Menargetkan Kanker Prostat Tingkat Lanjut Dengan Sel T Reseptor Antigen Chimeric STEAP1 Dan Imunoterapi IL-12 Terlokalisasi Tumor

Enam antigen epitel transmembran prostat 1 (STEAP1) adalah antigen permukaan sel untuk penargetan terapeutik pada kanker prostat. Di sini, kami melaporkan ekspresi luas STEAP1 relatif terhadap antigen membran spesifik prostat (PSMA) pada kanker prostat metastatik yang mematikan dan pengembangan terapi sel T reseptor antigen chimeric (CAR) yang diarahkan oleh STEAP1-. Sel T CAR STEAP1 menunjukkan reaktivitas dalam kepadatan antigen yang rendah, aktivitas antitumor pada model kanker prostat metastatik, dan keamanan pada model tikus knock-in STEAP1 manusia. Pelepasan antigen STEAP1 adalah mekanisme resistensi pengobatan yang berulang dan berhubungan dengan berkurangnya pemrosesan dan presentasi antigen tumor. Penerapan terapi interleukin-12 (IL-12) terlokalisasi tumor dalam bentuk protein fusi domain pengikat kolagen (CBD)-IL-12 yang dikombinasikan dengan terapi sel T STEAP1 CAR meningkatkan kemanjuran antitumor dengan merombak lingkungan mikro tumor yang dingin secara imunologis dari kanker prostat dan melawan pelepasan antigen STEAP1 melalui keterlibatan imunitas inang dan penyebaran epitop.

Tanaman cistanche ramuan Cina-Antitumor

Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80% mCRPC dengan keterlibatan tulang atau kelenjar getah bening19, 62% sarkoma Ewing20, dan beberapa jenis kanker lainnya21. STEAP1 termasuk dalam keluarga STEAP dari Metallo reduktase yang dapat membentuk homotrimer atau heterotrimer dengan protein STEAP lainnya22. STEAP1 memiliki peran fungsional yang mapan dalam mendorong proliferasi, invasi, dan transisi sel kanker dari epitel ke mesenkim–26.

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

Selain itu, STEAP1 menunjukkan ekspresi terbatas pada jaringan normal27 sehingga menjadikannya target yang sangat menarik untuk terapi kanker. Berbagai agen imunoterapi telah dikembangkan untuk menargetkan STEAP1 namun tidak ada yang disetujui secara klinis. ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S) yang terdiri dari antibodi IgG1 anti-STEAP1 yang dimanusiakan yang dihubungkan dengan monomethyl auristatin E ditemukan memiliki profil keamanan yang dapat diterima dalam uji klinis fase I di mCRPC tetapi hanya sedikit respons tumor objektif yang diamati28. T-BsAb yang menggabungkan dua domain pengikatan antigen-fragmen (Fab) anti-STEAP1, sebuah fragmen variabel rantai tunggal anti-CD3 (scFv), dan domain fragmen yang dapat dikristalisasi (Fc) yang direkayasa agar tidak memiliki fungsi efektor yang disebut AMG 509 saat ini sedang dievaluasi dalam uji klinis fase I (NCT04221542) di mCRPC29. T-BsAb bivalen ganda asimetris yang disebut BC261 juga baru-baru ini dilaporkan menunjukkan aktivitas antitumor yang kuat di berbagai model praklinis kanker prostat dan sarkoma Ewing30. Selain itu, reseptor sel T terbatas (TCR) antigen leukosit manusia (HLA) kelas I yang spesifik untuk peptida STEAP1 telah terbukti menghambat pertumbuhan sarkoma Ewing lokal dan metastasis dalam model xenograft praklinis setelah transfer adopsi sel T transgenik31. Dalam studi ini, kami melakukan analisis komparatif terhadap ekspresi relatif STEAP1 dan PSMA pada mCRPC yang mematikan untuk menyelidiki kegunaan penargetan STEAP1 di era theranostics PSMA saat ini. Kami merekayasa dan menyaring CAR STEAP1 generasi kedua untuk aktivasi sel T spesifik antigen dan sitolisis sel target untuk menghasilkan kandidat utama untuk karakterisasi lebih lanjut. Kami menentukan spesifisitas epitop fungsional sel T STEAP1 CAR dan membuat profil ekspansi dan imunofenotipe produk sel T STEAP1 CAR dari banyak donor. Kami kemudian menetapkan potensi dan keamanan awal terapi sel T CAR STEAP1 dalam model praklinis kanker prostat yang relevan tetapi mengamati hilangnya ekspresi antigen STEAP1 yang berulang sebagai mekanisme resistensi pengobatan. Untuk mengatasi masalah ini, kami mengevaluasi pemberian CBD-IL-12 secara bersamaan yang merombak lingkungan mikro tumor imunosupresif pada kanker prostat dan menggunakan kekebalan endogen untuk memperluas respons antitumor. Secara kolektif, penelitian-penelitian ini memberikan alasan yang kuat untuk terjemahan klinis terapi sel T STEAP1 CAR pada pria dengan mCRPC dan memandu strategi untuk mengatasi mekanisme potensial resistensi terapeutik.

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

Hasil

STEAP1 diekspresikan secara luas dalam jaringan mCRPC yang tahan terhadap pengobatan

