Regulator Epigenetik BRD4 Terlibat dalam Respon Peradangan yang Dipicu Kadmium pada Ginjal Tikus

untuk informasi lebih lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong dkk

Cistanche tubulosa mencegah penyakit ginjal, klik di sini untuk mendapatkanproduk dan Cistanche DHT

ABSTRAK

Kadmium (Cd) telah digambarkan sebagai pemicu inflamasi potensial sementara semakin banyak bukti menunjukkan bahwa peradangan yang tidak tepat merupakan faktor yang berkontribusi terhadapcedera ginjal. Oleh karena itu, penelitian tentang respons inflamasi yang dipicu Cd sangat penting untuk menjelaskan mekanisme nefrotoksisitas yang diinduksi Cd. Bromodomain-mengandung 4(BRD4) adalah regulator epigenetik penting yang terlibat dalam perkembangan banyak penyakit inflamasi, tetapi peran regulasinya dalam memicu Cdinflamasitanggapan masih harus diklarifikasi. Di sini, kami menemukan bahwa pengobatan dengan Cd pada tikus Sprague-Dawley (2 mg/kg BB, ip, 5 hari berturut-turut) dan pada tikussel ginjalline (NRK{{0}}E, 0–10 M, 12 h) menginduksi transkripsi sitokin inflamasi, yang dapat dikurangi dengan JQ1 (BRD4 inhibitor, 25 mg/kg BB, ip , 3 hari berturut-turut in vivo; 0,5 M, 12 jam in vitro) atau RNA pengganggu kecil BRD4 (siRNA, in vitro), menunjukkan bahwa BRD4 berpartisipasi dalam respons inflamasi yang dipicu Cd. Selanjutnya, penelitian kami mengklarifikasi peran BRD4 dalam respons inflamasi yang dipicu Cd. Penghambatan BRD4 menurunkan translokasi dan aktivasi nuklir NF-kB yang dipromosikan Cd secara in vivo dan in vitro. Cd meningkatkan tingkat asetilasi RelA K310 dan meningkatkan pengikatan BRD4 ke NF-κB RelA asetilasi in vivo dan in vitro, yang dibatalkan dengan menghambat BRD4. Singkatnya, penelitian kami menunjukkan bahwa BRD4 terlibat dalam transkripsi sitokin inflamasi yang dipicu Cd dengan memediasi aktivasi jalur pensinyalan NF-κB dan meningkatkan dirinya mengikat NF-κB RelA asetat pada tikusginjal,oleh karena itu, BRD4 bisa menjadi target terapi potensial untuk penyakit ginjal yang diinduksi Cd.

