The Oral Hypoxia-inducible Factor Prolyl Hydroxylase Inhibitor Enarodustat Menangkal Perubahan Metabolisme Energi Ginjal pada Tahap Awal Penyakit Ginjal Diabetik

Kontak: emily.li@wecistanche.com

pengantar

Divisi Nefrologi dan Endokrinologi, Fakultas Kedokteran Universitas Tokyo Graduate School, Tokyo, Jepang; Beasiswa Penelitian untuk Ilmuwan Muda, Masyarakat Jepang untuk Promosi Ilmu Pengetahuan, Tokyo, Jepang; Laboratorium Penelitian Biologi dan Farmakologi,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Jepang; Departemen Farmakologi Sistem, Fakultas Kedokteran Universitas Tokyo, Tokyo, Jepang; Laboratorium Biologi Sintetis, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Suita, Jepang; dan WPI International Research Center for Neurointelligence, The University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), The University of Tokyo, Tokyo, Jepang.

Hypoxia-inducible factor (HIF) prolyl hydroxylase inhibitors, juga dikenal sebagai stabilisator HIF, meningkatkan produksi eritropoietin endogen dan berfungsi sebagai agen terapi baru terhadap anemia padakronisginjalpenyakit. HIF menginduksi ekspresi berbagai gen yang terkait dengan metabolisme energi sebagai respons adaptif terhadap hipoksia. Namun, masih belum jelas bagaimana pemrograman ulang metabolisme jaringan internal dengan stabilisasi HIF mempengaruhi patofisiologi dariginjal penyakit. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa gangguan metabolisme sistemik seperti hiperglikemia dan dislipidemia menyebabkan perubahan metabolisme ginjal, yang menyebabkan disfungsi ginjal termasuk penyakit ginjal diabetes. Di sini, kami menganalisis efek enarodustat (JTZ-951), penstabil HIF oral, pada metabolisme energi ginjal pada tahap awal penyakit ginjal diabetes, menggunakan tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin dan tikus diabetes yang diinduksi aloksan. Analisis transkriptom mengungkapkan bahwa enarodustat melawan perubahan metabolisme ginjal diabetes. Analisis transkriptom menunjukkan bahwa metabolisme asam lemak dan asam amino diregulasi pada jaringan ginjal diabetes dan diregulasi oleh enarodustat, sedangkan metabolisme glukosa diregulasi. Perubahan simetris ini dikonfirmasi oleh analisis metabolome. Sementara metabolit glikolisis dan siklus asam trikarboksilat terakumulasi dan asam amino berkurang di jaringan ginjal hewan diabetes, gangguan metabolisme ini dikurangi dengan enarodustat. Selanjutnya, enarodustatin meningkatkan rasio glutathione terhadap glutathione disulfide dan menghilangkan stres oksidatif pada jaringan ginjal hewan diabetes. Dengan demikian, stabilisasi HIF menetralkan perubahan metabolisme energi ginjal yang terjadi pada yang baru jadipenderita diabetesginjalpenyakit.

Cistanche sangat baik untuk fungsi Ginjal

Pernyataan Terjemahan

Hypoxia-inducible factor (HIF) prolyl hydroxylase inhibitors (juga dikenal sebagai stabilisator HIF) meningkatkan produksi eritropoietin endogen dan berfungsi sebagai agen terapi baru terhadap anemia padakronisginjalpenyakit. Analisis transkriptom dan metabolom kami dari jaringan ginjal pada tikus dan tikus model diabetes telah mengungkapkan bahwa enarodustat (JTZ-951), penstabil HIF oral, melawan perubahan metabolisme energi ginjal pada tahap awal penyakit ginjal diabetes. Hasilnya memberikan data penting untuk mengekstrapolasi efek penstabil HIF pada metabolisme energi ginjal dalam pengaturan klinis, meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengklarifikasi bagaimana pemrograman ulang metabolisme ginjal ini oleh penstabil HIF mempengaruhi perkembanganpenderita diabetesginjalpenyakit.