We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) pewarnaan 22-kali lipat (95% CI 6-173) lebih tinggi untuk STEAP1 dibandingkan PSMA dan kemungkinan H-score lebih besar dari atau sama dengan 3{{ 27}} 84-kali lipat (95% CI 30-317) lebih tinggi untuk STEAP1 dibandingkan PSMA. Rata-rata skor H STEAP1 pada tulang (193; 95% CI 171 hingga 215) secara signifikan lebih tinggi dibandingkan metastasis kelenjar getah bening (selisih −48; 95% CI −21 hingga −76; p < 0.001) dan secara signifikan lebih tinggi dibandingkan metastasis visceral (perbedaan −59; 95% CI −42 hingga −77; p <0,001). Tidak ada perbedaan yang signifikan antara rata-rata skor H STEAP1 pada metastasis kelenjar getah bening dibandingkan dengan metastasis visceral (perbedaan 11; 95% CI −16 hingga 39; p=0.4) (Gambar Tambahan 1c). Kami juga mengamati beberapa kasus dengan ekspresi PSMA yang heterogen dalam inti (Gambar 1d) yang konsisten dengan laporan terbaru tentang heterogenitas PSMA intratumoral dalam biopsi mCRPC14. Analisis tingkat pasien menggunakan ambang batas skor H rata-rata lebih besar dari atau sama dengan 30 dan uji McNemar menunjukkan bahwa 95% pasien yang dievaluasi (42 dari 44) memiliki tumor dengan ekspresi STEAP1 sementara 68% (30 dari 44) positif PSMA (Gambar Tambahan 1d). Untuk mempelajari pola heterogenitas antar pasien dan intra-pasien yang terkait dengan ekspresi STEAP1 dan PSMA, kami menggunakan skor H STEAP1 dan PSMA untuk mengevaluasi skor keragaman hipergeometri, Simpson, dan Shannon. Kami mengamati dua pola ekspresi STEAP1 (Gambar 1e) dengan 68% (30/44) pasien menunjukkan ekspresi STEAP1 di semua situs metastasis (STEAP1 tinggi) dan 32% (14/44) pasien menunjukkan situs metastasis dengan dan tanpa ekspresi STEAP1 (STEAP1 heterogen). Tidak ada pasien yang diidentifikasi di mana semua jaringan metastasis tidak memiliki ekspresi STEAP1. Analisis serupa untuk ekspresi PSMA dalam kelompok yang sama mengungkapkan 45% (20/44) pasien dengan ekspresi PSMA tinggi, 32% (14/44) dengan ekspresi PSMA heterogen, dan 23% (10/44) tanpa ekspresi PSMA. Berdasarkan subklasifikasi molekuler jaringan mCRPC menggunakan AR dan ekspresi neuroendocrine marker synaptophysin (SYP) yang dinilai oleh IHC, sebagian besar pasien dengan ekspresi STEAP1 dan PSMA yang tinggi atau heterogen memiliki kanker prostat positif AR (AR+/SYP- atau AR+/SYP+) sedangkan mereka yang tanpa ekspresi PSMA menderita kanker prostat AR-null (AR-/SYP+ atau AR-/SYP-). Kami mengidentifikasi korelasi positif antara ekspresi STEAP1 dan AR (p <0,001) dengan model campuran linier yang dipasang dengan efek acak dalam kasus-kasus yang diwakili pada microarray jaringan (Gambar Tambahan 2a, b) yang diharapkan mengingat bahwa STEAP1 adalah androgen -gen yang diatur33,34. Sebaliknya, tren negatif terlihat antara ekspresi STEAP1 dan SYP (Gambar Tambahan 2c). Temuan ini menunjukkan bahwa, seperti PSMA35, ekspresi STEAP1 mungkin hilang dengan transdifferensiasi neuroendokrin pada kanker prostat.

Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, abu-abu tua). Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Perkembanganpengembangan CAR STEAP1 yang kuat dan spesifik antigen

Mengingat luasnya ekspresi STEAP1 pada mCRPC stadium akhir dan peran fungsionalnya yang dilaporkan dalam perkembangan kanker27,36,37, kami selanjutnya mulai merekayasa CAR generasi kedua khusus lentiviral STEAP1-. Kami menggunakan tulang punggung lentiviral pCCL-c-MNDU3-X38 yang telah banyak digunakan untuk terapi gen sel induk hematopoietik39 dan ekspresi CAR dalam sel T yang didorong oleh promotor MNDU3 internal telah terbukti lebih tinggi daripada yang dicapai dengan Promotor EFS40. Domain kostimulasi 4-1BB lebih disukai karena hubungannya dengan pembentukan memori sel T dan persistensi yang berkepanjangan41 dan domain transmembran CD28 diperkenalkan karena domain ini telah terbukti mengurangi ambang batas antigen untuk 4-1BB generasi kedua Aktivasi sel CAR T42. Kami menggabungkan scFv yang sepenuhnya manusiawi yang berasal dari vandor tuzumab vedotin, sebuah ADC yang menargetkan STEAP1 yang pengembangannya dihentikan setelah uji klinis fase I28. ScFv ini adalah varian manusiawi dari antibodi monoklonal murine (mAb 120.545) yang awalnya dikembangkan oleh Agensys, Inc. yang menunjukkan afinitas 1 nM dalam uji pengikatan berbasis sel43. Agar dapat menyesuaikan aktivitas CAR, kami menerapkan tiga panjang engsel/pengatur jarak yang berbeda, termasuk pendek (engsel IgG4), sedang (engsel IgG4-CH3), dan panjang (engsel IgG4-CH2- CH3). Spacer panjang direkayasa dengan mutasi 4/2- NQ yang dijelaskan sebelumnya44 dalam domain CH2 untuk mencegah pengikatan reseptor Fc-gamma dan kematian sel yang disebabkan oleh aktivasi yang terjadi dengan transfer adaptif sel CAR T spacer panjang ke tikus yang mengalami defisiensi imun. Ketiga kandidat CAR diklon ke vektor lentiviral (Gambar 2a) yang juga bersama-sama mengekspresikan reseptor faktor pertumbuhan epidermal terpotong (EGFRt) sebagai penanda transduksi. Lentivirus dihasilkan dan digunakan untuk mentransduksi sel T CD4 dan CD8 manusia yang diperkaya dari sel mononuklear darah perifer (PBMC) donor manusia yang dikumpulkan dari pheresis. Sel T CAR CD4 dan CD8 yang diperluas diimunofenotip (Gambar Tambahan 3a) dan disusun kembali menjadi produk sel dengan komposisi tertentu dengan rasio CD4/CD8 normal untuk mengevaluasi aktivitas fungsionalnya. Untuk mengontrol ekspresi STEAP1 secara isogenik, kami fokus pada garis sel kanker prostat manusia 22Rv1 yang menunjukkan ekspresi STEAP1 asli dan melakukan KO STEAP1 (ko) dengan pengeditan genom CRISPR/Cas9. Kami kemudian membuat jalur penyelamatan STEAP1 dari ko 22Rv1 STEAP1 melalui transduksi dengan lentivirus yang mengekspresikan STEAP1 (Gbr. 2b). Garis-garis ini kemudian digunakan untuk menyaring tiga sel STEAP1 CAR T spacer pendek, sedang, dan panjang dalam uji kultur bersama dengan pembacaan pelepasan interferon-gamma (IFN-) sebagai indikator aktivasi sel T. Hanya sel STEAP1 CAR T spacer panjang (selanjutnya disebut sel STEAP1-BBζ CAR T) yang menunjukkan pola pelepasan IFN spesifik antigen yang diantisipasi, sedangkan sel STEAP1 CAR T spacer pendek dan menengah tidak (Gbr. 2c , Gambar Tambahan 3b, c). Lebih lanjut, sel T STEAP1-BBζ CAR menunjukkan sitolisis sel 22Rv1 yang bergantung pada dosis dibandingkan dengan sel T yang tidak ditransduksi (Gambar 2d) dan menunjukkan penghematan relatif sel ko 22Rv1 STEAP1 (Gambar 2e). Penelitian serupa kemudian dilakukan pada garis sel kanker prostat manusia DU145 yang tidak memiliki ekspresi STEAP1 asli tetapi direkayasa untuk mengekspresikan STEAP1 (DU145 STEAP1) melalui transduksi lentiviral (Gambar Tambahan 4a). Dalam pengaturan ini, aktivasi sel T STEAP1-BBζ CAR hanya diamati dalam kultur bersama dengan sel DU145 STEAP1 dan bukan sel induk DU145 (Gambar Tambahan 4b). Aktivitas sitolitik hanya dihargai dengan sel T STEAP1-BBζ CAR dan bukan sel T yang tidak ditransduksi dalam kultur bersama dengan sel DU145 STEAP1 (Gambar Tambahan 4c). Kami kemudian menganalisis panel yang lebih besar dari garis sel kanker prostat manusia untuk mengkarakterisasi ekspresi STEAP1 asli mereka dengan analisis imunoblot. Garis sel dengan ekspresi/aktivitas AR yang diketahui (LNCaP, 22Rv1, VCaP, dan LNCaP95) menunjukkan berbagai tingkat ekspresi STEAP1 sedangkan garis sel AR-null (PC3, DU145, MSKCC EF1, dan NCI-H660) tampaknya tidak mengekspresikan tingkat STEAP1 yang terdeteksi (Gbr. 2f). Kami melanjutkan untuk melakukan kultur bersama STEAP1-BBζ CAR T dengan garis-garis ini untuk lebih memvalidasi aktivasi spesifik antigen berdasarkan pelepasan IFN (Gbr. 2g). Namun, kami mengamati temuan yang sumbang pada garis PC3, yang tidak menunjukkan ekspresi protein STEAP1 yang jelas (Gambar 2f), menginduksi aktivasi substansial sel T STEAP1-BBζ CAR. Literatur sebelumnya menyarankan bahwa STEAP1 diekspresikan dalam garis sel PC3 pada level rendah45. Memang, paparan imunoblot yang berkepanjangan menunjukkan adanya pita yang menunjukkan adanya ekspresi STEAP1 yang sangat rendah (Gbr. 2h). Untuk mengonfirmasi apakah aktivasi sel T STEAP1-BBζ CAR disebabkan oleh ekspresi STEAP1 kecil dalam sel PC3, kami membuat tiga subline PC3 STEAP1 ko (Gbr. 2h) dan kembali melakukan kultur bersama dengan STEAP{{133} }Sel T CAR BBζ. STEAP1 ko di lini PC3 menyebabkan pencabutan aktivasi sel T STEAP1-BBζ CAR (Gbr. 2i), yang selanjutnya memvalidasi spesifisitas dan memberikan bukti sensitivitas sel T STEAP1-BBζ CAR terhadap rendah kondisi kepadatan antigen.