Kata kunci: BRD4KadmiumPeradangan Ginjalsitokin NF-κB JQ1

1. Perkenalan

Kadmium (Cd) merupakan polutan logam berat dengan toksisitas tinggi dan waktu paruh yang lama. Dengan perkembangan produksi industri, meningkatnya ancaman pencemaran Cd terhadap keamanan lingkungan dan kesehatan manusia telah menarik perhatian (Wang et al., 2020; Horiguchi dan Oguma, 2016). Setelah diserap oleh tubuh, Cd menginduksi kerusakan multi-organ danginjaladalah organ target utama (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Sebelumnya, kami secara sistematis memverifikasi bahwa penghambatan autophagy, stres oksidatif, dan apoptosis secara sinergis berkontribusi pada nefrotoksisitas yang disebabkan Cd pada tikus (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Peradangan adalah respons fisiologis yang bertindak sebagai reaksi defensif terhadap infeksi atau cedera, tetapi respons inflamasi yang tidak terkendali dan tidak tepat yang diinduksi Cd dapat menyebabkan kerusakan seperti merusak jaringan normal dan memicu penyakit autoimun (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). Respon inflamasi yang dipicu Cd memperburuk penyakit kardiovaskular, dan kerusakan hati, menunjukkan bahwa peradangan mungkin memainkan peran penting dalam mediasi Cdginjalproses patologis (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetika mengacu pada modifikasi yang diturunkan dalam ekspresi gen berdasarkan perubahan urutan non-DNA, dan reversibilitas modifikasi ini memungkinkan penemuan target terapi baru (Vendetti dan Rudin, 2013). Famili bromodomain dan domain ekstra-terminal (BET) termasuk bromodomain yang mengandung 2 (BRD2), BRD3, BRD4, dan bromodomain testis-spesifik (BRDT), yang dicirikan oleh dua bromodomain dan mengikat lisin asetat dari histon dan non-histon ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee dan Bohmann, 2018). Protein BET bertindak sebagai ko-aktivator transkripsional dari banyak gen, sehingga mengatur siklus sel, respons inflamasi, stres oksidatif, dan proses fisiologis lainnya dalam berbagai model patologis (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 adalah anggota keluarga protein BET yang dipelajari dengan baik, dan akumulasi penyelidikan telah melaporkannya sebagai target epigenetik baru dalam mengatur berbagaipenyakit ginjal, termasuk nefritis kronis, nefropati diabetik, dan kerusakan ginjal eksperimental (Zeng dan Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). BRD4 telah dikonfirmasi untuk berpartisipasi dalam proses transkripsi yang bergantung pada faktor-κB (NF-κB) nuklir untuk mengatur respons inflamasi pada banyak penyakit (Xu dan Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 dapat direkrut oleh RelA asetilasi (subunit NF-κB, gen penyandi protein) di lisin 310 (RelA-K310ac) melalui bromodomainnya, sehingga mengaktifkan cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) dan memfosforilasi RNA polimerase II untuk mempromosikan transkripsi gen target NF-κB (Hajmirza et al., 2018). Studi baru-baru ini menunjukkan bahwa inhibitor BRD4 bisa menjadi pilihan terapi potensial untuk penyakit inflamasi. Pada model cedera tulang belakang tikus, penghambatan BRD4 melemahkan respons inflamasi dan mendorong pemulihan fungsional mikroglia (Dey et al., 2019). Juga, penghambatan BRD4 membatalkan peradangan ginjal eksperimental pada model murine dari obstruksi ureter unilateral, GN basal anti membran, dan infus Angiotensin II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Mengingat potensi efek pro-inflamasi Cd dan efek regulasi BRD4 pada peradangan, kami berhipotesis bahwa BRD4 terlibat dalam respons inflamasi yang dipicu Cd. Seperti yang diharapkan, BRD4 memediasi proses transkripsi sitokin inflamasi pada model ginjal tikus yang terpapar Cd. Studi kami mengungkapkan mekanisme potensial dalam respons inflamasi yang dipicu Cd dan memberikan wawasan baru tentang terapi nefrotoksisitas yang diinduksi Cd.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan kimia dan antibodi

Kadmium klorida (CdCl2, anhidrat, 439800) dibeli dari Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). ( ditambah )-JQ1 (HY-13030) diperoleh dari MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Kit ekstraksi protein nuklir dibeli dari Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027). Kit chemiluminescence efisien (ECL, 32209) dan reagen uji protein asam bicinchoninic (BCA, 23225) diperoleh dari Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Antibodi primer terhadap protein berikut digunakan: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) dibeli dari Grup Proteintech (Wuhan, Cina); -actin (3700 s), Histone H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), IgG kelinci normal (IgG, 4394) dibeli dari Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); BRD4 (ab128874), K (lisin) asetiltransferase 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (asetil K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-konjugasi keledai anti-kelinci (ab150073) dibeli dari Abcam (Cambridge, Inggris). Antibodi kedua: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) dan Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) dibeli dari Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Hewan dan eksperimen

Dua puluh empat tikus Sprague-Dawley (jantan, 6 minggu, 110-120 g) dibeli dari Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, China). Tikus diizinkan akses gratis ke makanan dan air di ruang yang dikendalikan lingkungan (24 ± 5 ​​derajat, 12 jam terang / siklus gelap). Prosedur eksperimental berlaku untuk Pedoman Dewan Komunitas Eropa 2010/63/EU untuk eksperimen hewan, dan semua prosedur telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Yangzhou. Setelah satu minggu aklimatisasi, tikus secara acak dibagi menjadi empat kelompok: (1) Kelompok kontrol: disuntikkan secara intraperitoneal dengan pelarut yang sesuai (larutan salin fisiologis atau 2-hidroksipropil- -siklodekstrin). (2) Kelompok Cd: CdCl2 (2 mg/kg berat badan, dilarutkan dalam garam fisiologis) disuntikkan secara intraperitoneal selama 5 hari berturut-turut untuk menetapkan model intoksikasi Cd. (3) Kelompok Cd plus JQ1: CdCl2 (2 mg/kg berat badan) disuntikkan secara intraperitoneal selama 5 hari berturut-turut untuk menetapkan model keracunan Cd, dan JQ1 (25 mg/kg berat badan, dilarutkan dalam 2-hidroksipropil{{ 25}}larutan siklodekstrin) disuntikkan secara intraperitoneal pada hari ke 6-8. (4) Kelompok JQ1: JQ1 (25 mg/kg berat badan) disuntikkan secara intraperitoneal pada hari ke 6-8. Statistik kandungan Cd dalam serum tikus dan jaringan ginjal tercantum dalam Tabel S1, yang mencerminkan keberhasilan pembentukan model tikus yang terpajan Cd.

