Peran Pengujian Genetik dalam Alur Kerja Diagnostik Pasien Anak Dengan Penyakit Ginjal: Pengalaman Satu Institusi

AbstrakTujuanPenyakit ginjal bawaan merupakan salah satu penyebab utama gagal ginjal pada anak-anak, yang mengakibatkan peningkatan angka kematian, tingginya biaya perawatan kesehatan, dan kebutuhan akan transplantasi organ. Teknologi pengurutan generasi berikutnya dapat membantu diagnosis kondisi monogenik yang langka, memungkinkan pengelolaan medis dan pilihan terapi yang lebih optimal.

Metode Clinical exome sequencing (CES) dilakukan pada kohort yang terdiri dari 191 pasien anak dari satu institusi, diikuti dengan sequencing Sanger untuk mengkonfirmasi varian yang teridentifikasi dan untuk studi segregasi keluarga. Hasil Semua pasien memiliki diagnosis klinis penyakit ginjal: kategori penyakit utama adalah penyakit glomerulus (32,5%), ciliopati (20,4%), CAKUT (17,8%), nefrolitiasis (11,5%) dan penyakit tubulus (10,5%). 7,3% pasien mengalami kondisi lain. Tes genetik konklusif, berdasarkan validasi CES dan Sanger, diperoleh pada 37,1% pasien. Tingkat deteksi tertinggi diperoleh untuk ciliopathies (74,4%), diikuti oleh nefrolitiasis (45,5%), dan penyakit tubular (45%), sedangkan sebagian besar penyakit glomerulus dan CAKUT masih belum terdiagnosis. Kesimpulan Hasil menunjukkan bahwa pengujian genetik yang digunakan secara konsisten dalam alur kerja diagnostik anak-anak dengan penyakit ginjal kronis dapat (i) memastikan diagnosis klinis, (ii) memberikan diagnosis dini dalam kasus kondisi bawaan, (iii) dan penyebab genetik dari penyakit yang sebelumnya tidak diketahui. penyakit dan (iv) program transplantasi yang disesuaikan.

Kata Kunci Pengurutan exome klinis, Pengurutan generasi selanjutnya,Penyakit ginjal, Pengujian genetik, kohort pediatrik

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN CISTANCHEPENYAKIT GINJAL TAHAP AKHIR

Perkenalan

Nefropati pediatrik terdiri dari entitas penyakit yang sangat berbeda dalam hal presentasi klinis, evolusi, dan pilihan terapi [1-4]. Sekitar 30% anak-anak dengan penyakit ginjal kronis (CKD) menderita kondisi monogenik, persentasenya meningkat ketika mempertimbangkan anak-anak dengan penyakit ginjal stadium akhir (ESRD) [5, 6]. Banyak dari anak-anak ini tetap tidak terdiagnosis pada saat transplantasi [4, 6, 7]. Mencapai diagnosis untuk pasien-pasien ini tidak hanya berarti akhir dari perjalanan diagnostik, namun memberikan beberapa keuntungan dalam hal prognosis, penatalaksanaan, dan pengobatan.

Penelitian perintis secara konsisten menunjukkan bahwa penerapan teknik sekuensing generasi berikutnya (NGS) telah secara signifikan meningkatkan hasil diagnostik pada pasien dengan penyakit ginjal bawaan (IKD) [8]. Baru-baru ini, meluasnya penggunaan NGS telah membuat diagnosis genetik tersedia dalam waktu yang wajar dan dengan biaya yang terjangkau, menimbulkan pertanyaan apakah dan kapan NGS harus diintegrasikan dalam alur kerja diagnostik rutin [5].

Diagnosis genetik pada anak-anak sangat penting untuk berbagai aspek. Yang pertama adalah bahwa hal ini mungkin relevan dalam pendekatan klinis terhadap penyakit ini, contoh tipikalnya adalah sindrom nefrotik dimana identifikasi varian struktural pada gen yang berhubungan dengan podosit menentang terapi imunosupresif yang biasanya digunakan secara rutin selama beberapa periode. bulan [9]. Kedua, hal ini mungkin sangat relevan untuk keluarga anak tersebut dan untuk identifikasi anggota lain yang membawa varian yang mungkin menular ke generasi mendatang. Setelah varian patogen diidentifikasi dalam proband, pengujian kaskade terhadap anggota keluarga dan konseling genetik pada pembawa varian mewakili praktik standar dalam genetika klinis [5]. Ketiga, mengetahui varian patogen sangat penting dalam konteks transplantasi di mana donornya mungkin adalah kerabatnya. Memang benar, penting untuk mengesampingkan adanya varian yang sama pada donor organ, dan juga penting untuk mengidentifikasi semua anggota keluarga yang berpotensi membutuhkan transplantasi. Yang keempat adalah bahwa beberapa penyakit memiliki risiko kekambuhan yang tinggi setelah transplantasi organ, seperti glomerulosklerosis segmental fokal [10] atau hasilnya dapat ditingkatkan dengan pilihan transplantasi yang akan dilakukan lebih disesuaikan, seperti pada kasus penyakit primer. hiperoksaluria dimana kombinasi transplantasi ginjal-hati dapat memberikan hasil yang lebih baik [11]. Akhirnya, memiliki diagnosis penyakit yang jelas mungkin berguna bagi pasien untuk mengambil bagian dalam uji klinis dan mendapatkan manfaat dari pilihan pengobatan baru [12, 13].