Pendahuluan

Hypoxia-inducible factor (HIF) prolyl hydroxylase inhibitors meningkatkan produksi eritropoietin endogen dan berfungsi sebagai agen terapi baru terhadap anemia pada penyakit kronis.ginjalpenyakit. Sel diberkahi dengan mekanisme pertahanan terhadap hipoksia, dan HIF adalah pengatur utama pertahanan ini. Ginjal secara fisiologis terkena hipoksia, dan hipoksia kronis diakui sebagai jalur umum terakhir yang mengarah ke penyakit ginjal stadium akhir. Mempertimbangkan bahwa HIF menginduksi ekspresi berbagai gen yang terkait dengan respons hipoksia, stabilisator HIF mungkin memiliki efek pleiotropik pada perkembanganginjalpenyakitserta perbaikan anemia pada kronisginjalpenyakit. Menariknya, HIF menginduksi ekspresi gen glikolitik dan piruvat dehidrogenase kinase, yang menghambat piruvat dehidrogenase dari penggunaan piruvat untuk bahan bakar siklus asam trikarboksilat mitokondria (TCA).6,7 Pemrograman ulang metabolik ini dari siklus TCA ke glikolisis menekan konsumsi oksigen dan sangat penting untuk adaptasi sel yang terpapar lingkungan hipoksia. Namun, masih belum jelas bagaimana pemrograman ulang metabolik jaringan ginjal dengan stabilisasi HIF mempengaruhi patofisiologiginjal penyakit. Penyakit ginjal diabetik (DKD) adalah penyebab utama penyakit ginjal stadium akhir. Gangguan metabolisme sistemik seperti hiperglikemia dan dislipidemia menyebabkan perubahan metabolisme ginjal, yang menyebabkan disfungsi ginjal termasuk DKD. Studi sebelumnya telah menunjukkan peningkatan fluks metabolisme dan akumulasi glukosa dan metabolit siklus TCA di jaringan kortikal ginjal diabetes, yang mungkin terkait dengan disfungsi mitokondria dan perkembangan DKD. Kami berhipotesis bahwa penstabil HIF dapat membalikkan perubahan metabolisme pada jaringan kortikal ginjal diabetes, mengingat HIF, sebagai respons adaptif terhadap hipoksia, mengurangi fluks metabolisme dalam sel untuk menekan konsumsi oksigen. Jadi, menggunakan analisis transkriptom dan metabolom, kami melakukan studi bukti konsep untuk memahami secara komprehensif bagaimana enarodustat (JTZ-951), penstabil HIF oral, mempengaruhi perubahan metabolisme ginjal yang terjadi pada tahap awal DKD.

HASIL: Enarodustat menginduksi pemrograman ulang metabolik dari siklus TCA menjadi glikolisis di sel tubulus proksimal ginjal

Karena korteks ginjal terutama terdiri dari tubulus proksimal, pertama-tama kami memeriksa efek enarodustat pada fluks metabolisme sel tubulus proksimal ginjal secara in vitro. Pertama, Mito Stress Test (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) dan Glycolytic Rate Assay (Agilent) dilakukan dalam sel HK-2 yang dikultur, garis sel epitel tubulus proksimal manusia (Gambar 1a). Enarodustat secara signifikan mengurangi respirasi mitokondria (siklus TCA) dan meningkatkan glikolisis basal, yang menunjukkan pemrograman ulang metabolik dari siklus TCA menjadi glikolisis (Gambar 1; Gambar Tambahan S1). Kami juga melakukan percobaan menggunakan RNA pengganggu kecil (siRNA) untuk HIF-1 (Gambar 2; Gambar Tambahan S2). HIF-1 knockdown oleh siRNA membalikkan perubahan metabolisme (respirasi basal, respirasi maksimal, kapasitas pernapasan cadangan, dan produksi adenosin trifosfat [ATP]) yang diinduksi oleh enarodustat, yang menunjukkan bahwa pemrograman ulang metabolik terutama melalui HIF-1 stabilisasi (Gambar 2; Gambar Tambahan S2). Aktivitas dehidrogenase piruvat, faktor penting bagi sel untuk menggunakan piruvat sebagai bahan bakar siklus TCA, juga dikurangi oleh enarodustat (Gambar 2f), yang kompatibel dengan pengamatan yang diterbitkan sebelumnya.