Setelah 8 hari pengobatan, tikus dibunuh dengan dislokasi serviks di bawah anestesi dalam setelah 12 jam puasa. Jaringan ginjal dibedah dan 1 g jaringan dari setiap ginjal dengan cepat disimpan pada suhu -80 C untuk mengikuti analisis western blot dan PCR kuantitatif (qPCR). Jumlah jaringan yang tersisa dengan cepat diperbaiki dalam 4 persen paraformaldehyde (PFA) untuk pewarnaan imunohistokimia (IHC).

2.3. Kultur dan pengobatan sel

Garis sel ginjal tikus (NRK{{0}}E) diperoleh dari Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. Sel NRK-52E dikultur dengan medium Eagle's yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, Gibco, 12800-017) yang mengandung 5 persen serum janin sapi (FBS, Gibco, 10437-028), penisilin, dan streptomisin (1 00 U/mL) dalam kondisi lembab dari 5 persen CO2 dan 95 persen udara pada 37 derajat . CdCl2 (larutan air ultra murni) dan JQ1 (larutan dimetil sulfoksida) disimpan secara terpisah pada suhu 4 derajat dan 20 derajat, dan diencerkan ke dalam larutan kerja sebelum digunakan. Desain eksperimental adalah sebagai berikut: (1) Sel diperlakukan dengan 0, 2,5, 5, 10 M Cd selama 12 jam, atau 5 M Cd selama 0, 6, 12, 24 jam untuk melakukan pengujian berikutnya. (2) Sel diperlakukan dengan 5 M Cd dan/atau 0,5 M JQ1 selama 12 jam untuk melakukan pengujian selanjutnya. (3) Sel ditransfeksi dengan siBRD4 dan/atau diperlakukan dengan 5 M Cd selama 12 jam lagi untuk melakukan pengujian selanjutnya.

2.4. Transfeksi RNA kecil yang mengganggu

Kami mentransfeksi 20 nM BRD4 RNA kecil yang mengganggu (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) ke dalam sel NRK-52E oleh reagen transfeksi Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) selama 24 jam sesuai dengan manual produk. SiRNA indra berikut digunakan:

siBRD4, dengan urutan target 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (kontrol negatif siRNA), dengan urutan target 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. blotting barat

Sampel jaringan ginjal dan sel NRK-52E dilisiskan dalam buffer RIPA yang mengandung protease inhibitor untuk mengekstrak protein total. Protein inti dibuat dari jaringan dan sel segar terlebih dahulu dan disimpan pada suhu 80 derajat. Sampel protein (20–30 ug per sampel) dipisahkan dengan elektroforesis SDS-PAGE, kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (Millipore, ISEQ00010). Membran diblokir dengan 5 persen susu skim selama 90 menit, dan diinkubasi 12 jam pada 4 derajat dengan antibodi primer berikut: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Kemudian membran dicuci dengan TBST dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai (1:10000) selama 90 menit pada suhu kamar (RT). Membran diinkubasi dengan electrochemiluminescence (ECL, ThermoFisher Scientific) dan ditentukan pada Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Prancis), dan kepadatan optik dianalisis menggunakan ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Pewarnaan imunofluoresensi (IF)

Sel-sel NRK{{0}}E yang diunggulkan dalam pelat sumur 24-ditumbuhkan hingga sekitar 60 persen pertemuan. Sel diperlakukan dengan 5 M Cd dan/atau 0,5 M JQ1 selama 12 jam, kemudian difiksasi dengan PFA (4 persen, 10 menit), permeabilisasi dengan Triton X- 100 (0,1 persen, 15 menit), diblokir dengan BSA (2 persen, 90 menit) di RT, dan diinkubasi dengan antibodi primer (NF-κB p65, pengenceran 1:50) semalaman pada 4 derajat. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali, sel diinkubasi dengan antibodi sekunder (pengenceran 1:500) selama 90 menit, dan dengan DAPI selama 5 menit di RT, kemudian sel diamati di bawah mikroskop confocal. Translokasi nuklir NF-kB dianalisis dalam tiga studi independen.

