK dan fungsi efektor (Gambar 6h).
Gambar 6|Perubahan global dalam aksesibilitas dan transkripsi kromatin sel NK yang dimediasi oleh UTX. a – c, 4:1 WT: mBMC UTXNKD dihasilkan dengan mentransfer sumsum tulang WT (CD45.1+ ) dan UTXNKD (CD45.2+ ) ke tikus inang yang kekurangan limfodeplesi (CD451x2 ) dan dibiarkan menyusun kembali untuk 6 minggu. Sel NK limpa diurutkan untuk persiapan perpustakaan ATAC-seq dan RNA-seq (n=3 per kelompok). Grafik garis (kiri) dan peta panas (kanan) dari fuzzy c-means mengelompokkan puncak yang dapat diakses secara berbeda yang diidentifikasi oleh ATAC-seq (a) dan gen yang diekspresikan secara berbeda diidentifikasi oleh RNA-seq (b) sel NK limpa dari WT: tikus UTXNKD mBMC (nilai P yang disesuaikan < 0.05 dan skor keanggotaan > 0.5). Grafik garis menunjukkan mean (garis hitam) dan standar deviasi (pita merah) dari nilai signifikansi log2 ternormalisasi yang berpusat pada mean (FDR dan nilai P yang disesuaikan <0,05). c, Analisis jalur gen RNA-seq fuzzy c-means clustered yang signifikan menggunakan g: Profiler dengan ukuran titik yang menunjukkan −log10 (nilai P; dihitung dengan g: GOSt menggunakan uji satu sisi Fisher). d – g, Anti-UTX CUT&Tag dilakukan dalam sel WT dan UTXNKD NK dan mengidentifikasi 5.746 puncak unik terikat UTX (n=3 per grup). d, diagram Venn menguraikan gen-gen yang dapat diakses secara diferensial (DA) yang tumpang tindih yang diidentifikasi oleh ATAC-seq dan gen-gen yang diekspresikan secara berbeda-beda (DE) yang diidentifikasi oleh RNA-seq. e, Lokasi puncak yang terikat UTX. f,g, Jejak gen representatif dari UCSC Integrated Genome Browser anti-UTX CUT&Tag ('anti-UTX'), ATAC-seq dan RNA-seq dari Bcl2 dan Thy1 (f) dan Ifng dan Csf2 (g); sumbu y menggambarkan jumlah per juta (CPM). h, Skema bagaimana tingkat ekspresi UTX diferensial mendasari dimorfisme seksual dalam komposisi dan fungsi sel NK (kiri). Diagram bagaimana UTX mengatur program gen yang terlibat dalam jumlah sel NK dan fungsi efektor selama homeostasis dan infeksi virus (kanan). Dibuat dengan BioRender.com.
Diskusi
Jenis kelamin adalah variabel biologis yang penting dalam menentukan hasil akhir dari infeksi virus3. Hal ini baru-baru ini diilustrasikan dengan COVID-19, yang mana jenis kelamin laki-laki diidentifikasi sebagai faktor risiko utama penyakit parah5. Selain itu, penelitian terbaru mengaitkan disfungsi sel NK dengan penyakit COVID-19 yang parah49. Mengingat pentingnya sel NK dalam kekebalan antivirus, memahami akar penyebab perbedaan jenis kelamin dalam biologi sel NK akan memiliki implikasi yang luas dalam mengoptimalkan respons efektor endogen. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa ekspresi UTX yang lebih rendah pada sel NK pria berkontribusi terhadap peningkatan jumlah dan penurunan fungsi efektor. UTX sel NK diperlukan untuk mengontrol kebugaran sel NK, memodulasi aksesibilitas motif pengikatan TF, meningkatkan aksesibilitas kromatin di lokus gen efektor, dan menyiapkan sel NK untuk respons cepat terhadap infeksi virus.
