Efek Menguntungkan Ekstrak Cistanche Tubulosa Terhadap Peningkatan Permeabilitas Usus Rendah Echincoside (ECH) Dan Acteoside (ACT).
Mar 25, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Tadatoshi Taninoa , Noriaki Nagaib dan Yoshinori Funakakamib
* Fakultas Ilmu Farmasi, Universitas Tokushima Bunri, Tokushima dan b Fakultas Farmasi, Universitas Kinki, Osaka, Jepang
Abstrak
TujuanTujuan dari penelitian ini adalah untuk mengatasi efek menguntungkan dariBentengtubulosaekstrakpada peningkatan permeabilitas usus rendah dari echinacosida (ECH) dan acteoside (ACT).MetodePenyerapan ECH dan ACT dalam ekstrak C. tubulosa dikarakterisasi menggunakan monolayer sel Caco-2 usus manusia dengan senyawa utuh. Penyerapan ECH dan ACT yang bergantung pada transporter glukosa dikonfirmasi oleh teknik perfusi usus in-situ.Temuan UtamaPermeabilitas semu (Papp) tidak berbeda secara signifikan antara ECH utuh dan ACT utuh. Dengan adanya phloridzin, Papp dari ECH dan ACT pada dosis tinggi dikurangi menjadi 20 persen dari masing-masing non-pengobatan tetapi tidak diubah oleh phloretin dan verapamil. Ekstrak C. tubulosa pada dosis rendah dan tinggi meningkatkan Papp ECH dan ACT (keduanya tiga kali lipat), menghasilkan partisipasi besar mereka dalam penyerapan independen transporter glukosa yang bergantung pada natrium. Pada konsentrasi rendah, kadar ECH dan ACT secara bersamaan dalam darah portal ditekan secara signifikan oleh phloridzin.KesimpulanMakanan dan obat-obatan C.tubulosaekstrakmeningkatkan penyerapan usus dari ECH dan ACT dapat berfungsi untuk mengelola kesehatan manusia dengan lebih baik, meskipun keterlibatan transportasi yang sensitif terhadap phloridzin harus dikurangi.
Kata kunciakteosida; Caco-2 sel monolayer;Bentengtubulosaekstrak; echinacosida; transporter glukosa yang sensitif terhadap phloridzin
pengantar
Akar dariBentengtubulosasecara tradisional telah digunakan untuk obat-obatan dan makanan. Ekstrak C. tubulosa diketahui memiliki efek farmakologis dalam berbagai penyakit otak, fungsi anti-penuaan, metabolisme lemak, dan pertumbuhan rambut. [1-4] Baru-baru ini, iridoid, monoterpenoid, glikosida fenilethanoid, dan lignan telah diisolasi dari C. tubulosa . [5,6] Feniletanoid glikosida, kelas senyawa polifenol, adalah bahan kimia utama dalamBentengspesies, [7] meskipun jumlahnya bervariasi di antara spesies yang berbeda. Echincoside (ECH; Gambar 1) adalah salah satu glikosida fenilethanoid utama dalam Herba Cistanchis. Ini dihidrolisis menjadi acteoside (ACT; juga disebut verbascoside) oleh enzim yang berasal dari bakteri di usus besar. [8,9] ECH dan ACT memiliki aktivitas hepatoproteksi yang menguntungkan [10] dan anti-inflamasi [11] pada hewan pengerat. Anehnya, ECH yang sangat larut dalam air meningkatkan hasil perilaku dan neurokimiawi pada model tikus dengan penyakit Parkinson dan menghambat aktivasi caspase-3 dan caspase-8 di neuron granula serebelar.[9] Telah diketahui dengan baik bahwa sawar darah-otak secara ketat membatasi masuk dan distribusi xenobiotik ke otak dari darah. Wu dkk. [12] juga menunjukkan bahwa ACT yang larut dalam air dengan cepat didistribusikan di jaringan otak tikus. Oleh karena itu, ECH dan ACT dapat diangkut ke otak, usus, dan hati melalui sistem tertentu.
Gambar 1 Struktur kimia echincoside dan acteoside.