2.7. qPCR

Total RNA jaringan ginjal dan sel NRK-52E diekstraksi dengan kit RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Jepang). 1 ug total RNA digunakan untuk mensintesis cDNA rantai pertama menurut manual pabrikan (Roche, Basel, Swiss). 2 L DNA komplementer (cDNA) per sumur diambil untuk mendeteksi level mRNA relatif menggunakan LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Hitung tingkat mRNA relatif menurut persamaan 2-△△CT. Primer tercantum dalam Tabel S2. -aktin adalah gen referensi tikus.

2.8. Co-imunopresipitasi (Co-IP)

Jaringan ginjal dan sel NRK-52E dilisiskan dalam buffer lisis sel yang baru disiapkan (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 persen Triton X{{8} }) mengandung PMSF. Manik-manik protein G (100 L per sampel, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) dicampur dengan 2 ug BRD4, RelA-K310ac, atau antibodi IgG per sampel, dan diputar selama 10 menit di RT. Kemudian, lisat protein total diinkubasi dengan kompleks manik-antibodi semalaman pada suhu 4 derajat. Setelah dicuci dengan buffer lisis sel tiga kali, imunopresipitat disuspensikan kembali dengan buffer sampel 1 × SDS PAGE untuk mengonfigurasi sampel. Protein target dideteksi menggunakan western blotting dengan antibodi primer anti-BRD4 dan anti-RelA K310ac.

2.9. Analisis statistik

Semua data diperoleh dari setidaknya tiga percobaan independen dan dinyatakan sebagai mean ± SEM kecuali disebutkan sebaliknya. Kelompok eksperimen dibandingkan dengan uji-t Student dua arah yang tidak berpasangan atau analisis varians satu arah (ANOVA) menggunakan SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Signifikansi ditetapkan pada p <>

3. Hasil

3.1. Cd menginduksi ekspresi sitokin inflamasi in vivo dan in vitro

Sebagai pencemar lingkungan, Cd telah terbukti menyebabkan kerusakan ginjal dengan mengatur serangkaian proses biologis (Wang et al., 2019c). Dalam penelitian ini, perubahan tingkat transkripsi sitokin inflamasi diperiksa setelah paparan Cd untuk menyelidiki apakah peradangan terlibat dalam nefrotoksisitas yang diinduksi Cd. Data menunjukkan bahwa paparan Cd secara signifikan meningkatkan interleukin (IL)-1 dan tingkat protein faktor nekrosis tumor (TNF)- dalam sel NRK-52E (Gbr. 1A-B) dan jaringan ginjal tikus (Gbr. 1C). -D). Sementara itu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1E-F, paparan Cd meningkatkan tingkat transkripsi sitokin inflamasi (IL-1, IL-6, TNF-, dan (Monocyte chemoattractant protein-1) MCP -1) in vivo dan in vitro. Temuan ini menunjukkan bahwa Cd menginduksi ekspresi sitokin inflamasi pada ginjal tikus.

3.2. BRD4 berpartisipasi dalam proses transkripsi sitokin inflamasi yang diinduksi Cd

BRD4 adalah regulator epigenetik yang baru dideskripsikan yang mengikat histon asetat atau non-histon untuk mengatur proses peradangan pada banyak penyakit. Di sini, inhibitor BRD4 JQ1 dan BRD4-siRNA digunakan untuk menguji peran BRD4 pada respons inflamasi yang dipicu Cd. Data menunjukkan bahwa kadar IL-1 dan protein TNF yang ditinggikan Cd diregulasi ke bawah oleh pengobatan JQ1 in vivo dan in vitro (Gbr. 2A-D) dan oleh knockdown BRD4 in vitro (Gbr. S1A-B). Sementara itu, pengobatan JQ1 secara signifikan menghambat tingkat transkripsi yang ditingkatkan Cd dari IL-1 , IL-6, TNF- , dan MCP-1 dalam sel NRK-52E (Gbr. 2E) dan jaringan ginjal tikus (Gbr. 2F). Juga, knockdown BRD4 secara signifikan menurunkan tingkat transkripsi sitokin inflamasi yang meningkatkan Cd dalam sel NRK-52E (Gbr. S1C). Secara kolektif, temuan ini menunjukkan bahwa BRD4 adalah pengatur penting dari respons inflamasi yang dipicu Cd pada ginjal tikus.