Kurangnya reaktivitas silang STEAP1-BBζ CAR dengan mouse Steap1 dan STEAP1B manusia

manfaat suplemen cistanche-meningkatkan kekebalan tubuh

Konsisten dengan spesifisitas anti-manusia dari vandor tuzumab vedotin, sel T STEAP1-BBζ CAR T tidak menunjukkan reaktivitas silang dengan tikus Steap1 (Gambar Tambahan 4a, d, e). Namun, kami menggunakan ini sebagai kesempatan untuk secara individual menyusun kembali tiga domain ekstraseluler (ECD) STEAP1 manusia ke Steap1 tikus (Gambar Tambahan 4f) untuk menentukan ECD mana yang penting untuk pengenalan epitop oleh sel T STEAP1-BBζ CAR. Eksperimen kultur bersama dilakukan dengan sel T STEAP1-BBζ CAR dan sel DU145 yang direkayasa untuk mengekspresikan Steap1 tikus dengan penggantian ECD tikus secara individual dengan ECD manusia. Kami menemukan bahwa STEAP1 ECD2 manusia tetapi bukan ECD1 atau ECD3 dikaitkan dengan aktivasi sel T STEAP1-BBζ CAR (Gambar Tambahan 4g). Menariknya, STEAP1 manusia dan tikus Steap1 ECD2 menunjukkan homologi 93,9% (31/33 asam amino) (Gambar Tambahan 4h), menunjukkan bahwa Q198 dan/atau I209 dari STEAP1 manusia sangat penting untuk pengakuan produktif oleh STEAP1-BBζ sel CAR T. Q198 telah terbukti berinteraksi dengan Fab 120.545 sebagai bagian dari hotspot interaksi berdasarkan struktur terbaru yang diselesaikan dengan mikroscropy elektron kriogenik22. Dari keluarga protein STEAP manusia, STEAP1B mempunyai homologi terbesar dengan STEAP145. Tiga transkrip STEAP1B telah diidentifikasi, yang semuanya menunjukkan konservasi lengkap dari urutan asam amino STEAP1 ECD2 manusia (Gambar Tambahan 5a). Algoritme prediksi topologi membran konsensus TOPCONS46 memperkirakan urutan domain ECD2 sebagai ekstraseluler dalam tiga isoform protein STEAP1B (Gambar Tambahan 5b) meskipun dengan skor keandalan yang rendah untuk STEAP1B dibandingkan dengan hSTEAP1 karena kurangnya konsensus antara lima model prediksi topologi (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI, dan SPOCTOPUS) digunakan oleh TOPCONS (Gambar Tambahan 5c). Analisis sebelumnya menggunakan alat prediksi topologi berbasis model Markov tersembunyi lainnya, TMHMM47, juga menyarankan bahwa urutan ini bisa bersifat intraseluler daripada ekstraseluler dalam isoform protein STEAP1B 1 dan 245. Namun, struktur kristal STEAP1B belum ditentukan untuk membuktikan secara langsung prediksi ini. Untuk mengevaluasi secara fungsional apakah sel T STEAP1- BBζ CAR mungkin juga reaktif terhadap STEAP1B, kami melakukan kultur bersama menggunakan garis DU145 yang dirancang untuk mengekspresikan masing-masing dari tiga isoform STEAP1B. Kami tidak mengidentifikasi bukti aktivasi sel T STEAP1-BBζ CAR (Gambar Tambahan 5d), menunjukkan bahwa epitop STEAP1 yang dikenali oleh sel T STEAP1-BBζ CAR T mungkin tidak disajikan sebagai bagian dari ektodomain oleh STEAP1B meskipun urutannya homologi.