Meskipun ada bukti kuat yang menunjukkan bahwa konsumsi ekstrak C. tubulosa bermanfaat bagi kesehatan manusia, permeabilitas ECH murni melintasi lapisan tunggal sel Caco{{0}} pada konsentrasi apikal 8,4 ± 1,6 ug/ml adalah sama dengan atau di bawah penanda transpor paraseluler manitol.[13] Ketika ECH murni diberikan secara oral pada tikus (dosis, 1{{10}}0 mg/kg), penyerapan sangat cepat (Tmax, 15 menit), dan konsentrasi serum maksimum sangat rendah (Cmaks, 0.61 ± 0.32 ug/ml).[14] Ketersediaan hayati mutlak ECH hanya 0,83 persen . Demikian pula, ketika sel Caco-2 diinkubasi dengan fraksi fenolik yang sebagian dimurnikan dari air limbah pabrik zaitun, penyerapan ACT murni cepat dengan akumulasi puncak terjadi setelah 30 menit dan efisiensi akumulasi total 0,1 persen , memberikan tingkat intraseluler protein sel 130 pmol/mg. Pada tikus, konsentrasi maksimal (0,13 ± 0,03 ug/ml) ACT murni dicapai dalam waktu 30 menit setelah pemberian dosis oral dengan 100 mg/kg,[12] menyiratkan penyerapan usus yang cepat. Bioavailabilitas oral ACT, serta ECH, cukup rendah (0,12 ± 0,04 persen), menunjukkan kemungkinan efek lintas pertama di saluran usus dan hati. Dalam empedu tikus, konjugat metilasi dan glukuronidasi ECH adalah metabolit utama, [16] meskipun tingkat metabolisme hati masih belum jelas. Kami sebelumnya menemukan bahwa ECH dan ACT cukup stabil dalam homogenat mukosa usus tikus dan asam lambung buatan (data tidak ditampilkan). Najar dkk. [17] menunjukkan bahwa ACT menghambat aktivitas P-glikoprotein (P-GP)-ATPase dengan cara yang mirip dengan verapamil (penghambat P-gp representatif), menyiratkan modulator P-gp; namun, tidak pasti apakah ACT tersedia sebagai substrat P-gp. Menariknya, temuan terbaru dari diet flavonoid-D-glukosida menunjukkan bahwa protein resistensi multidrug (MRP2) menutupi transporter glukosa yang bergantung pada natrium (SGLT)1- yang dimediasi penyerapan quercetin 4′-O- -glukosa, [18,19] yang bertanggung jawab untuk penyerapan yang sangat buruk. Namun, sangat sedikit yang diketahui tentang sensitivitas glukosida polifenol terhadap transporter absorptif, termasuk transporter glukosa. Informasi tentang karakteristik penyerapan kuersetin 4′-glukosida dan ECH permeabel penghalang darah-otak dengan cepat mendorong kami untuk menyelidiki serapan sensitif pengangkut dari glikosida fenilethanoid dalam makanan ekstrak C. tubulosa.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki penyerapan yang dimediasi transporter glukosa dari ECH dan ACT utuh menggunakan monolayer sel Caco-2 usus manusia. Secara bersamaan, transpor absorpsi ECH dan ACT secara bersamaan dalam makanan ekstrak C. tubulosa dicirikan oleh model in-vitro dan sistem perfusi usus in-situ dengan pengambilan sampel darah portal, yang dapat dengan mudah membedakan antara tingkat penyerapan dan penghindaran hati terlebih dahulu. -pass disposisi.
Bahan dan metode
Bahan:
Intact ECH dan ACT adalah hadiah murah hati dari Eishin Trading Co., Ltd (Osaka, Jepang). Phloridzin dan phloretin dibeli dari Tokyo Kasei Co., Ltd. (Tokyo, Jepang). Verapamil dan asam p-coumaric, digunakan sebagai standar internal untuk uji kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Semua bahan kimia lain yang digunakan adalah kelas analitis dan tersedia secara komersial.
Bahan tanaman dan persiapan ekstrak metanol
C. tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) adalah tanaman parasit abadi yang tumbuh pada akar spesies Salvadora atau Calotropis, dan tersebar di negara-negara Afrika Utara, Arab, dan Asia. Batang kering C. tubulosa dibubuk dan diekstraksi tiga kali dengan metanol di bawah refluks selama 3 jam. Penguapan pelarut di bawah tekanan tereduksi memberikan ekstrak metanol. Ekstrak metanol (kelas komersial, Batch No. 20070130;
mendaftarkan nama dagang, Sabaku Ninnjinn Kanka) adalah hadiah murah hati dari Eishin Trading Co., Ltd melalui Muraoka dan Morikawa (Universitas Kinki, Jepang), dan identifikasi botani dilakukan oleh Profesor Jia Xiaoguang di Institut Bahasa Cina Tradisional Xinjiang dan Kedokteran Etnologi.
Analisis ekstrak tumbuhan: kromatografi
Kami menentukan kandungan ECH dan ACT dalam ekstrak C. tubulosa (No. Batch 20070130) dengan analisis HPLC yang dijelaskan di bawah ini. Data yang diperoleh ditunjukkan pada Tabel 1.
Budaya sel
Sel Caco{{0}}, dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA), digunakan pada bagian 38–53. Mereka ditanam dalam media kultur yang terdiri dari media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM, Nacalai Tesque Co., Kyoto, Jepang) yang dilengkapi dengan 0.1 mM asam amino non-esensial, 10 persen serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas, 100 U/ml penisilin G, dan 0,1 mg/ml streptomisin sulfat.
Studi transportasi
Sel Caco-2 dilapisi dengan kepadatan 6,4 × 103 sel/cm2 pada filter polikarbonat. Lapisan tunggal digunakan untuk percobaan transportasi 21-25 hari setelah penyemaian. ECH dan ACT utuh yang setara dengan isinya diBentengtubulosa ekstrak(4.5 and 13.5 mg/ml) were mixed with DMEM medium containing 0.5% dimethylsulfoxide to maintain the integrity of the cell monolayer over the periods of the experiments. Intact ACT equivalent to ECH content in the extract was also dosed in the incubation medium. The extract was suspended in a DMEM medium and was centrifuged to remove insoluble components. Supernatants were loaded to the apical side. At the indicated times, an aliquot of the incubation medium was withdrawn from the basolateral side and was mixed with acetonitrile containing an internal standard for the assay. In separate experiments, phloridzin (fifinal concentration, 1 mM) and verapamil (fifinal concentration, 0.2 mM) was added to the apical side of the monolayer; however, phloretin (fifinal concentration, 0.3 mM) was treated on both sides of the monolayer. The integrity of monolayers was monitored by transepithelial electrical resistance (TEER) using Millicell-ERS (Millipore, Bedford, MA, USA) before and after transport experiments. TEER values of monolayers used were >300 ·cm2.