3.3. Level ekspresi BRD4 tetap tidak berubah setelah paparan Cd

Selanjutnya, perubahan tingkat ekspresi BRD4 terdeteksi setelah paparan Cd. Sel NRK-52E diperlakukan dengan Cd di bawah gradien konsentrasi, dan tikus disuntikkan secara intraperitoneal dengan Cd selama 5 hari untuk menjelaskan efek Cd pada ekspresi BRD4 di ginjal in vivo dan in vitro. Hasil menunjukkan bahwa tingkat protein BRD4 tidak berubah baik pada sel NRK-52E yang terpapar Cd (Gbr. 3A-B) dan jaringan ginjal tikus (Gbr. 3C-D). Juga, level mRNA BRD4 tidak berubah setelah paparan Cd (Gbr. 3E-F). Hasil ini menunjukkan bahwa BRD4 memediasi respon inflamasi yang dipicu Cd tidak tergantung pada perubahan tingkat ekspresi.

3.4. BRD4 mengatur translokasi nuklir NF-κB yang dipromosikan Cd

Peran BRD4 dalam respons inflamasi yang dipicu Cd dieksplorasi dalam penelitian kami. Perubahan jalur pensinyalan NF-kB terkait erat dengan transkripsi sitokin inflamasi (Chi et al., 2021). Studi kami menemukan bahwa BRD4 terlibat dalam translokasi nuklir yang diatur Cd dan aktivasi NF-κB. Pertama, lokalisasi subseluler NF-kB ditentukan dengan pewarnaan IF dan pewarnaan IHC. Data pada Gambar 4A dan D menunjukkan bahwa JQ1 menghambat translokasi nuklir NF-kB yang dipromosikan Cd dalam sel NRK-52E dan jaringan ginjal tikus. Sementara itu, hasil western blot menunjukkan bahwa JQ1 secara signifikan menurunkan kadar protein inti NF-kB yang meningkatkan Cd secara in vivo (Gbr. 4B-C) dan in vitro (Gbr. 4E-F). Demikian pula, knockdown BRD4 juga secara signifikan menghambat translokasi nuklir NF-κB yang dipromosikan Cd (Gbr. S2A) dan menurunkan kadar protein nuklear NF-κB yang ditingkatkan Cd (Gbr. S2B-C) dalam sel NRK-52E. Secara bersama-sama, penghambatan BRD4 dapat mengurangi translokasi nuklir NF-kB yang dipromosikan Cd, menunjukkan bahwa BRD4 memediasi aktivasi jalur pensinyalan NF-kB di ginjal setelah paparan Cd.

3.5. Cd meningkatkan tingkat asetilasi RelA K310

Studi telah mengkonfirmasi bahwa BRD4 mengikat RelA K310 yang diasetilasi melalui domain brominnya untuk mengatur transkripsi yang bergantung pada NF-κB (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Dengan demikian, tingkat asetilasi RelA K310 dan ekspresi dua enzim terdeteksi. Data menunjukkan bahwa kadar protein RelA-K310ac dan asetilase Ep300 terus menurun dengan meningkatnya konsentrasi Cd, sementara kadar protein deasetilase Sirt1 secara bertahap meningkat pada sel NRK-52E (Gbr. 5A-B) dan jaringan ginjal tikus (Gbr. .5C-D). Juga, level mRNA Ep300 dan Sirt1 menunjukkan tren yang sama (Gbr. 5E-F). Hasil ini menunjukkan bahwa Cd meningkatkan tingkat asetilasi RelA K310, sehingga BRD4 mungkin terlibat dalam transkripsi sitokin inflamasi yang dipicu Cd di ginjal.

3.6. Cd meningkatkan pengikatan BRD4 ke RelA-K310ac untuk meningkatkan fungsi transkripsinya

Mengikat ke situs asetilasi adalah dasar untuk regulasi transkripsi BRD4 (Huang et al., 2009). Untuk memverifikasi apakah Cd mengatur fungsi BRD4 dengan meningkatkan pengikatan BRD4 ke RelA-K310ac, interaksi antara RelA-K310ac dan BRD4 dideteksi melalui Co-IP. Data pada Gambar 6A menunjukkan bahwa Cd secara signifikan meningkatkan interaksi antara RelA-K310ac dan BRD4 dalam sel NRK-52E, yang dikurangi dengan pengobatan JQ1 atau knockdown BRD4. Juga, tren yang sama diamati pada jaringan ginjal tikus (Gbr. 6B). Hasil ini menunjukkan bahwa Cd meningkatkan pengikatan BRD4 ke RelA-K310ac, yang mempromosikan transkripsi yang bergantung pada NF-κB dan selanjutnya berkontribusi pada respons inflamasi yang dipicu oleh Cd.