Selain sel NK, dimorfisme seksual telah dilaporkan pada sel B, monosit, neutrofil, sel T CD{0}}, dan sel T CD8+25. Meskipun perbedaan jenis kelamin dalam sel kekebalan sebelumnya telah dilaporkan dimediasi oleh hormon seks gonad50-52, masih ada kemungkinan bahwa sebagian dari perbedaan ini juga dapat dikaitkan dengan perbedaan ekspresi UTX. Untuk mendukung kemungkinan ini, defisiensi UTX telah dikaitkan dengan penurunan sel T dan jumlah sel NK T yang invarian53-55; dan transkrip UTX lebih rendah pada sel pria dibandingkan sel wanita untuk beberapa tipe sel imun (sel T CD4+, sel T CD8+, monosit, sel B) yang ditanyakan dalam database DICE56. Studi fenotipik lebih lanjut diperlukan untuk menentukan peran UTX dalam memodulasi perbedaan jenis kelamin pada tipe sel imun lainnya. Fungsi efektor yang dimediasi sel NK meliputi produksi sitokin dan ekspresi molekul sitotoksik. Analisis multi-omik kami menunjukkan bahwa UTX menyiapkan lanskap kromatin sel NK untuk merespons tantangan virus dengan cepat dengan meningkatkan aksesibilitas dan transkripsi lokus efektor. Studi-studi ini mengungkapkan 191 gen (termasuk Ifng dan Csf2) 20,32 yang secara bersamaan terikat oleh UTX, dapat diakses dan diekspresikan secara berbeda. Penurunan produksi sitokin IFN dan GM-CSF serta gangguan kapasitas sitolitik sel NK yang kekurangan UTX mendukung peran UTX dalam meningkatkan fungsi efektor selama peradangan. Namun, mungkin ada konsekuensi tidak langsung tambahan dari regulasi gen yang dimediasi UTX yang memainkan peran penting dalam fungsi efektor sel NK, sebagaimana dibuktikan oleh gen tambahan yang diekspresikan secara berbeda tetapi tidak terikat oleh UTX.
Sebagai demetilase H3K27me3, UTX menyiapkan kromatin untuk ekspresi gen aktif57. Selain aktivitas katalitiknya, UTX berfungsi dalam kompleks multiprotein dengan regulator epigenetik lainnya (misalnya, SWI/SNF, MLL4/5, dan p300) untuk memediasi remodeling kromatin dengan cara yang tidak bergantung pada demetilase36,57. Kami melaporkan fungsi UTX yang tidak bergantung pada demetilase dalam mengatur homeostasis dan program efektor dalam sel NK. Hal ini berbeda dengan peran UTX dalam sel T NK invarian, yang memerlukan aktivitas demetilasenya53. Dengan demikian, mekanisme molekuler yang digunakan UTX untuk berfungsi mungkin bersifat spesifik pada garis keturunan. Untuk mendukung hipotesis ini, UTX telah dilaporkan berinteraksi dengan TF spesifik garis keturunan dalam sel T untuk menargetkan lokus efektor40. Analisis motif HOMER kami mengungkapkan potensi interaksi UTX dengan Runx1, Runx2, Eomes, dan TF lain yang penting untuk fungsi efektor sel NK selama infeksi virus46,47. Selain itu, analisis ini juga menunjukkan interaksi UTX dengan KLF1, KLF5, Sp2, dan TF lain yang terkait dengan proliferasi, diferensiasi, dan metabolisme sel NK48. Selain itu, hasil kami mendukung penelitian yang diterbitkan sebelumnya di mana UTX pada tipe sel lain telah dilaporkan mengoordinasikan respons dengan T-bet, Eomes, dan Tbx5 (ref. 40), ETS1 (ref. 48) dan AP-1 ( ref.58). Terakhir, Runx1 telah terbukti berinteraksi dengan kompleks BRG1 dan SWI/SNF yang diatur UTX46. Namun, karena sifat korelatif dari analisis HOMER, penelitian lebih lanjut dengan ko-imunopresipitasi dan spektrometri massa diperlukan untuk memverifikasi interaksi ini secara eksperimental di tempat. Lebih jauh lagi, sebagai pelarian XCI konstitutif, UTX mungkin memiliki mekanisme spesifik tipe sel melalui dua kemungkinan: (i) kumpulan kofaktor yang ada dan (ii) ketersediaan mitra pengikat epigenetiknya. UTX bergantung pada produk sampingan jalur metabolisme untuk kofaktor (misalnya, Fe(II), -ketoglutarat, dan oksigen) yang penting untuk aktivitas enzimatiknya59. Jadi, bergantung pada keadaan metabolisme, terdapat kumpulan kofaktor berbeda yang dapat diakses untuk fungsi demetilase UTX, sehingga memungkinkan tingkat aktivitas katalitik yang berbeda berdasarkan jenis sel. Selain itu, fungsionalitas UTX mungkin juga bergantung pada aktivitas dan tingkat ekspresi mitra pengikatnya (misalnya, MLL3/4, SWI/SNF, dan p300) yang dikodekan secara autosomal.
manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh
Faktor-faktor yang menentukan kelompok pasien dengan respons imun yang berbeda akan memungkinkan kita beralih dari pendekatan terapeutik 'satu untuk semua' ke paradigma pengobatan presisi. Defisiensi UTX telah dikaitkan dengan sindrom Kabuki dan sindrom Turner60, dua kondisi manusia yang berhubungan dengan disregulasi imun dan peningkatan infeksi. Temuan kami menunjukkan kemungkinan bahwa defisiensi UTX pada sel NK manusia dapat berkontribusi terhadap penurunan pengawasan kekebalan virus yang diamati pada pasien ini, meskipun penelitian di masa depan akan diperlukan untuk mendukung hipotesis ini. Selain itu, pemahaman perbedaan jenis kelamin dalam fungsi sel NK diperlukan untuk memasukkan jenis kelamin sebagai faktor biologis dalam keputusan pengobatan. Pada pria dengan penyakit virus yang parah, misalnya, peningkatan aktivitas UTX sel NK dapat memberikan manfaat terapeutik. Kami berharap bahwa wawasan ini akan menjadi penting tidak hanya dalam kasus infeksi virus tetapi juga pada infeksi lain dan kanker, di mana sel NK juga memainkan peran penting. Temuan ini mungkin juga memiliki implikasi penting untuk terapi seluler adaptif, dimana sel NK merupakan subjek yang sangat menarik61.
Referensi
1. Wilkinson, NM, Chen, HC, Lechner, MG & Su, MA Perbedaan jenis kelamin dalam imunitas. Annu Pendeta Imunol. 40, 75–94 (2022).
2. Klein, SL & Flanagan, KL Perbedaan jenis kelamin dalam respon imun. Nat. Pendeta Imunol. 16, 626–638 (2016).
3. Pardue, M.-L. & Wizemann, TM Menjelajahi kontribusi biologis terhadap kesehatan manusia: apakah seks itu penting? Pers Akademi Nasional https://doi.org/10.17226/10028 (2001).
4. Gianella, S. dkk. Perbedaan jenis kelamin dalam replikasi CMV dan persistensi HIV selama pemberian ART yang menekan. Buka Forum Infeksi. Dis. 7, ofaa289 (2020).
5. Takahashi, T. & Iwasaki, A. Perbedaan jenis kelamin dalam respon imun. Sains 371, 347–348 (2021).
6. Patin, E. dkk. Variasi alami dalam parameter sel imun bawaan terutama didorong oleh faktor genetik. Nat. imunol. 19, 302–314 (2018).
7. Huang, Z. dkk. Pengaruh jenis kelamin dan penuaan pada lanskap sel kekebalan yang dinilai dengan analisis transkriptomik sel tunggal. Proses. Natal Acad. Sains. AS 118, e2023216118 (2021).
8. Talebizadeh, Z., Simon, SD & Butler, ekspresi gen kromosom MG X dalam jaringan manusia: perbandingan pria dan wanita. Genomik 88, 675–681 (2006).