Perfusi usus in-situ
Tikus Wistar jantan (23{{20}}–250 g) diperoleh dari SLC Jepang (Hamamatsu, Jepang). Hewan ditempatkan di ruangan ber-AC di bawah siklus terang/gelap 12 jam selama 1 minggu sebelum digunakan. Tikus diberi makanan standar laboratorium (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Jepang) dengan air ad libitum dan dipuasakan semalaman sebelum pengujian. Studi perfusi resirkulasi in-situ dilakukan sesuai dengan prosedur modifikasi yang dijelaskan oleh Mihara et al. [20] Secara singkat, tikus dibius dengan larutan uretan 25 persen (1 mg/kg) untuk menghindari penurunan tekanan darah. Sebuah sayatan perut garis tengah dibuat dan usus kecil terbuka. Saluran empedu diikat untuk menghindari sekresi empedu ke dalam perfusi. Seluruh usus halus sebagai satu segmen (dari duodenum ke ileum) dibilas dengan salin normal pada suhu 37 derajat selama 10 menit sampai pencucian tampak jernih. Tabung kaca yang terhubung ke tabung silikon kemudian dikanulasi ke kedua ujung usus kecil dan diamankan dengan benang jahit. Kemudian, usus kecil diganti di perut, dan kanula dihubungkan ke pompa peristaltik. Vena portal dikanulasi dengan pipa polietilen (PE10). Ekstrak C. tubulosa yang tersedia secara komersial disuspensikan dalam buffer bikarbonat Krebs-Henseleit (pH 7,4) untuk menghasilkan konsentrasi akhir 4,5 mg/ml dan disentrifugasi selama 10 menit pada 8000 rpm untuk menghilangkan komponen yang tidak larut. Supernatan dengan tidak adanya atau adanya phloridzin (1 mM) dikumpulkan kembali ke dalam reservoir, yang dipertahankan pada suhu 37 ± 0,5 derajat selama percobaan. Pada waktu yang ditentukan, darah diambil melalui kanula vena portal. Setelah sampel darah disentrifugasi, plasma yang dihasilkan dideproteinisasi dengan asetonitril yang mengandung standar internal dan disentrifugasi pada 3000 rpm. Supernatan diuapkan, dan residu dilarutkan dengan fase gerak yang terdiri dari asetonitril dan asam asetat 0,5 persen. Solusi campuran dimuat ke kolom HPLC. Tikus digunakan sesuai dengan prosedur etis mengikuti Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium yang dikeluarkan oleh pemerintah Jepang dan Universitas Kinki.
analisis HPLC
Analisis HPLC dilakukan pada sistem yang dilengkapi dengan Shimadzu SPD{{0}}A, detektor UV, pompa Shimadzu LC-10A, dan integrator kronotopik Shimadzu C-R4A (Kyoto, Jepang). ECH dan ACT dipisahkan menggunakan kolom ODS Inertsil (5 m, 4,6 × 150 mm, GL Sciences Inc., Osaka, Jepang). Fase gerak asetonitril dan asam asetat 0,5 persen dengan perbandingan 15:85 (v/v) digunakan pada laju alir 1,0 ml/ menit. Deteksi dilakukan pada 334 nm.
Analisis kinetik
Koefisien permeabilitas semu (Papp) diperkirakan dari kemiringan bagian linier dari perjalanan waktu transpor senyawa melintasi lapisan tunggal sel Caco-2, sebagai berikut:
Pap{{0}} dQ/dt）/ A1C0)
di mana dQ/dt adalah laju permeabilitas, C0 adalah konsentrasi awal zat terlarut dalam ruang donor, dan A adalah luas permukaan membran (4,7 cm2).
Dalam studi perfusi usus in-situ tikus, area di bawah kurva konsentrasi-waktu plasma (AUC0-90) di vena portal dari waktu nol hingga pengukuran terakhir dihitung menurut aturan trapesium linier.
Sifat fisikokimia
Luas permukaan polar dan luas permukaan non-polar senyawa dihitung menggunakan program SAS (versi 0.8, Olsson, T.; Sherbukhin, V., Synthesis and Structure Administration, 1997–2001, AstraZeneca, Cary , NC, AS). Nilai log P dan pKa yang ditentukan secara eksperimental diperoleh dari literatur.
Analisis statistik
Data dianalisis dengan analisis varians satu arah yang dilanjutkan dengan uji posthoc Tukey. Nilai probabilitas kurang dari 5 persen dianggap signifikan.