4. Diskusi

Cd telah dilaporkan sebagai pemicu potensial inflamasi karena toksisitasnya yang tinggi, sementara mekanisme pastinya masih belum sepenuhnya dipahami (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Studi kami mengkonfirmasi bahwa Cd menginduksi ekspresi sitokin inflamasi dalam sel ginjal tikus, dan menemukan bahwa BRD4, target epigenetik yang memiliki fungsi penting dalam serangkaian proses seluler termasuk peradangan, berkontribusi pada respons inflamasi yang dipicu Cd. Eksperimen lebih lanjut menunjukkan bahwa BRD4 terlibat dalam aktivasi jalur pensinyalan NF-kB yang dipromosikan Cd. Juga, Cd meningkatkan tingkat asetilasi RelA K310, sehingga meningkatkan pengikatan BRD4 ke NF-κB RelA yang diasetilasi untuk mempromosikan transkripsi sitokin inflamasi yang bergantung pada NF-κB.

Inflamasi merupakan salah satu mekanisme pertahanan alami terhadap bahan kimia eksogen, sedangkan respon inflamasi yang tidak terkontrol dan tidak tepat dapat merusak jaringan normal dan menginduksi penyakit autoimun (Jian et al., 2018). Penanda biologis peningkatan Cd dari peradangan sering dikaitkan dengan berbagai penyakit. Penelitian telah menunjukkan bahwa peradangan yang diinduksi Cd terlibat dalam aterogenesis (Tinkov et al., 2018). Selain itu, Cd mempromosikan ekspresi sitokin inflamasi, yang berkontribusi pada kerusakan jaringan paru-paru dan testis dan menginduksi hepatotoksisitas (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Efek berbahaya ini konsisten dengan hasil kami, bahwa respons inflamasi terlibat dalam cedera ginjal yang diinduksi Cd. Peningkatan penelitian telah difokuskan pada mekanisme terjadinya peradangan yang diinduksi Cd. Sebagai anggota keluarga protein BET yang dipelajari dengan baik, BRD4 memainkan peran penting dalam banyak proses biologis termasuk peradangan. Di sini, JQ1 (penghambat BRD4) dan siRNA digunakan untuk menderegulasi aktivitas fungsional BRD4 dan menemukan bahwa penghambatan BRD4 mengurangi transkripsi sitokin inflamasi yang diinduksi Cd pada ginjal tikus, menunjukkan bahwa BRD4 berpartisipasi dalam respons inflamasi yang dipicu Cd . Secara umum diyakini bahwa disregulasi ekspresi BRD4 adalah peristiwa penting dalam terjadinya respon inflamasi. Pada cedera tulang belakang, hipertrofi jantung patologis, dan penyakit terkait peradangan lainnya, ekspresi BRD4 yang tidak teratur berkontribusi pada ekspresi sitokin inflamasi (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Namun, Cd tidak berpengaruh pada tingkat ekspresi BRD4 di bawah kondisi eksperimental saat ini, yang membuat kami mempertimbangkan apakah BRD4 memediasi respons inflamasi yang dipicu Cd melalui jalur lain.

NF-kB merupakan faktor regulasi penting dalam proses inflamasi dan bertanggung jawab untuk mengontrol ekspresi banyak mediator inflamasi (Lawrence, 2009). Studi telah melaporkan bahwa BRD4 terlibat dalam regulasi jalur pensinyalan NF-κB. Huang dkk. (2017) menyarankan bahwa BRD4 mengatur aktivasi NF-κB yang dimediasi IKK melalui jalur p38 dan JNK-MAPK. Wang dkk. (2019a) menemukan bahwa pengobatan knockdown BRD4 atau JQ1 memblokir jalur pensinyalan NF-κB yang diaktifkan lipopolisakarida (LPS) di mikroglia. Meng dkk. (2014) menunjukkan bahwa pengobatan JQ1 memblokir ekspresi sitokin inflamasi dengan menghambat aktivasi NF-kB dalam sel RAW 264,7 yang diobati dengan LPS. Laporan-laporan ini menunjukkan bahwa BRD4 memediasi aktivasi NF-kB di banyak model peradangan sementara menghambat BRD4 adalah pendekatan terapeutik yang efektif untuk anti-inflamasi. Dalam penelitian saat ini, penghambatan BRD4 memblokir translokasi nuklir NF-κB dalam jaringan ginjal tikus yang terpapar Cd dan sel NRK-52E, menunjukkan bahwa BRD4 memediasi jalur pensinyalan NF-κB yang diaktifkan Cd.