Data latar belakang tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin

Dari hasil percobaan in vitro, kami berhipotesis bahwa penstabil HIF dapat mengurangi perubahan metabolisme pada jaringan kortikal ginjal diabetes melalui pemrograman ulang metabolik dari siklus TCA ke glikolisis. Kami pertama-tama memilih tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin (STZ) sebagai model percobaan pembuktian konsep untuk menguji hipotesis yang disebutkan di atas. Dalam model ini, diabetes diinduksi dengan cepat, memungkinkan kita untuk mengamati efek bersih dari diabetes dan penstabil HIF pada metabolisme energi di jaringan ginjal dalam waktu singkat. Protokol penelitian dan data dasar dari percobaan pada tikus diabetes yang diinduksi STZ ditunjukkan pada Gambar 3a. Kami membagi tikus menjadi 3 kelompok: kelompok A (palsu), kelompok B (DKD), dan kelompok C (DKD enarodustat). Glukosa plasma darah, hemoglobin glikosilasi HbA1c, trigliserida, dan kadar kolesterol total pada hari ke-14 meningkat secara signifikan pada kelompok diabetes dibandingkan dengan kelompok A, sedangkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok B dan C (Gambar 3d-g). Meskipun kadar kreatinin plasma tidak berbeda antar kelompok, ekskresi albumin urin meningkat secara signifikan dan glomerulomegali terlihat pada kelompok B dibandingkan dengan kelompok A, dan enarodustat cenderung membalikkan perubahan ini (Gambar 4). Tingkat nitrogen urea darah lebih tinggi pada kelompok diabetes, mencerminkan dehidrasi akibat diabetes. Singkatnya, ginjal tikus yang diobati dengan STZ dalam penelitian kami mewakili tahap awal DKD. Analisis transkriptom dan metabolom dilakukan menggunakan jaringan kortikal ginjal tikus-tikus ini.

Analisis transkriptom jaringan kortikal ginjal

Hasil analisis transkriptom jaringan korteks ginjal ditunjukkan pada Gambar 5 dan 6. Analisis komponen utama dan analisis pengelompokan hierarkis menunjukkan bahwa kelompok A, B, dan C masing-masing dipisahkan menjadi kelompok yang berbeda (Gambar 5a dan b). Gen yang diekspresikan secara berbeda dipilih dengan log2 fold-change (FC) Lebih besar dari atau sama dengan 0.5 dan nilai Q < 0.05.="" ontologi="" gen="" dan="" analisis="" jalur="" kanonik="" mengungkapkan="" bahwa="" gen="" yang="" terkait="" dengan="" metabolisme="" asam="" lemak="" diregulasi="" di="" grup="" b="" dibandingkan="" dengan="" grup="" a.="" sebaliknya,="" gen="" yang="" terkait="" dengan="" metabolisme="" glukosa="" dan="" respons="" hipoksia="" termasuk="" jaringan="" hif-1="" diregulasi="" di="" grup="" c="" dibandingkan="" dengan="" grup="" b="" (gambar="" 5c="" dan="" d).="" kami="" juga="" melakukan="" analisis="" pengayaan="" set="" gen="" (gsea)="" menggunakan="" data="" transkriptomik="" (gambar="" 6,="" tabel="" 1="" dan="" 2).="" set="" gen="" metabolisme="" asam="" lemak="" dan="" asam="" amino="" diregulasi="" di="" grup="" b="" dibandingkan="" dengan="" grup="" a="" (gambar="" 6).="" sebaliknya,="" set="" gen="" ini="" diturunkan="" regulasinya,="" dan="" set="" gen="" metabolisme="" glukosa="" diregulasi="" di="" grup="" c="" dibandingkan="" dengan="" grup="" b,="" menunjukkan="" bahwa="" enarodustat="" membalikkan="" perubahan="" metabolisme="" yang="" disebabkan="" oleh="" diabetes="" (gambar="" 6).="" selain="" itu,="" set="" gen="" siklus="" tca="" diturunkan="" regulasi="" pada="" grup="" c="" dibandingkan="" dengan="" grup="" b="" (tabel="" 2),="" yang="" kompatibel="" dengan="" gagasan="" pemrograman="" ulang="" metabolik="" yang="" diinduksi="" enarodustat="" dalam="" tubulus="" proksimal="" yang="" diamati="" dalam="" penelitian="" in="" vitro="" kami.="" singkatnya,="" enarodustat="" menetralkan="" perubahan="" metabolisme="" ginjal="" diabetes="" dari="" perspektif="">