Hasil
Transpor absorptif echinacosida dan akteosida melalui lapisan tunggal sel Caco-2
Pada mencit dan tikus, ECH[1{{20}},14] dan ACT[12,21] utuh diberikan secara oral dengan dosis 100-1{{ 39}}00 mg/kg. Ekstrak C. tubulosa yang digunakan mengandung sekitar 30 persen ECH dan 15 persen ACT per dosis. Karena ekstrak mengubah tekanan osmotik dan pH dalam media inkubasi, konsentrasi 4,5 dan 13,5 mg/ml ditentukan berdasarkan dosis oral (senyawa utuh: 2–20 mg/20 g tubuh berat badan) pada tikus. Ekstrak pada dosis rendah (4,5 mg/ml) dan tinggi (13,5 mg/ml) masing-masing mengandung 2,0 dan 6,1 mg untuk ECH dan 1,0 dan 3,0 mg untuk ACT. Kami menerapkan jumlah ekstrak C. tubulosa yang jauh lebih rendah daripada dosis oral ECH dan ACT yang dilaporkan pada manusia (tunjangan diet yang direkomendasikan untuk ekstrak: 150 mg mengandung sekitar 45 mg untuk ECH dan 22,5 mg untuk ACT). Pada dosis rendah dan tinggi senyawa utuh, profil penyerapan (Gambar 2) dan Papp tidak berbeda secara signifikan antara ECH dan ACT sebagai setara ECH (Tabel 2). Ketika ekstrak C. tubulosa pada dosis tinggi 13,5 mg/ml dimasukkan ke dalam media, nilai Papp (1,27 ± 0,13 dan 0,34 ± 0,03 × 10−6 cm/s, masing-masing) dari ECH dan ACT bersamaan tiga kali lipat lebih tinggi daripada yang (0,38 ± 0,09 dan 0,10 ± 0,03 × 10−6 cm/s, masing-masing) dari ECH dan ACT utuh (Tabel 2). Ekstrak, tidak seperti senyawa utuh, secara signifikan meningkatkan transpor penyerapan ECH dan ACT.
Gambar 2 Transpor absorptif echinacosida dan akteosida melintasi lapisan tunggal sel Caco-2 dalam sistem transwell. Transportasi apikal ke basolateral dipantau. Simbol tertutup adalah echinacoside (lingkaran) dan acteoside (persegi) dariBentengtubulosaekstrak dosis pada konsentrasi rendah dan tinggi 4,5 (a) dan 13,5 mg/ml (b). Simbol terbuka adalah echinacoside utuh (lingkaran) dan acteoside utuh (persegi) sesuai dengan isi echincoside dan acteoside diBentengtubulosaekstrakdosis, masing-masing. Acteoside utuh (segitiga terbuka) juga dimuat dalam media sebagai dosis yang setara dengan echinacosida utuh (lingkaran terbuka). Hasil diberikan dengan standar deviasi (n=3).
Efek penghambatan phloridzin, phloretin, dan verapamil
To characterize the intestinal absorption of ECH and ACT, Caco-2 cell monolayers were incubated with representative inhibitors. Apical glucose transporter 1-sensitive phloridzin dramatically reduced the Papp of intact ECH and ACT to 20% of non-treatment at the high dose (Table 2). Basolateral glucose transporter (GLUT) 2-sensitive phloretin did not decrease the transport of intact ECH and ACT (Figure 3). In this study, higher concentrations (>0.3 mM) phloretin tidak dapat digunakan karena toksisitas sel yang nyata. Selain itu, P-gp telah diidentifikasi sebagai pemain penting yang bertanggung jawab atas interaksi antara obat-obatan herbal dan substrat P-gp yang penting secara klinis. Verapamil tidak meningkatkan transpor absorptif senyawa utuh (Gambar 3).
Transpor absorptif ECH dan ACT dalam ekstrak (dosis rendah) secara signifikan dihambat oleh phloridzin (Tabel 2 dan Gambar 4). Ekstrak pada dosis tinggi menekan penghambatan sensitif phloridzin, meskipun pengangkutan ECH dan ACT utuh lebih sensitif terhadap phloridzin (Tabel 2).
Gambar 3 Pengaruh phloretin dan verapamil pada transpor absorptif echinacosida dan akteosida utuh. Transportasi apikal ke basolateral dipantau setelah menerapkan echinacosida utuh yang sesuai dengan kandungan ehinakosida dalam ekstrak 13,5 mg/ml pada sisi apikal (n=3). Acteoside (kotak tertutup) setara dalam dosis dengan echinacosida utuh (lingkaran tertutup) tanpa adanya inhibitor (n=3). Intan terbuka dan tertutup menunjukkan transpor dengan adanya 0.2 mM verapamil dan 0.3 mM phloretin, masing-masing. Eksperimen penghambatan dilakukan dalam rangkap dua.
Studi perfusi usus in-situ
Dalam studi in-situ, kami menguji apakah ECH dan ACT dalam ekstrak C. tubulosa diangkut oleh SGLT1 yang terletak di sisi apikal usus kecil. Ketika ekstrak makanan pada dosis rendah (4,5 mg/ml) diperfusi, ECH dan ACT dengan cepat muncul dalam darah portal (Gambar 5). AUC ditentukan sebagai 2702,8 ± 384,1 m·min untuk ECH dan 698,3 ± 197,2 m·min untuk ACT. Setelah AUC dinormalisasi dengan kandungan ekstrak C. tubulosa, jumlah yang diserap tidak berbeda nyata antara ECH dan ACT. SGLT1-phloridzin sensitif, tidak seperti phloretin, secara signifikan menekan transpor absorptif ECH bersamaan (AUC, 649,4 ± 248,2 m·min) dan ACT (tidak terdeteksi).