Pada akhir tahun 2018, melalui kolaborasi antara ahli nefrologi pediatrik dan ahli genetika, kami mulai melakukan tes genetik untuk mengetahui kondisi monogenik yang berpotensi menyebabkan ESRD dan karenanya melakukan transplantasi. Rumah sakit kami adalah yang terbesar di Italia Barat Laut, yang menyediakan saluran pembuangan air dari area berpenduduk sekitar 5 juta orang. Kami memilih jenis analisis "satu ukuran untuk semua", dengan pengurutan eksome klinis, yaitu sekitar 6700 gen yang berhubungan dengan kondisi monogenik, memfokuskan analisis pada panel gen yang disesuaikan dengan kecurigaan klinis dan oleh karena itu membatasi temuan insidentil dan mengurangi waktu untuk analisis urutan.

Secara keseluruhan, dengan menerapkan jalur ini, kami memperoleh hasil diagnostik yang sejalan dengan data yang dipublikasikan, dengan beberapa heterogenitas di antara berbagai kecurigaan klinis, seperti yang diharapkan. Hasil yang diperoleh mengkonfirmasi relevansi pengujian genetik rutin dan konseling dalam alur kerja diagnostik pasien anak yang terkena nefropati. Memang benar, identifikasi varian penyebab sangat penting untuk penatalaksanaan klinisnya, dan berpotensi untuk pemilihan donor hidup yang optimal.

Bahan dan metode

Rekrutmen pasien

Penelitian ini didasarkan pada kohort diagnostik dari 191 pasien anak berturut-turut (usia saat perekrutan <18 tahun), yang direkrut oleh Unit Nefrologi, Dialisis, dan Transplantasi Anak di Rumah Sakit Anak Regina Margherita dan dirujuk ke Layanan Imunogenetika dan Biologi Transplantasi untuk analisis genetik. Semua pasien yang dilibatkan dalam penelitian ini memberikan persetujuan tertulis yang ditandatangani oleh kedua orang tuanya, bila memungkinkan.

Persiapan sampel, pengurutan, dan analisis bioinformatika

Ekstraksi asam nukleat dari darah tepi, analisis kualitas DNA, persiapan perpustakaan, dan pengurutan dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [14]. Data mentah yang diperoleh dari pengurutan dikonversi dalam file FASTQ dan kemudian disejajarkan dengan alat Pengayaan 3.1.0 atau DRAGEN Enrichment (Illumina) dan dipetakan pada manifes TruSight One Expanded v2.0 menggunakan genom Homo Sapiens UCSC GRCh37 sebagai referensi untuk mendapatkan varian nukleotida tunggal, varian nomor salinan (CNV) dan varian struktural file. Untuk identifikasi nomor salinan, data dasar yang dibuat dari pengurutan data dari 5 pasien berbeda, semuanya negatif untuk CNV (sesuai dengan data hibridisasi genom komparatif array) digunakan. Pendekatan ini memungkinkan deteksi CNV bahkan pada kromosom seksual karena kelompok referensi terdiri dari individu perempuan dan laki-laki dan jenis kelamin subjek yang akan dianalisis selalu ditentukan selama fase penyelarasan. Pemanggilan varian dan penentuan prioritas dibuat mengikuti kriteria yang ditentukan. Penyelarasan pembacaan dan cakupan ekson gen yang diinginkan diperiksa dan ditampilkan oleh Integrative Genomics Viewer IGV, tersedia secara gratis dari UC San Diego—Universitas California dan Broad Institute of MIT dan Harvard University—Boston (//software.broadinstitute. organisasi/perangkat lunak/igv/). Varian yang akan dimasukkan dalam laporan genetik akhir diklasifikasikan berdasarkan kriteria American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG).

Pembuatan daftar penyakit gen in silico

Gen yang akan dipertimbangkan untuk identifikasi varian dan penentuan prioritas ditentukan berdasarkan kecurigaan klinis. Daftar gen in silico dihasilkan dengan mencocokkan (i) data dari database yang berbeda, mengkorelasikan genotipe dengan fenotipe (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards), dan (ii) data dari literatur. Daftar gen yang tersedia diperbarui setahun sekali berdasarkan bukti baru adanya hubungan gen-penyakit.