Analisis metabolisme jaringan kortikal ginjal

Kami mengukur konsentrasi absolut dari 116 metabolit terkait energi dalam jaringan kortikal ginjal tikus (n =4, untuk setiap kelompok) yang dipilih secara acak dari setiap kelompok (Tabel Tambahan S1; Gambar Tambahan S3). Analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) dilakukan untuk menilai signifikansi diskriminasi kelas (Gambar 7). Kami melakukan analisis pengayaan set metabolit (MSEA) menggunakan metabolit dengan PLS-DA variabel penting dalam proyeksi (VIP) skor $1. Perbedaan metabolisme asam amino, seperti glisin, serin, metionin, aspartat, glutamat, arginin, prolin, dan b-alanin antara kelompok A dan B dicatat. Perbedaan metabolisme asam amino juga diamati antara kelompok B dan C. Selain itu, proses metabolisme glukosa, seperti glikolisis dan glukoneogenesis, menunjukkan tren yang berbeda antara kelompok B dan C (Gambar 7).

Visualisasi data transkriptom dan metabolom pada peta jalur metabolisme energi

Kami memvisualisasikan data transkriptom dan metabolom untuk pemahaman yang komprehensif tentang perubahan metabolisme energi (Gambar 8). Glikolisis dan metabolit siklus TCA ditemukan terakumulasi dalam kelompok B dibandingkan dengan kelompok A, yang mungkin disebabkan oleh aliran masuk glukosa yang berlebihan dan peningkatan regulasi metabolisme asam lemak pada DKD. Konsentrasi asam amino berkurang pada kelompok B dibandingkan dengan kelompok A, yang mencerminkan peningkatan regulasi metabolisme asam amino (Gambar 8a). Sebaliknya, akumulasi metabolit glikolisis dihilangkan oleh enarodustat, karena aliran glikolisis yang difasilitasi. Enarodustat juga membalikkan perubahan yang diinduksi diabetes pada metabolit siklus TCA dan asam amino (Gambar 8b). Selain itu, enarodustat mengurangi akumulasi glutathione disulfide (GSSG) di jaringan ginjal diabetes dan dengan demikian menunjukkan rasio glutathione/GSSG yang lebih tinggi, yang menunjukkan bahwa enarodustat meredakan stres oksidatif pada DKD (Gambar 8a dan b). Pengurangan stres oksidatif dikonfirmasi oleh tingkat penanda peroksidasi lipid malondialdehida dalam jaringan kortikal ginjal: enarodustat membalikkan akumulasi malondialdehida dalam jaringan kortikal ginjal diabetes (Tambahan Gambar S4). Singkatnya, integrasi data transkriptom dan metabolom telah menunjukkan bahwa enarodustat melawan perubahan metabolisme energi ginjal yang terjadi pada tahap awal DKD.

Perubahan metabolisme simetris (diabetes vs enarodustat) dikonfirmasi dalam model alternatif

Kami melakukan analisis transkriptom pada tikus diabetes yang diinduksi aloksan, model hewan diabetes lainnya, untuk mengkonfirmasi temuan kami pada model tikus. Protokol studi dan data latar belakang untuk model tikus ditunjukkan pada Gambar 9. Ekskresi albumin urin meningkat secara signifikan pada kelompok B dibandingkan dengan kelompok A, yang dibalikkan oleh enarodustat (Gambar 9d). Selain itu, kami menerapkan 3-analisis dimensi yang komprehensif (Jelas, Koktail Pencitraan Otak/Tubuh yang Jelas, dan Analisis Komputasi [CUBIC]–ginjal)16 untuk memvisualisasikan glomeruli di ginjal. Glomerulomegali terlihat pada kelompok B dibandingkan dengan kelompok A, yang dibalikkan dengan enarodustat (Gambar 9e). Analisis transkriptom jaringan ginjal pada tikus diabetes yang diinduksi aloksan menunjukkan perubahan metabolisme simetris (diabetes vs enarodustat) dengan cara yang sama seperti pada model tikus diabetes yang diinduksi STZ (Gambar 10): metabolisme asam lemak diregulasi oleh diabetes, sedangkan glukosa metabolisme diregulasi oleh enarodustat. Selanjutnya, metabolisme asam amino diregulasi oleh diabetes dan diturunkan regulasi oleh enarodustat. Dengan demikian, enarodustat menetralkan perubahan metabolisme energi ginjal yang terjadi pada tahap awal DKD pada model tikus diabetes yang diinduksi aloksan serta pada model tikus diabetes yang diinduksi STZ.