Diskusi
Beberapa bahan herbal merupakan substrat P-gp yang banyak diekspresikan di hati, usus, otak, dan ginjal. P-gp adalah faktor penentu untuk bioavailabilitas in-vivo, disposisi, dan distribusi obat herbal, termasuk St John's wort, kurkumin, echinacea, ginseng, ginkgo, dan jahe.[22,23] Ketersediaan hayati genistein{{5} }glukosida, turunan flavonoid, juga dibatasi oleh transporter MRP2 usus.[24] Oleh karena itu, penelitian ini dirancang untuk menyelidiki sifat penyerapan ECH dan ACT bersamaan dalam diet dan ekstrak obat C. tubulosa.
Caco terpolarisasi{{0}} sel monolayer, serta usus,[25], mengekspresikan transporter penghabisan obat usus utama, seperti P-gp, MRPs, dan protein resistensi kanker payudara.[26] Flavonoid diet dari quercetin [27] dan myricetin [28] telah terbukti menghambat penghabisan yang dimediasi P-gp baik dalam garis sel dan model hewan. Verapamil, inhibitor P-gp, tidak mengubah permeabilitas ACT dan ECH melintasi monolayer sel Caco-2 (Gambar 3), menunjukkan bahwa ECH dan ACT yang utuh tidak dibatasi oleh pompa penghabisan P-gp. Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa protein MRP2 tidak diekspresikan dalam sel monolayer Caco-2.[29] Penghabisan yang dimediasi P-gp dan MRP2-dapat dikecualikan dalam transportasi ECH dan ACT. Beberapa glikosida kuersetin dengan lipofilisitas rendah diserap lebih efisien daripada kuersetin itu sendiri.[30] Penting juga untuk dicatat bahwa ACT dengan bagian gula didistribusikan dengan cepat di jaringan otak. Perhatian kami telah difokuskan pada aksi gabungan dari dua transporter glukosa dalam enterosit: SGLT di membran brush-border dan difusi terfasilitasi transportasi glukosa (GLUT) di membran basolateral. Kultur sel Caco-2 dapat digunakan sebagai model untuk mempelajari GLUT2 yang sensitif terhadap phloretin, dan transporter SGLT1 dan 2 yang sensitif terhadap phloridzin.[31–34] Glukosa diangkut dari apikal ke sisi basolateral Caco{{27). }} monolayer dengan kecepatan tinggi dengan Papp 36,8 ± 1,1×10−6 cm/s.[35] Ia memiliki Papp yang lebih tinggi daripada penanda transseluler propranolol (23,4 ± 2,8 × 10−6 cm/s). Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, ECH dan ACT yang utuh memiliki Papp yang jauh lebih rendah daripada yang dilaporkan dalam glukosa dan propranolol pasif. Kami menghitung logaritma dari koefisien partisi (oktanol-air), log P, dihitung masing-masing menjadi 2.32 dan 0.077 untuk ECH dan ACT. Senyawa polar atau hidrofilik diyakini diangkut melalui jalur paraseluler (melintasi persimpangan ketat). Kedua glikosida fenilethanoid, seperti manitol, tampaknya diangkut melalui rute paraseluler. Namun, phloridzin secara dramatis mengurangi permeabilitas serap dari ECH dan ACT yang utuh (Tabel 2), menunjukkan bahwa SGLT1 apikal memainkan peran utama dalam penyerapan usus dari ECH dan ACT yang utuh. Pada dosis yang setara, permeabilitas ACT hidrofobik yang lebih tinggi mendekati permeabilitas ECH (Gambar 2 dan Tabel 2). Yoshikawa dkk. [36] telah menunjukkan bahwa transporter fasilitatif (GLUT 1 dan 2), serta SGLT1 yang sensitif terhadap phloridzin, diekspresikan secara intensif di usus kecil. Karena jumlah senyawa yang diserap didasarkan pada keseimbangan massa antara penyerapan dan eliminasi, kami mengevaluasi partisipasi GLUT2. Glukosa melintasi membran apikal enterosit oleh SGLT1 dengan afinitas tinggi dan kapasitas rendah dan keluar melintasi membran basolateral melalui GLUT2 dengan afinitas rendah dan kapasitas tinggi. Phloretin (penghambat spesifik GLUT2) tidak menghapus pengangkutan ECH dan ACT yang utuh (Gambar 3). Funes dkk. [37] menunjukkan bahwa ACT sangat berinteraksi dengan kelompok fosfat membran fosfolipid. Karena gugus hidroksil berlimpah dalam struktur ACT, ikatan hidrogen antara gugus ini dan kepala kutub gliserol atau gugus fosfat dari fosfolipid adalah interaksi yang paling mungkin terjadi. Ketika ECH utuh dan ACT setaranya diinkubasi dengan Caco-2 monolayers selama 11 jam, akumulasi seluler ACT (0,24 ± 0,04 nmol/cm2) tiga kali lipat lebih besar daripada ECH (0,07 ± 0,01 nmol/cm2). Kami berpikir bahwa SGLT1- ECH dan ACT yang sensitif secara perlahan dipindahkan dari enterosit ke aliran darah, kemungkinan mengarah ke rendahnya Papp yang diamati. Dibandingkan dengan ECH yang sangat hidrofilik, permeabilitas ACT yang rendah mungkin disebabkan oleh interkalasi ke dalam membran sel.