Urutan sanger dan amplifikasi probe bergantung ligasi multipleks (MLPA)

Pengurutan sanger dan/atau analisis MLPA dilakukan untuk memvalidasi varian yang diidentifikasi oleh NGS dan untuk studi segregasi keluarga. Singkatnya, DNA diekstraksi mulai dari alikuot independen kedua dari darah tepi proband dan dari orang tua. Wilayah DNA yang diminati diamplifikasi dengan PCR menggunakan kondisi eksperimental tertentu. Kemurnian dan spesifisitas daerah yang diamplifikasi diperiksa dengan gel agarosa 0.8 atau 1,5%. Produk PCR yang diamplifikasi kemudian disekuensing Sanger menggunakan primer yang sama. Untuk varian PKD1, validasi dilakukan menggunakan PCR jarak jauh diikuti dengan PCR bersarang untuk menghindari inferensi apa pun dari pseudogenes.

Hasil

Penetapan kriteria pengembalian hasil analisis genetik

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gen semuanya terlibat dalam berbagai bentuk penyakit ginjal [14]. Untuk penelitian ini, kami menerapkan analisis dengan subpanel yang berfokus pada kategori kecurigaan klinis tertentu (misalnya, CAKUT, glomerulopati, tubulopati, dll.) dan memprioritaskan kelompok gen tertentu untuk dianalisis. Pendekatan ini membatasi jumlah gen yang dianalisis, menyederhanakan analisis, dan mengurangi jumlah temuan yang tidak disengaja. Hanya ketika, pada akhir bidang analisis dengan panel yang relevan, hasil genetiknya negatif dan (i) fenotip klinisnya tidak ditunjukkan dengan jelas atau (ii) tumpang tindih dengan kategori penyakit yang berbeda, analisis genetik diperluas ke apa yang disebut "daftar lengkap ginjal atau ginjalome", panel super yang terdiri dari semua gen yang termasuk dalam subpanel.

Sebagai langkah pertama, kami menetapkan serangkaian kriteria untuk interpretasi hasil NGS. Setelah melakukan sekuensing exome klinis (CES) dan penyelarasan data, serangkaian analisis ditentukan untuk menyaring varian yang relevan. Secara khusus, berdasarkan kecurigaan klinis, varian yang teridentifikasi disaring berdasarkan daftar gen in silico, spesifik untuk kategori makro penyakit yang berbeda. Varian sinonim yang tidak berdampak pada mekanisme penyambungan atau varian intronik yang tidak terpetakan dalam wilayah penyambungan dikecualikan, dengan hanya mempertimbangkan varian yang tidak sinonim, tidak masuk akal, pergeseran bingkai, dan memengaruhi penyambungan. Sepuluh, hanya varian langka (frekuensi kurang dari 1% pada populasi) dan varian dengan frekuensi alel pada pasien minimal 0.2 dan cakupan minimal 20 pembacaan yang dimasukkan. Varian lainnya diberi anotasi dan dikurasi lebih lanjut berdasarkan (i) cara pewarisan, (ii) konservasi nukleotida, (iii) dampak protein, pemanfaatan database berbeda untuk memeriksa skor, dan (iv) literatur, jika ada. Pada titik ini, varian yang disaring dicantumkan dalam apa yang disebut "laporan teknis". Laporan teknis tersebut diinterpretasikan oleh ahli genetika medis untuk menghasilkan laporan genetik akhir bagi pasien dan keluarganya. Selama konsultasi genetik, studi segregasi keluarga diusulkan untuk (i) mengkonfirmasi varian dalam proband, dan (ii) untuk memasukkan/mengecualikan varian non-penyebab berdasarkan segregasinya dalam keluarga (Gbr. 1).

Dengan mengadopsi kriteria ini, kami dapat mendefinisikan tiga kategori laporan genetik yang berbeda. Pertama, “laporan konklusif” yang mencakup varian patogen (C5) dan kemungkinan patogen (C4). Laporan varian yang tidak diketahui signifikansinya (C3) dianggap konklusif hanya jika sepenuhnya sesuai dengan gambaran klinis dan jika studi segregasi keluarga mengkonfirmasi kemungkinan peran varian tersebut. Kedua, “laporan yang tidak pasti” yang mencakup varian C3 yang diidentifikasi oleh CES yang belum atau tidak dapat divalidasi dalam konteks studi segregasi keluarga atau varian C4/C5 yang tidak sepenuhnya sejalan dengan fenotip klinis. Ketiga, “laporan yang tidak meyakinkan” yang mencakup (i) analisis CES negatif, yang berarti tidak ada varian yang diidentifikasi oleh NGS; (ii) varian tunggal pada gen resesif; dan (iii) varian C3 yang tidak sesuai dengan fenotip klinis, teridentifikasi ketika analisis diperluas ke semua variangen yang berhubungan dengan penyakit ginjal(Gbr. 1).