Biasanya, setelah NF-κB diaktifkan oleh berbagai rangsangan dan bertranslokasi ke dalam nukleus, BRD4 berikatan dengan NF-κB RelA yang diasetilasi di situs K310, yang meningkatkan stabilitas dan aktivitas transkripsinya di dalam nukleus (Hajmirza et al., 2018). Dengan demikian tingkat asetilasi RelA K310 mempengaruhi fungsi regulasi BRD4 pada respon inflamasi. Dalam neuron hipokampus, deasetilase Sirt1 memediasi deasetilasi RelA K310 untuk mengatur ekspresi BACE1, yang berkontribusi pada produksi amiloid neuron (Flores-Leon et al., 2019). Dalam sel glioblastoma, stres terapi fotodinamik menurunkan regulasi deasetilase Sirt1 dan mengaktifkan asetilase Ep300, yang meningkatkan kadar RelA-K310ac dan menyebabkan peningkatan produksi oksida nitrat pro-survival (Fahey et al., 2019). Studi kami menemukan bahwa Cd mempromosikan tingkat asetilasi RelA K310 dengan meningkatkan ekspresi Ep300 dan mengurangi ekspresi Sirt1, menunjukkan bahwa Cd mempengaruhi fungsi regulasi BRD4 dengan meningkatkan tingkat asetilasi RelA K310.

Khususnya, hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan JQ1 lebih efektif daripada knockdown BRD4 dalam mengurangi respons inflamasi yang dipicu Cd. JQ1 memiliki afinitas pengikatan tinggi dengan BRD4 dan hampir dapat sepenuhnya memblokir pengikatan BRD4 ke kromosom, sementara siBRD4 hanya dapat mengganggu ekspresi protein BRD4 untuk mengurangi pengikatan BRD4 ke situs target, menunjukkan bahwa BRD4 memediasi respon inflamasi yang dipicu Cd mungkin tergantung pada mengikat dengan asetilasi NF-κB RelA. Studi terbaru menunjukkan mekanisme pengaturan yang serupa: setelah translokasi dan aktivasi nuklir NF-κB, BRD4 kemudian berinteraksi dengan RelA asetat untuk mengkoaktivasi aktivasi transkripsional NF-κB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 direkrut ke promotor target NF-κB dalam berbagai kondisi stimulasi inflamasi, sementara pengobatan JQ1 bertindak dengan mencegah pengikatan BRD4 ke NF-κB RelA asetat, sehingga mengurangi aktivitas transkripsi NF-κB (Zou et al., 2014). Hasil kami menunjukkan bahwa penghambatan BRD4 memblokir interaksi yang ditingkatkan Cd antara BRD4 dan RelA-K310ac pada ginjal tikus, mendukung hasil kami di atas bahwa menghambat BRD4 menekan aktivitas transkripsi yang diinduksi Cd dari NF-κB, menunjukkan bahwa Cd meningkatkan pengikatan BRD4 ke asetilasi NF-κB RelA untuk meningkatkan transkripsi sitokin inflamasi.

Singkatnya, penelitian kami mengungkapkan mekanisme pengaturan BRD4 dalam respons inflamasi yang dipicu Cd pada ginjal tikus: (1) BRD4 memediasi translokasi dan aktivasi nuklir NF-κB yang diinduksi Cd. (2) Cd meningkatkan tingkat asetilasi RelA K310 dan meningkatkan pengikatan BRD4 ke NF-κB RelA asetat, yang mendorong transkripsi sitokin inflamasi yang bergantung pada NF-κB. Selain itu, penghambatan BRD4 secara signifikan mengurangi kadar sitokin inflamasi yang ditinggikan Cd, menunjukkan bahwa BRD4 yang ditargetkan memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai cara yang efektif untuk mengobati penyakit inflamasi termasuk nefritis yang diinduksi Cd.