Senyawa polifenol dikonsumsi dalam campuran herbal selama aplikasi klinisnya dan tersedia secara komersial sebagai suplemen makanan. Dalam penelitian in-vitro, ditunjukkan bahwa penyerapan epikatekin fenolik tidak dipengaruhi oleh komposisi bahan bahan makanan minuman.[38] Sebaliknya, matriks produk Hypericum perforatum L. mempengaruhi pengangkutan glukosida kuersetin (rutin dan isoquercitrin) dan hiperosida melintasi sel Caco-2 karena perbedaan komposisi fitokimia matriks dan karakteristik transpor, yaitu transfer paraseluler dan yang dimediasi oleh pembawa atau aktif. transportasi.[39] Dalam studi ini, C. tubulosa menyediakan transpor transepitel tiga kali lipat lebih tinggi daripada ECH dan ACT utuh (Gambar 2 dan Tabel 2). Kami berspekulasi bahwa komponen dalam ekstrak C. tubulosa mengaktifkan transporter yang sensitif terhadap phloridzin dan/atau mempercepat eliminasi ECH dan ACT intraseluler. Ekstrak C. tubulosa pada dosis tinggi tampaknya sangat menutupi potensi transpor yang sensitif terhadap phloridzin (Tabel 2). Karbohidrat diet[40] dan protein[41] berinteraksi dengan beberapa polifenol dalam saluran pencernaan. Morikawa dkk. [10] menunjukkan bahwa lima iridoid, kankanosida AD, dan kankanol, glikosida monoterpen, kankanosida E, dua oligoglikosida fenilethanoid, kankanosida F dan G, dan gula oligo terasilasi, kankanosa, dapat diisolasi dari ekstrak C. tubulosa yang saat ini digunakan. Bahan lain, termasuk protein dalam ekstrak C. tubulosa, masih belum jelas. Bersama dengan spekulasi di atas, kami dirancang untuk memeriksa apakah komponen lain berinteraksi dengan SGLT1 dan menghambat penyerapan ECH dan ACT.
In-vivo experiments cannot easily distinguish between the extent of absorption and avoidance of first-pass disposition through the liver. The in-situ intestinal perfusion model has an advantage over in-vivo and in-vitro models due to the easy control of experiment parameters exclusion of the impact of other organs and maintenance of an intact intestinal blood supply.[22] The involvement of the phloridzin-sensitive glucose transporter was evaluated in an in-situ intestinal perfusion system. As shown in Figure 5, absorbed amounts of ECH and ACT concomitants in C. tubulosa extract (low dose) were greatly abolished by phloridzin, which agrees with our in-vitro data (Figure 4). Using peptides and 20 drugs passively absorbed, a good correlation is obtained between in-vivo drug absorption and the drug permeability of Caco-2 monolayers.[42] Drugs with a Papp of >1 × 10−6 cm/s sepenuhnya diserap pada manusia, sementara obat-obatan dan peptida yang diserap dengan buruk (<1% of="" dose)="" have="" papp="" values="" of=""><1 ×="" 10−7="" cm/s.="" surprisingly,="" the="" papp="" of="" the="" ech="" concomitant="" (high="" dose)="" was="">1 × 10−6 cm/s (Tabel 2), menunjukkan bioavailabilitas oral yang tinggi pada hewan dan manusia. Crespy dkk. [43] menunjukkan bahwa penghabisan dalam studi perfusi usus in-situ tidak berbeda secara signifikan antara phloridzin dan phloretin. Mereka [44] juga menunjukkan bahwa bioavailabilitas oral phloridzin dengan sensitivitas tinggi terhadap SGLT1 hanya 10 persen pada tikus. Penelitian selanjutnya perlu mengevaluasi bioavailabilitas dan efek first-pass hati dari ECH bersamaan setelah pemberian oral ekstrak makanan pada dosis tinggi. Hasil in-situ menyiratkan bahwa asupan ekstrak C. tubulosa dapat meningkatkan penyerapan oral yang rendah dari ECH dan ACT yang utuh.
Gambar 4 Efek penghambatan phloridzin pada transportasi absorptif echincoside dan acteoside diBentengtubulosaekstrak. Transportasi apikal ke basolateral dipantau. Lingkaran dan kotak tertutup masing-masing adalah echinacosida (a) dan akteosida (b) dalam ekstrak 4,5 mg/ml tanpa phloridzin. Intan tertutup menunjukkan perlakuan dengan ekstrak 4,5 mg/ml termasuk 1 mM phloridzin. Hasil diberikan dengan standar deviasi (n=3).