Gambar 2|Skrining 4-1reseptor antigen chimeric (CAR) BB generasi kedua untuk mengidentifikasi petunjuk untuk terapi sel T STEAP1 CAR. skema konstruksi dan variasi CAR lentiviral STEAP1 berdasarkan spacer pendek, sedang, dan panjang. Pengulangan terminal panjang LTR, wilayah U3 virus leukemia murine MNDU3 Moloney, fragmen variabel rantai tunggal scFv, rantai ringan variabel VL, rantai berat variabel VH, transmembran tm, reseptor faktor pertumbuhan epidermal terpotong EGFRt, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} Mutasi domain CH2 untuk mencegah pengikatan pada reseptor Fc-gamma. b Imunoblot STEAP1 dalam sel induk 22Rv1, sel knockout (ko) STEAP1, dan sel STEAP1 ko dengan penyelamatan STEAP1. c IFN-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dihasilkan dari kultur bersama sel T yang tidak ditransduksi atau sel STEAP1-BBζ CAR T dengan masing-masing subline 22Rv1 dengan rasio 1:1 dalam 24 jam (p < 0.001). Viabilitas sel relatif (d) 22Rv1 dan (e) 22Rv1 STEAP1 ko sel target dari waktu ke waktu diukur dengan pencitraan sel hidup fluoresensi pada kultur bersama dengan (kiri) sel STEAP1-BBζ CAR T (p <0,001) atau ( kanan) sel T yang tidak ditransduksi pada rasio sel efektor-target (E: T) yang bervariasi. f Immunoblot menunjukkan ekspresi STEAP1 pada garis sel kanker prostat manusia yang positif reseptor androgen (AR) tetapi tidak pada garis sel kanker prostat yang negatif AR. g IFN- kuantifikasi dengan ELISA dari kultur sel T yang tidak ditransduksi atau sel STEAP1- BBζ CAR T dengan masing-masing garis sel kanker prostat manusia di (f) dengan rasio 1:1 pada 24 jam. h Immunoblots untuk STEAP1 di subline 22Rv1, PC3, dan PC3 STEAP1 ko. I IFN- kuantifikasi dengan ELISA dari kultur bersama sel T yang tidak ditransduksi atau sel STEAP1- BBζ CAR T dengan setiap baris sel dalam (jam) dengan rasio 1:1 pada 24 jam (p <0,001). Untuk panel (c – e, g, dan i) n=4 ulangan biologis per kondisi digunakan dan bilah kesalahan mewakili rata-rata dengan SEM. Panel (b, f, h) menampilkan hasil yang mewakili n=3 ulangan biologis. GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan protein. Untuk panel (c) dan (i), digunakan ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Sidak. Untuk panel (d) dan (e), digunakan ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Tukey. Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Karakterisasi produk sel T STEAP1-BBζ CAR di serangkaian donor

Kami selanjutnya membuat profil ekspansi, efisiensi transduksi, dan imunofenotipe produk sel T STEAP1-BBζ CAR menggunakan tiga set sel mononuklear darah tepi (PBMC) independen yang dikumpulkan dari donor sehat. Kami biasanya mengamati ekspansi sel STEAP1-BBζ CAR T sebesar 20- hingga 40-kali lipat dalam waktu 11 hari setelah kultur (Gambar Tambahan 6a). Persentase sel T EGFRt+ CD8 berkisar antara 24,3 hingga 54,2% sedangkan persentase sel T EGFRt+ CD4 lebih tinggi dan berkisar antara 60,1 hingga 74,9% pada produk sel T STEAP1-BBζ CAR kami (Gambar Tambahan 6b). Kami memeriksa ekspresi penanda kelelahan sel T PD-1 dan LAG-3 dalam subset sel T CAR T yang tidak ditransduksi dan STEAP1- BBζ CAR dan tidak mengamati peningkatan ekspresi yang signifikan (Gambar Tambahan 6c ). Temuan ini menunjukkan rendah atau tidak adanya sinyal tonik oleh STEAP1-BBζ CAR yang menggembirakan karena sinyal CAR konstitutif dapat berdampak negatif terhadap fungsi efektor sel T CAR48. Fenotip sel T memori sel induk (Tscm) dan sel T memori pusat (TCM) telah dikaitkan dengan kemanjuran terapeutik terapi sel T CAR karena keduanya mendorong proliferasi dan persistensi in vivo yang berkelanjutan49-51. Immunophenotyping dari subset sel T CAR T yang tidak ditransduksi dan STEAP1-BBζ menunjukkan frekuensi sel Tscm yang lebih tinggi dibandingkan dengan subset sel T pada donor PBMC dari mana produk sel tersebut berasal (Gambar Tambahan 6d). Efek ini kemungkinan disebabkan oleh penambahan IL-7 dan/atau IL-15 ke media ekspansi sel T karena sitokin ini telah terbukti mempertahankan dan meningkatkan diferensiasi Tscm51,52. Analisis kami juga mengungkapkan pengayaan populasi Tcm khususnya pada sel T CD8 STEAP1-BBζ CAR (Gambar Tambahan 6e).