DISKUSI

Dalam penelitian ini, kami telah menunjukkan bahwa enarodustat (JTZ-951), penstabil HIF oral, melawan perubahan metabolisme energi ginjal yang terjadi pada tahap awal DKD pada model diabetes tikus dan tikus. Analisis transkriptom dan metabolisme telah menunjukkan perubahan metabolisme simetris dalam jaringan ginjal (diabetes vs enarodustat): metabolisme asam lemak dan asam amino diregulasi di DKD, sedangkan enarodustat menurunkan regulasi jalur ini dan tambahan meningkatkan metabolisme glukosa (Gambar 5-10).

Belum sepenuhnya dijelaskan apakah stabilisasi HIF memiliki efek protektif pada patofisiologi DKD atau tidak. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa jaringan ginjal diabetes terkena hipoksia17 dan ekspresi HIF dalam jaringan ginjal diabetes tidak cukup dalam menanggapi kondisi hipoksia mereka, yang sebagian disebabkan oleh stres oksidatif. Stabilisasi HIF oleh kobalt klorida meningkatkan status stres oksidatif dan mengurangi proteinuria dan kerusakan tubulointerstitial pada DKD yang diinduksi STZ.19 Hasil penelitian pada hewan juga menunjukkan bahwa stabilisasi HIF melindungi terhadap perkembangan obesitas,20 meningkatkan sensitivitas insulin,20 dan menurunkan kadar kolesterol serum.21 Hasil ini menunjukkan efek perlindungan stabilisasi HIF dalam pengembangan DKD. Sebaliknya, stabilisasi HIF suprafisiologis oleh penghapusan von Hippel-Lindau dilaporkan menginduksi fibrosis ginjal. Peran stabilisasi HIF dalam perkembangan DKD mungkin bergantung pada konteks mengingat efek pleiotropik HIF dan keberadaan berbagai fenotipe DKD. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengklarifikasi efek bersih dari stabilisasi HIF pada metabolisme energi pada ginjal diabetes. Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa perubahan metabolisme energi terjadi pada DKD. Sas et al.10 menunjukkan peningkatan fluks metabolisme energi dan akumulasi metabolit glukosa dalam jaringan kortikal ginjal diabetes, yang mungkin terkait dengan disfungsi mitokondria. You et al.23 melaporkan bahwa fumarat, suatu metabolit siklus TCA, terakumulasi dalam jaringan ginjal diabetik dan secara langsung berkontribusi pada perkembangan DKD. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa metabolit siklus TCA terakumulasi dalam jaringan ginjal diabetes, yang dibalikkan oleh penghambatan natrium-glukosa cotransporter 2 atau pembatasan kalori.11 Selain itu, Qi et al.24 menunjukkan bahwa enzim dalam jalur glikolitik termasuk piruvat kinase M2 (PKM2), diregulasi pada pasien diabetes tipe 1 tanpa DKD dibandingkan dengan pasien dengan DKD. Aktivasi PKM2 membalikkan akumulasi metabolit glikolisis dan mengembalikan fungsi mitokondria, sebagian dengan meningkatkan fluks glikolitik. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa akumulasi metabolit siklus glikolisis dan TCA dapat mempengaruhi perkembangan DKD, yang dapat dikurangi dengan glikolisis terfasilitasi termasuk PKM2 pengaktifan. Dalam penelitian kami, stabilisasi HIF oleh enarodustat membalikkan perubahan metabolisme energi dan mengurangi akumulasi metabolit siklus glikolisis dan TCA dalam jaringan kortikal ginjal diabetes (Gambar 8). Ekspresi enzim glikolitik termasuk PKM2 juga diregulasi oleh enarodustat (Gambar Tambahan S4B). Selain itu, enarodustat mengurangi akumulasi GSSG dan meningkatkan rasio glutathione/GSSG, yang menunjukkan bahwa enarodustat meredakan stres oksidatif pada DKD (Gambar 8). Pengurangan stres oksidatif yang diinduksi enarodustat ini juga dikonfirmasi oleh perubahan kadar malondialdehida dalam jaringan kortikal ginjal (Gambar Tambahan S4A). Hasil ini menunjukkan bahwa stabilisasi HIF harus memiliki peran protektif pada patofisiologi DKD setidaknya dari perspektif metabolik. Sudah pasti bahwa kita tidak dapat memeriksa apakah pemrograman ulang metabolik dengan stabilisasi HIF memiliki efek langsung pada perkembangan DKD, karena mungkin tidak mungkin untuk membedakan efek bersih dari perubahan metabolisme pada hasil ginjal karena peran pleiotropik HIF. Namun, dalam penelitian kami, ekskresi albumin urin ringan dan kelainan