Gambar 5 Kursus waktu konsentrasi echinacosida dan akteosida dalam darah portal selama perfusi usus tikus resirkulasi in-situ. Simbol lingkaran dan persegi masing-masing adalah echinacosida dan acteoside.Bentengtubulosaekstrakpada konsentrasi 4,5 mg/ml diperfusi dengan tidak adanya (simbol tertutup) atau adanya (simbol terbuka) dari 1 mM phloridzin pada 37 derajat . Hasil diberikan dengan standar deviasi (n=3–4). *P < 0.05="" vs="" ekstrak="" makanan="" dengan="" adanya="">
Kesimpulan
Ekstrak C. tubulosa makanan dan obat yang meningkatkan penyerapan usus dari ECH dan ACT dapat berfungsi untuk mengelola kesehatan manusia dengan lebih baik, meskipun keterlibatan transportasi yang sensitif terhadap phloridzin harus dikurangi.
Deklarasi Benturan kepentingan
Penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan untuk diungkapkan.
Pendanaan
Pekerjaan ini sebagian didukung oleh Pusat Penelitian Teknologi Tinggi dari Universitas Kinki.
Ucapan Terima Kasih
Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Osamu Muraoka (Universitas Kinki, Osaka, Jepang) dan Toshio Morikawa (Universitas Kinki, Osaka, Jepang) atas penyediaanBentengtubulosaekstrakdan unsur murni. Kami sangat berterima kasih kepada Masahiro Iwaki (Universitas Kinki) atas dukungan studi mereka.
Referensi
1. Tanaka J dkk. Efek dariBentengtubulosa ekstrakpada berbagai penyakit otak. Gaya Makanan {}; 12: 24-26.
2. Tanaka J dkk. Fungsi anti-penuaan dariBentengtubulosa ekstrak. Gaya Makanan {}; 12: 27–29.
3. Tanaka J dkk. Fungsi kecantikan dan pertumbuhan rambut dariBentengtubulosaekstrak. Gaya Makanan {}; 12: 29-32.
4. Tanaka J dkk. Efek metabolisme lemak dariBentengtubulosaekstrak. Gaya Makanan {}; 12: 30–33.
5. Yoshizawa F dkk. Konstituen dariBentengtubulosaSchrenk (Kait) f.II. isolasi dan struktur glikosida fenilethanoid baru dan glikosida neolignan baru. Chem Pharm Banteng 1990; 38: 1927–1930.
6. Yoshikawa M dkk. Aminoglikosida fenilethanoid dan oligosugar terasilasi dengan aktivitas vasorelaksan dariBentengtubulosa. Bioorg Med Chem 2006; 14: 7468–7475.
7. Tu PF dkk. Analisis glikosida fenilethanoid Herba cistanche dengan RP-HPLC. Yao Xue Xue Bao 1997; 32: 294–300.
8. Lei L dkk. Regulasi metabolik glikosida fenilethanoid dari Herbacistanchesdalam saluran pencernaan anjing. Yao Xue Xue Bao 2001; 36: 432–435.
9. Geng X dkk. Efek neuroprotektif echinacosida pada model MPTP tikus penyakit Parkinson. Eur J Pharmacol 2007; 564: 66–74.
10. Morikawa T dkk. Aminoglikosida fenilethanoid terasilasi dengan aktivitas hepatoprotektif dari tanaman gurunBentengtubulosa. Bioorg Med Chem 2010; 18: 1882–1890.
11. Paola RD dkk. Efek verbascoside, dimurnikan secara bioteknologi dengan kultur sel tanaman syringa Vulgaris, dalam model hewan pengerat periodontitis. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 707–717.
12. Wu YT dkk. Penentuan akteosida dalamBentengdeserticola dan Boschniakia rossica dan farmakokinetiknya pada tikus yang bergerak bebas menggunakan LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2006; 844: 89–95.
13. Matthias A dkk. Studi permeabilitas alkylamides dan konjugat asam caffeic dari echinacea menggunakan model monolayer sel caco-2. Terapi J Clin Pharm 2004; 29: 7–13.
14. Jia C dkk. Penentuan echinacoside dalam serum tikus dengan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan deteksi ultraviolet dan penerapannya pada farmakokinetik dan bioavailabilitas. Kromatografi J 2006; 844: 308–313.
15. Cardinali A dkk. Verbascosides dari air penggilingan zaitun: penilaian bioaksesibilitas dan penyerapan usus menggunakan sistem model pencernaan/caco-2 in vitro. J Food Sci 2011; 176: H48–H54.
16. Jia C dkk. Metabolisme echinacosida, antioksidan yang baik, pada tikus: isolasi dan identifikasi metabolit biliernya. Dispos Metab Narkoba 2009; 37: 431–438.
17. Najar IA dkk. Modulasi aktivitas P-glikoprotein ATPase oleh beberapa fitokonstituen. Phytother Res 2009; 24: 454–458.
18. Walgren RA dkk. Penghabisan diet flavonoid quercetin 4′-beta-glucoside melintasi sel monolayer caco usus manusia-2 oleh protein terkait resistensi multidrug apikal-2. J Pharmacol Exp Ada 2000a; 294: 830– 836.
19. Walgren RA dkk. Serapan seluler dari makanan flavonoid quercetin 4′-beta-glucosidase oleh transporter glukosa yang bergantung pada natrium SGLT1. J Pharmacol Exp Ada 2000b; 294: 837– 843.
20. Mihara K dkk. Metabolisme lintas pertama usus eperisone pada tikus. Pharm Res 2001; 18: 1131–1137.
21. Isacchi B dkk. Aktivitas antihiperalgesik verbascoside dalam dua model nyeri neuropatik. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 594–601.