STEAP1-Sel T CAR BBζ menunjukkan efek antitumor yang substansial pada model kanker prostat yang disebarluaskan dengan ekspresi STEAP1 asli yang dibuat pada tikus yang mengalami defisiensi imun

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Sebagai skrining awal untuk aktivitas antitumor in vivo, kami membuat tumor xenograft subkutan 22Rv1 pada tikus NOD scid gamma (NSG) jantan. Ketika tumor tumbuh hingga kira-kira 100 mm3, tikus diobati dengan injeksi intratumoral tunggal sel T 5 × 106 yang tidak ditransduksi atau sel T STEAP1-BBζ CAR. Perawatan intratumoral dengan sel T STEAP1- BBζ CAR dikaitkan dengan penghambatan pertumbuhan tumor yang signifikan yang secara statistik signifikan pada hari ke 18 pengobatan (Gambar 3a). Tikus dikorbankan pada hari ke 25 dan sisa tumor dari tikus yang diobati dengan STEAP1-BBζ Sel T CAR menunjukkan area besar dari puing-puing nekrotik dan area tumor yang layak disusupi dengan CD3+ STEAP1-BBζ Sel T CAR (Gambar Tambahan 7a). Ekspresi STEAP1 dilestarikan dalam tumor di seluruh kelompok pengobatan (Gambar Tambahan 7b). Kami mentransduksi sel 22Rv1 dengan lentivirus untuk menerapkan ekspresi firefly luciferase (Luc) dan sel 106 22Rv1-fLuc disuntikkan ke pembuluh darah ekor tikus NSG jantan. Kolonisasi metastatik divisualisasikan dengan pencitraan bioluminesensi langsung (BLI) setelah dua minggu, di mana tikus diobati dengan suntikan intravena tunggal sel T 5 × 106 yang tidak ditransduksi atau sel T STEAP1-BBζ CAR (Gbr. 3b) . Serial BLI mengungkapkan perkembangan penyakit yang cepat pada tikus yang diobati dengan sel T yang tidak ditransduksi sementara mereka yang menerima sel T STEAP1-BBζ CAR menunjukkan penundaan yang signifikan dalam perkembangan tumor (Gambar 3c, d) dan perpanjangan kelangsungan hidup (97 hari versus 31 hari , p=0.0018 dengan uji log-rank, Gambar 3e). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat tikus antara kelompok perlakuan (Gambar Tambahan 7c). Pewarnaan tumor IHC pada akhir penelitian menunjukkan penurunan signifikan dalam ekspresi STEAP1 (Gambar Tambahan 7d), menunjukkan bahwa pelepasan antigen adalah mekanisme resistensi. Namun, hal ini tidak mungkin terjadi akibat transdifferensiasi ke varian keadaan kanker prostat karena kami tidak menghargai perubahan morfologis, hilangnya ekspresi AR dan PSMA, atau peningkatan ekspresi SYP (Gambar Tambahan 7d). Untuk menyelidiki dampak global hilangnya STEAP1 pada kanker prostat, kami melakukan profil transkriptom dari tipe liar isogenik 22Rv1 (wt), 22Rv1 STEAP1 ko, dan 22Rv1 STEAP1 ko + jalur sel penyelamat yang telah kami siapkan sebelumnya (Gbr. 2b). Analisis ekspresi gen diferensial yang membandingkan sel ko 22Rv1 STEAP1 dengan sel berat 22Rv1 teridentifikasi ~1700 gen diturunkan regulasinya secara signifikan (FDR Kurang dari atau sama dengan 0,05, perubahan lipat<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) dengan add-back STEAP1 (Gambar Tambahan 8a). Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) menominasikan beberapa jalur biologis yang mungkin didisregulasi oleh modulasi ekspresi STEAP1. Yang menonjol di antaranya adalah perkembangan siklus sel dan berbagai proses metabolisme termasuk siklus Kreb dan glikolisis yang diperkaya secara negatif oleh sistem gugur STEAP1 dan diselamatkan setelah penambahan kembali STEAP1 (Gambar Tambahan 8b). Kami menerapkan tanda tangan 31-perkembangan siklus sel gen (CCP)54 yang tervalidasi pada data kami yang menunjukkan penurunan regulasi tanda tangan CCP yang signifikan terkait dengan KO STEAP1 dengan skor −0.8 yang meningkat secara substansial menjadi {{ 14}}.5 dengan penyelamatan ekspresi STEAP1 (Gambar Tambahan 8c). Data ini konsisten dengan publikasi sebelumnya yang menunjukkan bahwa knockdown STEAP1 pada lini sel kanker prostat LNCaP merusak viabilitas dan proliferasi sel sekaligus menginduksi apoptosis37. Kami juga mencatat bahwa pemrosesan dan presentasi antigen adalah salah satu jalur KEGG yang paling diperkaya secara signifikan dengan KO STEAP1 (Gambar Tambahan 8b). Kami mengamati penurunan regulasi gen yang signifikan termasuk PSME1 (subunit aktivator proteasome 1) yang merupakan anggota kompleks imunoproteasome, TAP1 (transporter 1, anggota subfamili kaset pengikat ATP) yang sangat penting untuk peptida kelas I kompleks histokompatibilitas utama (MHC). memuat kompleks, dan beberapa gen MHC kelas I dan II seperti MR1 (kompleks histokompatibilitas utama, terkait kelas I), HLA-DQ-B1, dan HLA-DQB2 (Gambar Tambahan 8d). Kami menyelidiki lebih lanjut tumor yang dikumpulkan dari model disebarluaskan 22Rv1 yang diobati dengan terapi sel T STEAP1- BBζ CAR yang menunjukkan hilangnya antigen (Gambar 3c, Gambar Tambahan 7d) dengan analisis transkriptome. Analisis ekspresi gen diferensial dan GSEA berikutnya yang membandingkan tumor metastasis 22Rv1 dari tikus yang diobati dengan terapi sel T STEAP1-BBζ CAR dengan mereka yang diobati dengan sel T yang tidak ditransduksi menunjukkan pengayaan negatif jalur yang terlibat dalam MHC, limfosit sitotoksik, dan aktivasi sel T ( Gambar Tambahan 9a, b). Kami juga secara khusus mengevaluasi ekspresi gen MHC kelas I dan II dan mengamati penurunan regulasi pada tumor 22Rv1 yang diobati dengan terapi sel T STEAP1-BBζ CAR (Gambar Tambahan 9c). Hasil ini selanjutnya dibuktikan dengan penurunan signifikan pewarnaan HLA-A, B, C oleh IHC pada tumor ini (Gambar Tambahan 9d). Implikasi potensial dari data ini adalah bahwa pengobatan dengan terapi sel T STEAP1-BBζ CAR dan hilangnya ekspresi antigen tumor STEAP1 pada kanker prostat dapat mengakibatkan resistensi imunoterapi lebih lanjut melalui gangguan pemrosesan dan presentasi antigen. Kami juga menginokulasi tikus NSG jantan dengan sel C4-2B-fLuc melalui injeksi vena ekor. C4-2B adalah subline LNCaP55 yang tahan pengebirian dengan kinetika pertumbuhan yang lebih sesuai dengan kanker prostat pada umumnya. Empat minggu setelah injeksi, kolonisasi metastasis dikonfirmasi oleh BLI, dan tikus diobati dengan injeksi intravena tunggal sel T 5 × 106 yang tidak ditransduksi atau sel T STEAP1-BBζ CAR (Gbr. 3b). Serial BLI menunjukkan respons lengkap pada semua tikus yang menerima sel STEAP1-BBζ CAR T dalam waktu lima minggu pengobatan (Gbr. 3f, g). Kami mengidentifikasi tren peningkatan penurunan berat badan pada kelompok pengobatan sel T yang tidak ditransduksi (Gambar Tambahan 10a) tetapi ini tidak signifikan secara statistik. Nekropsi tikus yang diobati dengan sel T STEAP1-BBζ CAR tidak menunjukkan penyakit makroskopis dan BLI organ ex vivo tidak menunjukkan sinyal apa pun (Gambar Tambahan 10b), menunjukkan bahwa tikus ini kemungkinan besar sembuh. Kami mengidentifikasi persistensi perifer sel T STEAP1-BBζ CAR pada akhir percobaan berdasarkan pada keberadaan splenosit CD3+ EGFRt+ yang terdeteksi (Gbr. 3h).