patologis ginjal (glomerulomegali dan penebalan membran basal glomerulus) yang disebabkan oleh diabetes dikurangi oleh enarodustat, terkait dengan normalisasi metabolisme energi ginjal. Kami mengekstraksi gen yang ekspresinya berubah berkorelasi dengan kadar albumin urin (257 probe; 232 gen) dari data microarray dalam model tikus diabetes yang diinduksi aloksan dan melakukan analisis pengayaan jalur (Gambar Tambahan S5). Akibatnya, jalur yang terkait dengan membran mitokondria dan transpor elektron pernapasan diregulasi terkait dengan kadar albumin urin, menunjukkan bahwa beban mitokondria terkait erat dengan ekskresi albumin urin. Dengan demikian, ada kemungkinan bahwa normalisasi metabolik jaringan ginjal diabetes oleh stabilisator HIF dapat mengurangi beban mitokondria dan mengurangi perkembangan DKD. Data kami menunjukkan patofisiologi DKD dari perspektif metabolik sebagai berikut: Hiperglikemia menciptakan kebutuhan energi untuk reabsorpsi glukosa di tubulus proksimal ginjal; dengan demikian, siklus TCA di mitokondria secara paksa diaktifkan untuk memenuhi kebutuhan energi pada tahap awal DKD (upregulasi metabolisme asam lemak dan asam amino). Dan stabilisator HIF dapat mengurangi beban mitokondria ini dengan pemrograman ulang metabolik dari siklus TCA ke glikolisis (penurunan regulasi metabolisme asam lemak dan asam amino dan peningkatan regulasi glikolisis), yang mungkin memiliki peran protektif terhadap perkembangan DKD. Studi lebih lanjut termasuk omics sel tunggal diperlukan untuk mengklarifikasi bagaimana beban mitokondria di jaringan ginjal secara langsung mempengaruhi patofisiologi DKD. Pertanyaan menarik lainnya adalah apakah penstabil HIF secara langsung mempengaruhi penyerapan glukosa di tubulus proksimal. Data in vitro kami menunjukkan bahwa produksi ATP berkurang secara signifikan oleh enarodustat melalui pemrograman ulang metabolik dari siklus TCA ke glikolisis (Gambar 1 dan 2). Mempertimbangkan bahwa ATP diperlukan untuk reabsorpsi glukosa oleh cotransporter 2 natrium-glukosa, kami pertama-tama berhipotesis bahwa reabsorpsi glukosa mungkin dinonaktifkan oleh enarodustat. Namun, kadar glukosa urin tidak berbeda secara signifikan antara kelompok B dan kelompok C pada kedua model hewan (Gambar Tambahan S6). Mungkin, pengurangan produksi ATP oleh enarodustat jauh lebih ringan dalam situasi fisiologis dibandingkan dengan efeknya secara in vitro; dengan demikian, stabilisasi HIF tidak mempengaruhi penyerapan glukosa melalui cotransporter 2 natrium-glukosa, setidaknya dalam percobaan hewan kami. Penelitian kami memiliki 2 keterbatasan. Pertama, kami menggunakan tikus diabetes yang diinduksi STZ dan tikus diabetes yang diinduksi aloksan sebagai model DKD tahap awal dan mengamati efek jangka pendek dari kondisi diabetes. Namun, dalam pengaturan klinis, stabilisator HIF akan diberikan kepada pasien dengan anemia pada DKD stadium akhir. Diperlukan lebih banyak penelitian untuk memahami efek stabilisasi HIF pada perubahan metabolisme ginjal pada DKD tahap akhir. Kedua, penelitian ini tidak memiliki kekuatan statistik yang cukup sehubungan dengan dispersi konsentrasi metabolit dalam data metabolom, sedangkan data transkriptom memiliki kekuatan statistik yang cukup besar untuk memperjelas gambaran keseluruhan metabolisme energi. Karena tidak banyak metabolit menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok, kami melakukan PLS-DA dan memilih metabolit dengan skor VIP PLS-DA Lebih besar atau sama dengan 1 untuk MSEA. Meskipun sulit untuk memverifikasi silang perubahan metabolisme menggunakan data metabolomik saja, hasil analisis metabolom kompatibel dengan data transkriptomik (Gambar 7 dan 8), memberikan dukungan tambahan untuk efek yang diamati dari perubahan transkriptom pada metabolisme energi ginjal. Kesimpulannya, enarodustat (JTZ-951), penstabil HIF oral, melawan perubahan metabolisme energi ginjal pada tahap awal DKD. Studi kami menunjukkan bahwa stabilisasi HIF dapat berfungsi sebagai intervensi potensial yang menargetkan metabolisme energi ginjal yang tidak teratur pada DKD.