22. Masak TJ dkk. Permeabilitas usus klorpirifos menggunakan metode perfusi usus single-pass pada tikus. Toksikologi 2003; 184: 125–133,23. Kumar YS dkk. P-glikoprotein- dan sitokrom P-450-dimediasi interaksi obat herbal. Interaksi Obat Metabolisme Obat 2010; 25: 3–16.
24. Walle UK dkk. Pengangkutan genistein- 7-glukosida oleh sel CACO-2 usus manusia: peran potensial untuk MRP2. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1999; 103: 45–56.
25. Ito K dkk. Ekspresi permukaan apikal / basolateral pengangkut obat dan perannya dalam transportasi obat vektor. Farmasi Res 2005; 22: 1559–1577.
26. Laitinen L dkk. Kultur sel Caco-2 dalam penilaian penyerapan usus: efek dari beberapa obat yang diberikan bersama dan senyawa alami dalam matriks biologis. (University of Helsinki, Finlandia, 2006) Disertasi Akademik, hlm. 1–66.
27. Scambia G dkk. Quercetin mempotensiasi efek adriamycin dalam lini sel kanker payudara manusia MCF-7 multidrug-resistant: P-glikoprotein sebagai target yang mungkin. Kanker Kemoterapi Pharmacol 1994; 34: 459– 464.
28. Choi DH dkk. Pengaruh myricetin, antioksidan, pada farmakokinetik losartan dan metabolit aktifnya, EXP-3174, pada tikus: kemungkinan peran sitokrom P450 3A4, sitokrom P450 2C9 dan P- penghambatan glikoprotein oleh myricetin. J Pharm Pharmacol 2010; 62: 908–914.
29. Tanino T dkk. Paclitaxel-2′- etil karbonat prodrug dapat menghindari penghabisan seluler yang dimediasi P-glikoprotein untuk meningkatkan sitotoksisitas obat. Farmasi Res 2007; 24: 555–565.
30. Hollman PC dkk. Penyerapan glikosida quercetin makanan dan quercetin pada sukarelawan ileostomi yang sehat. Am J Clin Nutr 1995; 62: 1276– 1282.
31. Kellett GL dkk. Komponen difusi dari penyerapan glukosa usus dimediasi oleh perekrutan GLUT2 yang diinduksi glukosa ke membran papan sikat. Biokimia J 2000; 350: 155-162.
32. Materi K dkk. Penyortiran protein membran plasma endogen terjadi dari dua tempat dalam sel epitel usus manusia yang dikultur (Caco-2). Sel 1990; 60: 429–437.
33. Mahraoui L dkk. Kehadiran dan ekspresi diferensial mRNA pengangkut heksosa SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT3, dan GLUT5 dalam klon sel Caco-2 dalam kaitannya dengan pertumbuhan sel dan konsumsi glukosa. Biokimia J 1994; 298: 629–633.
34. Mesonero J dkk. Ekspresi tergantung gula dari transporter fruktosa GLUT 5 dalam sel Cac-2. Biokimia J 1995; 312: 757–762.
35. Walgren RA dkk. Transportasi quercetin dan glukosidanya melintasi sel Caco-2 epitel usus manusia. Biochem Pharmacol 1998; 55: 1721–1727.
36. Yoshikawa T dkk. Ekspresi komparatif transporter heksosa (SGLT1, GLUT1, GLUT2, dan GLUT5) di seluruh saluran pencernaan tikus. Biol Sel Histochem 2011; 135: 183–194.
37. Funes L et al. Efek verbascoside, glikosida fenilpropanoid dari lemon verbena, pada membran model fosfolipid. Lipid Chem Phys 2010; 163: 190–199.
38. Neilson AP dkk. Pengaruh komposisi matriks coklat pada bioaksesibilitas flavan kakao secara in vitro dan bioavailabilitas pada manusia. J Agric Food Chem 2009; 57: 9418–9426.
39. Gao S dkk. Kandungan fenolat yang sangat bervariasi dalam produk St. John's wort mempengaruhi pengangkutannya dalam model sel Caco-2 usus manusia: alasan farmasi dan biofarmasi untuk standarisasi produk. J Agric Food Chem 2010; 58: 6650–6659.
40. Schramm DD dkk. Efek makanan pada penyerapan dan farmakokinetik flavanol kakao. Ilmu Kehidupan 2003; 73: 857–869.
41. Laurent C dkk. Matriks anggur bebas etanol dan polifenol merangsang diferensiasi sel Caco-2 usus manusia. Pengaruh asosiasi mereka dengan ekstrak biji anggur kaya procyanidin. J Agric Food Chem 2005; 53: 5541–5548.
42. Artursson P dkk. Korelasi antara penyerapan obat oral pada manusia dan koefisien permeabilitas obat yang jelas dalam sel epitel internal manusia (Caco-2). Biochem Biophys Res Commun 1991; 175: 880–885.
43. Crespy V dkk. Perbandingan penyerapan usus quercetin, phloretin, dan glukosida mereka pada tikus. J Nutr 2001a; 131: 2109–2114.
44. Crespy V dkk. Ketersediaan hayati phloretin dan phloridzin pada tikus. J Nutr 2001b; 131: 3227–3230.