Gambar 3|Aktivitas antitumor in vivo dari terapi sel T STEAP1-BBζ CAR pada model kanker prostat dengan ekspresi STEAP1 asli. a Volume tumor subkutan 22Rv1 pada tikus NSG (n=4 untuk kelompok sel T yang tidak ditransduksi dan n=5 untuk kelompok sel T STEAP1-BBζ CAR T) seiring waktu setelah injeksi intratumoral tunggal sebesar 5 × 106 sel T yang tidak ditransduksi atau sel T STEAP{{10}}BBζ CAR pada rasio CD4/CD8 normal. p <0.0001 pada hari ke 20 dan 25. Batang mewakili mean dengan SEM. b Skema eksperimen tantangan tumor untuk model yang disebarluaskan 22Rv1 (atas) dan C4-2B (bawah). Luc firefly luciferase, pencitraan bioluminesensi BLI. c Pencitraan bioluminesensi langsung serial (BLI) tikus NSG yang dibuat dengan metastasis 22Rv1-fLuc dan diobati dengan injeksi intravena tunggal sel T 5 × 106 yang tidak ditransduksi atau sel T STEAP1-BBζ CAR T pada CD4/normal Rasio CD8 pada hari ke 0. X merah menunjukkan tikus mati. Skala pancaran ditampilkan. d Plot yang menunjukkan kuantifikasi fluks total dari waktu ke waktu dari BLI langsung setiap mouse di (c). e Kurva kelangsungan hidup tikus Kaplan-Meier di (c) dengan signifikansi statistik ditentukan dengan uji log-rank (Mantel-Cox). Untuk panel (c – e) n=5 tikus per kondisi digunakan. f BLI hidup serial dari tikus NSG yang dibuat dengan metastasis C4-2B dan diobati dengan injeksi intravena tunggal sel T yang tidak ditransduksi 5 × 106 atau sel T STEAP1-BBζ CAR T pada rasio CD4/CD8 normal pada hari itu 0. X Merah menandakan tikus yang sudah mati. Skala pancaran ditampilkan. g Plot yang menunjukkan kuantifikasi fluks total dari waktu ke waktu dari BLI langsung setiap mouse di (f). Untuk panel (f, g) n=4 tikus digunakan dalam kelompok sel T yang tidak ditransduksi dan n tikus=5 dalam kelompok sel T STEAP1-BBζ CAR. h Kuantifikasi sel CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR T dengan flow cytometry dari splenosit tikus yang diobati dengan sel STEAP1-BBζ CAR T (n=4) di akhir percobaan pada hari ke 49. Batang mewakili mean. Untuk panel (a), digunakan ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Sidak. Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Studi sel T CAR STEAP1 tikus-dalam-tikus menunjukkan kemanjuran terapi antitumor