METODE

Uji Stres Mito dan Uji Tingkat Glikolitik

Sel-sel HK-2 diunggulkan ke dalam lempeng mikro sumur 96-dengan kepadatan 1 * 10⁴sel / sumur. Keesokan harinya, fluks metabolisme diukur secara real-time oleh Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) menggunakan Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) atau Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent). Konsentrasi glukosa, piruvat, dan glutamin dalam media kultur berturut-turut adalah 10 mmol/l, 1 mmol/l, dan 2 mmol/l.

transfeksi siRNA

Knockdown HIF-1 dilakukan oleh Stealth RNAi untuk HIF1A manusia (HSS104774 [#1] dan HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA Kontrol Negatif Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) digunakan sebagai kontrol negatif.

blotting barat

Antibodi utama yang digunakan untuk pewarnaan adalah antibodi anti-manusia HIF-1 (poliklonal kelinci, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) dan antibodi aktin anti-manusia (poliklonal kelinci, 1:1000; Sigma-Aldrich, St .Louis, MO). Antibodi sekunder adalah antibodi IgG anti-kelinci terkonjugasi peroksidase lobak (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Eksperimen hewan

Tikus Crl: CD (Sprague Dawley) dan tikus Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) diperoleh dari Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Jepang). Semua eksperimen telah disetujui oleh Dewan Peninjau Institusional Universitas Tokyo (nomor persetujuan P17-110). Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman National Institutes of Health (Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium). Protokol penelitian ditunjukkan pada Gambar 3 dan 9.

Analisis transkriptom

Total RNA dari jaringan korteks ginjal diisolasi menggunakan GenElute Mamalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). Total RNA (100 ng) diberi label menggunakan Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) dan kemudian dihibridisasi ke SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (untuk tikus; Agilent) dan SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (untuk mouse), masing-masing. Semua percobaan microarray dilakukan oleh DNA Chip Research Inc. (Tokyo, Jepang). Data mentah diolah dengan paket R limma di Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) untuk melakukan koreksi latar belakang dan normalisasi data menggunakan metode normalisasi kuantil. Efek batch telah dihapus oleh ComBat (Biokonduktor) dalam percobaan tikus. Gen yang diekspresikan secara berbeda ditentukan oleh log2 FC│ Lebih besar dari atau sama dengan 0,5 dan nilai Q <0,05. ontologi="" gen="" dan="" analisis="" jalur="" kanonik="" dilakukan="" menggunakan="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" data="" microarray="" telah="" disimpan="" di="" pusat="" nasional="" informasi="" bioteknologi="" ekspresi="" gen="" omnibus="" sebagai="" seri="" gse131221="" (tikus)="" dan="" gse139317="">