Fitur utama dari kelompok yang direkrut

Penelitian ini menggambarkan kelompok 191 pasien anak (0–18 tahun) yang secara berturut-turut dirujuk oleh Unit Nefrologi Anak untuk analisis genetik dari November 2018 hingga Mei 2022, dengan rata-rata 50 pasien baru terdaftar setiap tahunnya. . Kriteria pengujian genetik adalah (i) nefropati yang berhubungan dengan riwayat penyakit ginjal keluarga yang positif atau (ii) kecurigaan klinis terhadap kondisi monogenik atau (iii) kebutuhan untuk menyingkirkan kondisi monogenik (seperti dalam kasus sindrom nefrotik, jika dapat membedakan penyakit monogenik versus non-monogenik secara klinis bermakna untuk prognosis dan pengobatan).

Kohort dibagi berdasarkan kecurigaan klinis, dengan mempertimbangkan 6 kategori makro penyakit yang berbeda: kelainan kongenital pada ginjal dan saluran kemih (CAKUT; n=34), ciliopathies (n=39), glomerulopati (n=62), nefrolitiasis (n=22), tauopati (n=20) dan penyakit lain yang juga termasuk fenotipe sindrom (n=14). Kecuali CAKUT dan tubulopati yang menunjukkan distribusi yang sama antara perempuan dan laki-laki, di semua kategori lainnya, terdapat prevalensi subjek laki-laki (Gambar 2a). Ketika melihat usia perekrutan, tidak ada perbedaan distribusi yang signifikan antara kelompok yang berbeda, dengan usia rata-rata berkisar antara 6,7 ​​hingga 10 tahun pada “Penyakit lain” dan glomerulopati. Namun jika dilihat dari median umur, penyakit CAKUT menunjukkan nilai paling rendah (4,6 tahun), sesuai dengan fenotip bawaan. Dari sudut pandang etnis, terlepas dari kategori makro penyakit yang dipertimbangkan, sebagian besar pasien adalah orang Eropa, diikuti oleh orang Afrika, dan hanya sedikit pasien yang berasal dari Asia, Amerika Latin, atau persilangan (Gambar 2b). Di antara kelompok tersebut, hanya 8 pasien yang memiliki orang tua yang berkerabat dekat.

Gambar 1 Saluran analisis data genetik dan kriteria inklusi varian. Representasi skematis dari pipeline analitis yang diadopsi untuk identifikasi varian dan penentuan prioritas, termasuk semua kriteria penyaringan masuk dan penyaringan. Varian yang dihasilkan dimasukkan dalam laporan genetik akhir. Bila memungkinkan, validasi varian dan studi segregasi keluarga dilakukan. Laporan genetik diklasifikasikan sebagai konklusif, tidak pasti, atau tidak konklusif berdasarkan kriteria yang ditunjukkan. Berdasarkan klasifikasi ini, tingkat diagnostik alur kerja pengurutan generasi berikutnya (NGS) kami dihitung. 1 KG: 1000 database genom; Alt fr: frekuensi yang diubah; C3: varian yang signifikansinya tidak diketahui; C4: kemungkinan varian patogen; C5: varian patogen; AR: resesif autosomal

Terakhir, ketika memperhitungkan riwayat penyakit ginjal dalam keluarga dengan mempertimbangkan subjek laki-laki dan perempuan secara terpisah, heterogenitas dalam distribusi antara kasus positif dan negatif terlihat jelas mengingat kategori penyakit yang berbeda. Secara keseluruhan, sebagian besar kelompok yang direkrut dan terlepas dari jenis kelaminnya tidak memiliki riwayat keluarga yang positif, seperti yang ditunjukkan pada CAKUT, glomerulopati, tauopati, dan kelainan ginjal lainnya. Namun, pada ciliopati dan nefrolitiasis, sebagian besar kasus disajikan dengan riwayat keluarga positif dengan distribusi berbeda antara perempuan dan laki-laki (13 kasus dari 22 untuk ciliopati, dan 5 dari 12 untuk nefrolitiasis; Gambar 2c).

Dari sudut pandang klinis, kohort ini cukup heterogen dengan memasukkan berbagai penyakit primer (Gambar 2d). Diantaranya, kecurigaan klinis yang paling sering terjadi adalah penyakit ginjal polikistik (n=27), CAKUT (n=25), sindrom nefrotik (n=19), glomerulosklerosis segmental fokal (FSGS; n =14) dan sindrom Alport (n=13; Gambar 2d).

Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK ALAMI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK INFEKSI GINJAL