9. Fang, H., Disteche, CM & Berletch, inaktivasi dan pelarian JB X: fitur epigenetik dan struktural. Depan. Pengembang Sel. biologi. 7, 219 (2019).
10. Chen, X. dkk. Perbedaan jenis kelamin pada cacat tabung saraf pada tikus p53-null disebabkan oleh perbedaan komplemen gen X, bukan Y. Dev. Neurobiol. 68, 265–273 (2008).
11. Smith-Bouvier, DL dkk. Peran komplemen kromosom seks dalam bias perempuan pada penyakit autoimun. J.Eks. medis. 205, 1099–1108 (2008).
12. Souyris, M. dkk. TLR7 lolos dari inaktivasi kromosom X dalam sel imun. Sains. imunol. 3,eaap8855 (2018).
13. Hammer, Q., Ruckert, T. & Romagnani, C. Spesifisitas sel pembunuh alami untuk infeksi virus. Nat. imunol. 19, 800–808 (2018).
14. Jeruk, JS Defisiensi sel pembunuh alami. J. Klinik Alergi. imunol. 132, 515–525 (2013).
15. Bukowski, JF, Warner, JF, Dennert, G. & Welsh, RM Studi transfer adaptif menunjukkan efek antivirus dari sel pembunuh alami in vivo. J.Eks. medis. 161, 40–52 (1985).
16. Coklat, MG dkk. Keterlibatan penting dari reseptor aktivasi sel pembunuh alami dalam resistensi terhadap infeksi virus. Sains 292, 934–937 (2001).
17. Welsh, RM, Brubaker, JO, Vargas-Cortes, M. & O'Donnell, CL Respon sel pembunuh alami (NK) terhadap infeksi virus pada tikus dengan defisiensi imun gabungan yang parah. Stimulasi sel NK dan pengendalian infeksi virus yang bergantung pada sel NK terjadi secara independen dari fungsi sel T dan B. J.Eks. medis. 173, 1053–1063 (1991).
18. Bancroft, GJ, Shellam, GR & Chalmer, JE Pengaruh genetik pada augmentasi sel pembunuh alami selama infeksi sitomegalovirus murine: korelasi dengan pola resistensi. J. Imunol. 126, 988–994 (1981).
19. Menees, KB dkk. Perubahan profil sel imun limpa dan fenotip sel NK serta fungsi pada tikus C57BL/6J bergantung pada jenis kelamin dan usia. kekebalan. Berusia 18, 3 (2021).
20. Mujal, AM, Delconte, RB & Sun, JC Sel pembunuh alami: dari fitur bawaan hingga adaptif. Ann. Pendeta Imunol. 39, 417–447 (2021).
21. Loh, J., Chu, DT, O'Guin, AK, Yokoyama, WM & Virgin, HWT Sel pembunuh alami menggunakan perforin dan interferon gamma untuk mengatur infeksi sitomegalovirus murine di limpa dan hati. J.Virol. 79, 661–667 (2005).
22. Orange, JS, Wang, B., Terhorst, C. & Biron, CA Persyaratan interferon-gamma yang diproduksi sel pembunuh alami dalam pertahanan terhadap infeksi sitomegalovirus murine dan peningkatan jalur pertahanan ini dengan pemberian interleukin-12. J.Eks. medis. 182, 1045–1056 (1995).
23. Nakaya, M., Tachibana, H. & Yamada, K. Pengaruh estrogen pada populasi sel penghasil interferon-gamma splenosit tikus. biosci. Bioteknologi. Biokimia. 70, 47–53 (2006).
24. Chiossone, L. dkk. Pematangan sel NK tikus adalah 4-tahap program pengembangan. Darah 113, 5488–5496 (2009).
25. Wainer Katsir, K. & Linial, M. Gen manusia yang lolos dari inaktivasi X diungkapkan oleh data ekspresi sel tunggal. Genomik BMC 20, 201 (2019).