Analisis Pengayaan Gen Set

GSEA adalah metode komputasi yang menentukan apakah serangkaian gen yang ditentukan secara apriori menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dan sesuai antara 2 keadaan biologis. GSEA dilakukan menggunakan GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Jalur dengan tingkat penemuan palsu < 0.25="" dianggap="">

Analisis metabolisme

Pengukuran metabolisme dilakukan oleh Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Jepang). Konsentrasi metabolit dihitung dengan menormalkan area puncak masing-masing metabolit sehubungan dengan area standar internal dan dengan menggunakan kurva standar, yang diperoleh dari 3-kalibrasi titik. Lihat juga Metode Tambahan.

Analisis pengayaan set metabolit

Analisis data metabolomik dilakukan menggunakan platform berbasis web terintegrasi MetaboAnalyst 4.0. PLS-DA dilakukan dan skor VIP terkait dihitung. Metabolit dengan skor VIP PLS-DA Lebih besar atau sama dengan 1 digunakan untuk MSEA.

Kuantifikasi area glomerulus pada patologi ginjal

Kami secara acak mengambil 3 gambar patologis dari gambar pewarnaan asam-Schiff periodik masing-masing sampel dan mengukur setiap area glomerulus masing-masing menggunakan Fiji (distribusi ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

CUBIC-ginjal

Pencitraan 3-dimensi glomeruli yang komprehensif di jaringan ginjal dilakukan menggunakan CUBIC menurut makalah kami sebelumnya. Singkatnya, ginjal tikus tetap direndam dalam CUBIC-L untuk delipidasi dan kemudian mengalami pewarnaan imunofluoresen. Akhirnya, indeks bias dicocokkan dengan penempatan sampel di CUBIC-R plus. Gambar 3D-dimensi komprehensif dari ginjal transparan diperoleh dengan mikroskop fluoresensi lembar cahaya yang dibuat khusus (MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Jepang). Antibodi utama yang digunakan untuk pewarnaan adalah antibodi anti-podocin (poliklonal kelinci, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Antibodi sekunder adalah Alexa Flour 555- conjugated keledai anti-kelinci IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Analisis statistik

Untuk beberapa perbandingan, {{0}}analisis varians yang diikuti oleh tes perbandingan ganda Tukey post hoc, jika sesuai, diterapkan. Semua analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). P <0,05 dianggap="" signifikan="" secara="" statistik.="" data="" disajikan="" sebagai="">

PENYINGKAPAN

MN telah menerima honorarium, biaya konsultasi, atau dana penelitian dari KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim , dan Alexion. TT telah menerima hibah penelitian dari JT. Enarodustat (JTZ-951) disediakan oleh JT, Tokyo, Jepang. EAS dan HRU adalah salah satu penemu paten yang dimiliki oleh RIKEN. Bagian dari penelitian ini dilakukan bekerja sama dengan Olympus Corporation dan perangkat lunak sejenis yang didukung oleh Bitplane. Penulis lain menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.

UCAPAN TERIMA KASIH

Kami berterima kasih kepada Dr. Shuhei Yao dan Dr. Shinji Tanaka atas diskusi yang berharga. Kami juga berterima kasih kepada Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda, dan Ms. Kahoru Amitani atas dukungan teknisnya. Pekerjaan ini sebagian dilakukan di bawah dukungan Pusat Sains Isotop, Universitas Tokyo. Karya ini didukung oleh Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellow (JSPS KAKENHI grant 19J11928 to SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI grant 18H02824 to MN ), Hibah Penelitian Ilmiah (C) (hibah JSPS KAKENHI 17K09688 kepada TT), dan Hibah Bantuan Penelitian Ilmiah Bidang Inovatif (hibah KAKENHI 26111003 kepada MN).