Pernyataan kontribusi kepenulisan CReditT

Zhongguo Gong: Konseptualisasi, Metodologi, Visualisasi, Analisis Formal, Validasi, Investigasi, Analisis Formal, Kurasi Data, Penulisan – draf asli. Gang Liu: Konseptualisasi, Metodologi, Visualisasi, Kurasi data, Penulisan – draf asli, Administrasi proyek, Akuisisi pendanaan. Wenjing Liu: Perangkat Lunak, Sumber Daya, Metodologi, Analisis Formal. Hui Zou: Administrasi proyek, Pengawasan. Lagu Ruilong: Perangkat Lunak, Analisis Formal, Pengawasan. Hongyan Zhao: Perangkat Lunak, Analisis Formal, Pengawasan. Yan Yuan: Pengawasan. Jianhong Gu: Pengawasan. Jianchun Bian: Akuisisi pendanaan, Pengawasan. Jiaqiao Zhu: Menulis – meninjau & mengedit, Pengawasan. Zongping Liu: Menulis – meninjau & mengedit, Pengawasan,

Administrasi proyek, Akuisisi pendanaan, Konseptualisasi.

Pernyataan Kepentingan Bersaing

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak mengetahui adanya persaingan kepentingan keuangan atau hubungan pribadi yang tampaknya dapat mempengaruhi pekerjaan yang dilaporkan dalam makalah ini.

Pengakuan

Pekerjaan ini didukung oleh Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Nasional Tiongkok (No. 31872533, 31902329, 32072933), Program Penelitian dan Pengembangan Kunci Nasional Tiongkok (No. 2016YFD0501208), dan proyek Pengembangan Program Akademik Prioritas Pendidikan Tinggi Jiangsu Lembaga (PADP). Naskah diedit untuk bahasa Inggris yang tepat, tata bahasa, tanda baca, ejaan, dan gaya keseluruhan oleh satu atau lebih editor berbahasa Inggris asli yang berkualifikasi tinggi di ELIXIGEN.

Referensi

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Royal jelly melemahkan nefrotoksisitas yang diinduksi kadmium pada tikus jantan. Sci. Rep.9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Paparan bersama pada tingkat kadmium dan fluorida yang tidak beracun menginduksi hepatotoksisitas pada tikus melalui memicu kerusakan oksidatif mitokondria, apoptosis, dan jalur NF-kB. Mengepung. Sci. polusi. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Bubuk biji fenugreek mengurangi kerusakan testis yang diinduksi kadmium dan hepatotoksisitas pada tikus jantan. Eks. racun. Patol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting pada Nrf2: bagaimana pensinyalan Nrf2 dapat memengaruhi aktivitas terapeutik inhibitor protein BET. Bioesai 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Peran selenoprotein S dalam pembentukan jebakan ekstraseluler neutrofil tergantung spesies oksigen reaktif yang diinduksi oleh selenium- arteritis yang kurang. Biol Redoks. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A.,Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 mengarahkan pengembangan sel induk hematopoietik dan memodulasi respons inflamasi makrofag. EMBO J.38 (7)

Fagerberg, B., Lahir, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Paparan kadmium dikaitkan dengan reseptor aktivator plasminogen urokinase yang larut, penanda sirkulasi peradangan dan penyakit kardiovaskular di masa depan. Mengepung. Res. 152, 185– 191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Peristiwa pensinyalan hulu mengarah pada peningkatan produksi oksida nitrat pro-survival dalam sel glioblastoma yang ditantang secara fotodinamik. Radikal Bebas. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variasi metabolit yang berbeda dan logam berat di Oryza sativa L., terkait dengan penyakit ginjal kronis dengan etiologi yang tidak diketahui di Sri Lanka. Kemosfer 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Penipisan NAD( plus ) yang diinduksi asam palmitat dikaitkan dengan penurunan fungsi SIRT1 dan peningkatan ekspresi BACE1 pada neuron hipokampus. Neurokimia. Res. 44 (7), 1745-1754.

Ghosh, KNI, 2018. Perlakuan kadmium menginduksi echinococcosis, kerusakan DNA, inflamasi, dan apoptosis pada jaringan jantung tikus Wistar albino. Mengepung. racun. farmasi. 59, 43–52. peradangan dan kanker. Biomedis 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Paparan akut kadmium menginduksi neutrofilia berkepanjangan bersama dengan induksi tertunda faktor perangsang koloni granulosit di hati tikus. Lengkungan. racun. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F.,Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Efek paparan kadmium dalam induksi peradangan. Imunofarmaka. Imunotoksikol. 42 (1), 1–8.