Aktivasi dan aktivitas sitolitik sel T STEAP1-BBζ CAR diamati dalam konteks kepadatan antigen STEAP1 yang sangat rendah (~1500 molekul/sel) dari garis sel PC3 (Gambar 2g – i, Gambar Tambahan. 11a, b ) dan bukti aktivitas antitumor in vivo dalam model tumor PC3-fLuc yang disebarluaskan (Gambar Tambahan 11c – e) menimbulkan kekhawatiran tentang potensi toksisitas di luar tumor yang sesuai target. Untuk mengevaluasi potensi toksisitas pada organisme model yang mudah dikendalikan, kami menghasilkan tikus knock-in (hSTEAP1-KI) STEAP1 manusia yang mana gen STEAP1 manusia dimasukkan ke dalam lokus gen Steap1 tikus pada latar belakang C57Bl/6 ( Gambar 4a). Sebuah koloni tikus didirikan dengan genotipe yang dilakukan oleh reaksi berantai polimerase (PCR) dari DNA ekor (Gbr. 4b). Tikus hSTEAP1-KI homozigot dan heterozigot tidak menunjukkan kelainan fenotipik atau reproduksi yang jelas dibandingkan dengan tikus tipe liar. Survei jaringan untuk ekspresi STEAP1 manusia berdasarkan transkripsi balik kuantitatif PCR (qRT-PCR) dilakukan pada tikus hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/ + ) heterozigot jantan dan betina dan mengungkapkan ekspresi relatif terbesar di prostat, diikuti oleh rahim dan kelenjar adrenal (Gbr. 4c). Analisis in situ lebih lanjut oleh STEAP1 IHC pada prostat hSTEAP1-KI/ + + pria dan kelenjar adrenal mengungkapkan ekspresi STEAP1 manusia terbatas pada sel epitel luminal prostat (Gbr. 4d) dan ekspresi di korteks adrenal (Gbr. 4e) . Versi STEAP1 CAR yang dimurinisasi, disebut STEAP1-mBBζ CAR, yang mana spacer engsel-CH2-CH3 scFv dan IgG4 dipertahankan tetapi domain transmembran CD28, domain kostimulasi 4-1BB , dan domain aktivasi CD3ζ diganti dengan ortolog tikusnya yang diklon ke dalam konstruksi gammaretroviral (Gbr. 4f). Selain itu, penanda transduksi EGFRt manusia diganti dengan CD19 tikus terpotong (mCD19t) untuk meminimalkan potensi imunogenisitas. Kami mengkonfirmasi transduksi retroviral yang efisien dari sel T yang diperkaya dari splenosit tikus (Gambar 4g) dan menunjukkan kapasitas sel STEAP1-mBBζ CAR T tikus untuk menginduksi sitolisis garis sel kanker prostat tikus RM956 yang direkayasa untuk mengekspresikan STEAP1 manusia (RM9- hSTEAP1) dengan transduksi lentiviral (Gbr. 4h). Kemanjuran in vivo sel T tikus STEAP1-mBBζ CAR divalidasi dalam model tumor RM9-STEAP1-fLuc yang disebarluaskan pada tikus NSG (Gambar Tambahan 12a). Satu minggu setelah injeksi sel RM9-STEAP1-fLuc vena ekor, tikus diobati dengan sel T tikus 5 × 106 yang tidak ditransduksi atau sel T tikus STEAP1-mBBζ CAR T dengan injeksi vena ekor . Tikus yang menerima sel T tikus yang tidak ditransduksi menunjukkan perkembangan penyakit yang tidak terkendali, sedangkan tikus yang diobati dengan sel T CAR STEAP1-mBBζ secara seragam menunjukkan regresi penyakit yang cepat yang diikuti oleh kekambuhan berikutnya sepuluh hari kemudian (Gambar Tambahan 12b, c). Terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR dikaitkan dengan manfaat kelangsungan hidup yang signifikan secara statistik (22 hari versus 12 hari, p=0.0039 dengan uji log-rank, Gambar Tambahan 12d). Penurunan berat badan terlihat jelas pada kedua kelompok pengobatan karena beban tumor meningkat sebelum kematian (Gambar Tambahan 12e, f). Analisis splenosit tikus yang dikumpulkan saat nekropsi menunjukkan persistensi perifer sel STEAP1-mBBζ CAR T dengan deteksi sel mCD3+ mCD19t+ hingga 24 hari setelah transfer adopsi (Gambar Tambahan 12g). Paru-paru diambil dari tikus di kedua kelompok perlakuan dan STEAP1 IHC menunjukkan hilangnya ekspresi STEAP1 pada metastasis paru dari tikus yang diobati dengan sel T CAR STEAP1-mBBζ (Gambar Tambahan 12h). Kami kemudian memperluas garis klonal RM9-STEAP1-fLuc untuk menentukan apakah pelepasan antigen tumor yang diamati dapat disebabkan oleh heterogenitas yang sudah ada dalam ekspresi STEAP1. Percobaan diulangi dengan model tumor RM9-STEAP1- fLuc klonal yang disebarluaskan pada tikus NSG (Gambar Tambahan 13a). Dalam konteks ini, tikus yang diobati dengan sel T CAR STEAP1-mBBζ menunjukkan respons lengkap yang cepat dan tahan lama (Gambar Tambahan 13b – d). Temuan ini menyoroti potensi sel T STEAP1-mBBζ CAR dalam memberantas kanker prostat STEAP1+ dan selanjutnya menunjukkan bahwa strategi terapi tambahan mungkin diperlukan untuk mengatasi resistensi pada subkelompok pasien kanker prostat stadium lanjut di mana heterogenitas STEAP1 ekspresi hadir (Gbr. 1e).

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Terapi sel T CAR STEAP1 aman pada model tikus STEAP1 yang dimanusiakan

Untuk menyelidiki keamanan praklinis dan kemanjuran terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR, kami menginokulasi tikus hSTEAP1-KI heterozigot jantan dengan RM non-klonal syngeneik9-STEAP{{4} }sel fLuc dengan injeksi vena ekor (Gbr. 5a). Setelah konfirmasi kolonisasi metastasis oleh BLI sekitar seminggu kemudian, tikus menerima siklofosfamid pra-pengkondisian 100 mg/kg melalui injeksi intraperitoneal57. Sehari kemudian, tikus diacak untuk diberi pengobatan dengan sel T tikus 5 × 106 yang tidak ditransduksi atau sel T tikus STEAP1-mBBζ CAR dengan injeksi vena ekor. Semua tikus yang menerima sel T CAR STEAP1-mBBζ tikus menunjukkan penurunan beban tumor dalam minggu pertama inisiasi pengobatan berdasarkan BLI (Gbr. 5b, c). Respons yang diamati berumur pendek tetapi menyebabkan perpanjangan kelangsungan hidup yang sederhana (21 hari versus 12 hari, p=0.0138 dengan uji log-rank, Gambar 5d)—mirip dengan temuan dari RM non-klonal 9-STEAP1-percobaan fLuc pada tikus NSG (Gambar Tambahan 12d). Tidak ada toksisitas besar atau kematian dini yang secara khusus terkait dengan terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR T tikus pada tingkat dosis ini di mana bukti jelas kemanjuran antitumor diamati. Penurunan berat badan dikaitkan dengan peningkatan beban tumor tetapi umum terjadi pada kedua kelompok pengobatan (Gambar 5e, f). Untuk menilai lebih lanjut potensi toksisitas terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR, percobaan serupa dilakukan secara paralel pada tikus hSTEAP1-KI heterozigot yang mengandung tumor RM9-hSTEAP1 dan tanpa tumor. Tikus yang tidak mengandung tumor yang diobati dengan sel T yang tidak ditransduksi atau sel STEAP1- mBBζ CAR T tidak menunjukkan perbedaan dalam kelangsungan hidup (Gambar Tambahan 14a) atau toksisitas besar termasuk penurunan berat badan (Gambar Tambahan 14b). Karena STEAP1-BBζ CAR terdiri dari spacer IgG4 yang dimodifikasi yang mungkin berpotensi imunogenik, kami mengevaluasi respons antibodi anti-manusia (MAHA) tikus dengan mengumpulkan perdarahan retroorbital dari tikus dalam percobaan ini. Tidak ada antibodi IgG dan IgM anti-manusia yang terdeteksi dalam serum tikus pada hari ke 8 setelah pengobatan dengan sel T STEAP1-BBζ CAR T (Gambar Tambahan 14c).