26. Yang, F., Babak, T., Shendure, J. & Disteche, CM Survei global tentang pelarian dari inaktivasi X dengan sekuensing RNA pada tikus. Res Genom. 20, 614–622 (2010).
27. Berletch, JB dkk. Pelarian dari inaktivasi X bervariasi pada jaringan tikus. Genet PLoS. 11, e1005079 (2015).
28. Arnold, AP Empat genotipe inti dan model tikus XY*: pembaruan dampak pada penelitian SABV. ilmu saraf. Bioperilaku. Wahyu 119, 1–8 (2020).
29. Hasegawa, H. dkk. Aktivasi p53 oleh Nutlin-3a, antagonis MDM2, menginduksi apoptosis dan penuaan seluler pada sel leukemia sel T dewasa. Leukemia 23, 2090–2101 (2009).
30. Riggan, L. dkk. Faktor transkripsi Fli1 membatasi pembentukan sel NK prekursor memori selama infeksi virus. Nat. imunol. 23, 556–567 (2022).
31. Min-Oo, G., Bezman, NA, Madera, S., Sun, JC & Lanier, LL Proapoptotic Bim mengatur kontraksi sel NK spesifik antigen dan pembentukan kumpulan sel NK memori setelah infeksi sitomegalovirus. J.Eks. medis. 211, 1289–1296 (2014).
32. Louis, C. dkk. GM-CSF yang diturunkan dari sel NK mempotensiasi arthritis inflamasi dan diatur secara negatif oleh CIS. J.Eks. medis. 217, e20191421 (2020).
33. Bjorkstrom, NK, Strunz, B. & Ljunggren, HG Sel pembunuh alami dalam kekebalan antivirus. Nat. Pendeta Imunol. 22, 112–123 (2022).
34. Smyth, MJ dkk. Perforin adalah kontributor utama kontrol sel NK terhadap metastasis tumor. J. Imunol. 162, 6658–6662 (1999).
35. Van der Meulen, J., Speleman, F. & Van Vlierberghe, P. UTX demethylase H3K27me3 dalam perkembangan normal dan penyakit. Epigenetika 9, 658–668 (2014).
36. Wang, SP dkk. Jaringan regulasi transkripsional UTX-MLL4-p300 secara terkoordinasi membentuk lanskap penambah aktif untuk menghasilkan transkripsi. mol. Sel 67, 308–321 (2017).
37. Gozdecka, M. dkk. Penambah yang dimediasi UTX dan remodeling kromatin menekan leukemogenesis myeloid melalui regulasi kebalikan nonkatalitik dari program ETS dan GATA. Nat. Genet. 50, 883–894 (2018).
38. Wang, C. dkk. UTX mengatur diferensiasi mesoderm sel induk embrionik yang tidak bergantung pada aktivitas demetilase H3K27. Proses. Natal Acad. Sains. AS 109, 15324–15329 (2012).
39. Shih, HY dkk. Akuisisi perkembangan regulasi mendasari fungsi sel limfoid bawaan. Sel 165, 1120–1133 (2016).
40. Miller, SA, Mohn, SE & Weinmann, AS Jmjd3 dan UTX memainkan peran independen demetilase dalam remodeling kromatin untuk mengatur ekspresi gen yang bergantung pada anggota keluarga T-box. mol. Sel 40, 594–605 (2010).
41. Kaya-Okur, HS dkk. CUT&Tag untuk pembuatan profil epigenomik yang efisien pada sampel kecil dan sel tunggal. Nat. Komunitas. 10 Agustus 1930 (2019).
42. Kupz, A. dkk. Kontribusi sel1+ NK-Mu terhadap produksi gamma IFN pelindung selama infeksi Salmonella typhimurium. Proses. Natal Acad. Sains. AS 110, 2252–2257 (2013).
43. Langmead, B. & Salzberg, SL Penyelarasan baca cepat dengan Bowtie 2. Nat. Metode 9, 357–359 (2012).
44. Chen, EY dkk. Enrichr: alat analisis pengayaan daftar gen HTML5 yang interaktif dan kolaboratif. BMC Bioinformatika 14, 128 (2013).
45. Heinz, S. dkk. Kombinasi sederhana faktor transkripsi penentu garis keturunan, elemen pengatur cis utama yang diperlukan untuk identitas makrofag dan sel B. mol. Sel 38, 576–589 (2010).
46. Rapp, M. dkk. Faktor pengikat inti-beta dan faktor transkripsi Runx mendorong respons sel pembunuh alami yang adaptif. Sains. imunol. 2, eaan3796 (2017).
47. Simonetta, F., Pradier, A. & Roosnek, E. T-bet dan eomesodermin dalam pengembangan, pematangan dan fungsi sel NK. Depan. imunol. 7, 241 (2016).
48. Presnell, JS, Schnitzler, CE & Browne, WE Evolusi keluarga faktor transkripsi KLF/SP: ekspansi, diversifikasi dan inovasi pada eukariota. Biol Genom. berevolusi. 7, 2289–2309 (2015).
49. Kramer, B. dkk. Tanda tangan IFN-alpha awal dan disfungsi persisten merupakan ciri khas sel NK pada COVID yang parah-19. Imunitas 54, 2650–2669 (2021).
50. D'Agostino, P. dkk. Hormon seks memodulasi mediator inflamasi yang diproduksi oleh makrofag. Ann. NY Akademik. Sains. 876, 426–429 (1999).
51. Lu, FX dkk. Kekuatan imunitas sel B pada kera rhesus betina dikendalikan oleh sel CD8+ T di bawah pengaruh hormon steroid ovarium. Klinik. Contoh. imunol. 128, 10–20 (2002).
52. Singh, RP & Bischof, DS Hormon seks dan gender mempengaruhi ekspresi penanda sel T regulator pada pasien SLE. Depan. imunol. 12, 619268 (2021).
53. Masak, KD dkk. Pembersihan yang bergantung pada sel pembantu folikel T dari infeksi virus yang persisten memerlukan ekspresi sel T dari histone demethylase UTX. Imunitas 43, 703–714 (2015).
54. Beyaz, S. dkk. Histone demethylase UTX mengatur program epigenetik spesifik garis keturunan dari sel T pembunuh alami invarian. Nat. imunol. 18, 184–195 (2017).
55. Mitchell, JE dkk. UTX meningkatkan pertahanan antivirus yang dimediasi sel CD8+ T namun mengurangi daya tahan sel T. Rep Sel 35, 108966 (2021).
56. Schmiedel, BJ dkk. Dampak polimorfisme genetik pada ekspresi gen sel kekebalan manusia. Sel 175, 1701–1715 (2018).
57. Bosselut, R. Fungsi pleiotropik demetilase H3K27Me3 dalam diferensiasi sel imun. Tren Imunol. 37, 102–113 (2016).
58. Kechin, A., Boyarskikh, U., Kel, A. & Filipenko, M. cutPrimers: alat baru untuk memotong primer secara akurat dari pembacaan sequencing generasi berikutnya yang ditargetkan. J.Komputasi. biologi. 24, 1138–1143 (2017).
59. Hong, S. dkk. Identifikasi UTX dan JMJD3 yang mengandung domain JmjC sebagai demetilase histon H3 lisin 27. Proses. Natal Acad. Sains. AS 104, 18439–18444 (2007).
60. Van Laarhoven, PM dkk. Gen sindrom Kabuki KMT2D dan KDM6A: analisis fungsional menunjukkan peran penting dalam perkembangan kraniofasial, jantung, dan otak. Bersenandung. mol. Genet. 24, 4443–4453 (2015).
61. Rezvani, K. Terapi sel adaptif menggunakan sel pembunuh alami yang direkayasa. Transplasi Sumsum Tulang. 54, 785–788 (2019).