Yang penting, tikus hSTEAP1-KI heterozigot yang diobati dengan sel T CAR STEAP1-mBBζ tidak menunjukkan gangguan jaringan yang jelas atau peningkatan infiltrasi sel T CD3+ di prostat (Gambar Tambahan 15a, b ) atau kelenjar adrenal (Gambar Tambahan 15c, d) relatif terhadap rekan-rekan mereka yang diobati dengan sel T yang tidak ditransduksi, menunjukkan tidak adanya toksisitas di luar tumor yang sesuai target. Paru-paru yang dikumpulkan pada akhir percobaan menunjukkan ekspresi STEAP1 manusia dalam metastasis paru RM9-hSTEAP1 dengan heterogenitas regional pada tikus yang diobati dengan sel T tikus yang tidak ditransduksi (Gbr. 5g). Di sisi lain, tumor dari tikus yang diobati dengan sel T CAR STEAP1-mBBζ tikus sekali lagi menunjukkan tidak adanya ekspresi STEAP1 manusia (Gbr. 5h). Untuk mengevaluasi apakah terapi sel T Cell STEAP1- mBBζ CAR tikus dan hilangnya antigen STEAP1 manusia juga dapat memengaruhi presentasi antigen pada tumor RM9-hSTEAP1, kami melakukan IHC untuk mikroglobulin murine beta-2-(B2m ) yang merupakan komponen kunci molekul MHC kelas I. Kami mengamati penurunan regulasi ekspresi B2m yang signifikan pada tumor progresif setelah pengobatan dengan sel T CAR STEAP1-mBBζ tikus dibandingkan dengan sel T yang tidak ditransduksi (Gambar Tambahan 15e, f), konsisten dengan temuan kami dalam model 22Rv1.

Gambar 4|Membangun sistem mouse-in-mouse dengan model mouse knock-in STEAP1 manusia (hSTEAP1-KI) dan STEAP1 CAR yang di-murinisasi. Skema yang menunjukkan strategi rekombinasi homolog menggunakan vektor penargetan untuk memasukkan ekson STEAP1 manusia 2–5 ke lokus Steap1 mouse pada latar belakang C57Bl/6. Target pengenalan FRT Flippase. b Visualisasi produk PCR dari genotipe ujung ekor tikus tipe liar (+/+), heterozigot (KI/+), atau homozigot (KI/KI) menggunakan pasangan primer yang dimaksudkan untuk memperkuat bagian alel wildtype atau hSTEAP1-KI . Kontrol templat nol NTC. Gambar gel representatif dari n=3 percobaan yang independen secara biologis. c qPCR untuk ekspresi STEAP1 manusia dinormalisasi menjadi ekspresi 18 S dalam survei jaringan dari tikus hSTEAP1-KI/+. n=3 untuk organ khusus jenis kelamin dan n=6 untuk organ umum. Batangan mewakili mean dengan SEM. Foto mikrograf pewarnaan STEAP1 IHC pada (d) jaringan prostat dari tikus (kiri) +/+ dan (kanan) KI/+ dan (e) kelenjar adrenal dari tikus KI/+. Bilah skala=50 µm. Untuk panel (d, e) immunostaining STEAP1 dilakukan pada n=3 spesimen yang independen secara biologis. f Skema konstruksi STEAP1 CAR yang dimurin secara retroviral. Virus leukemia murine MuLV, tikus mCD19t terpotong CD19. g Kuantifikasi efisiensi transduksi retroviral sel T tikus yang diaktifkan dari tiga percobaan independen berdasarkan frekuensi sel CD3+ CD19t+ tikus dengan flow cytometry (p {{40}}.0003). h Viabilitas sel relatif dari sel target RM9 atau RM9-hSTEAP1 dari waktu ke waktu diukur dengan pencitraan sel hidup fluoresensi pada kultur bersama dengan rasio 1:1 dengan sel STEAP1-mBBζ CAR T tikus atau sel T yang tidak ditransduksi (p <0,0001). n=4 replika biologis per kondisi. Bilah kesalahan mewakili mean dengan SEM. Untuk panel (g), digunakan uji-t Student dua sisi tidak berpasangan dengan koreksi Welch. Pada panel (h), digunakan ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Sidak. Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Gambar 5|Penentuan kemanjuran dan keamanan sel T STEAP1-mBBζ CAR T tikus pada tikus hSTEAP1-KI yang mengandung kanker prostat yang disebarluaskan secara sinergis.

Sitokin fusi domain pengikat kolagen-IL-12 memunculkan respons antitumor melalui peningkatan sinyal reseptor sel T dan presentasi antigen

IL{{0}} adalah sitokin heterodimerik yang terdiri dari subunit p40 dan p35 yang mengatur respons sel T dan mengarah pada produksi IFN-. Respons antitumor yang mencolok terkait dengan pemberian IL-12 sistemik telah ditunjukkan dalam beberapa model praklinis58,59 namun penerjemahan pendekatan terapeutik ini ke klinik terhenti karena toksisitas dan ketidakmanjuran yang membatasi dosis60–63. Strategi alternatif untuk menghindari masalah ini ditujukan untuk melokalisasi IL{{0}} pada tumor, baik melalui pengiriman intratumoral atau merekayasa protein fusi IL-12 untuk memanfaatkan sifat unik lingkungan mikro tumor. Salah satu pendekatan yang baru-baru ini dijelaskan adalah fusi ke domain von Willebrand faktor A3 yang berfungsi sebagai domain pengikat kolagen (CBD, Gambar 6a) dan memungkinkan pengikatan protein fusi ke kolagen yang terpapar pada pembuluh darah tumor yang tidak teratur64. Terapi CBD-IL-12 sistemik terbukti merombak lingkungan mikro tumor dari model kanker payudara murine dan melanoma yang "dingin" secara imunologis melalui peningkatan pensinyalan IFN dan bekerja sama dengan anti-PD{{20}} penghambatan pos pemeriksaan kekebalan untuk menginduksi pemberantasan tumor65. Kami bertanya apakah CBD-IL-12 efektif dalam mengubah kanker prostat dari "dingin" menjadi "panas" dan mendorong respons antitumor. Tumor subkutan, syngeneic RM9, dan Myc-CaP masing-masing ditemukan pada tikus C57Bl/6 dan FVB jantan, dan tikus diacak untuk diberi pengobatan dengan kendaraan, anti-PD-1, atau CBD-IL-12 . Pemberian CBD-IL-12 sistemik menginduksi penghambatan pertumbuhan tumor yang signifikan pada model tumor syngeneic RM9 dan Myc-CaP yang kurang responsif terhadap terapi anti-PD-1 (Gambar 6b, Gambar Tambahan. 16a) . Untuk mendapatkan wawasan lebih lanjut tentang mekanisme kerja CBD-IL-12, kami melakukan analisis RNA-seq (scRNA-seq) sel tunggal terhadap tumor RM9 dari tikus yang diobati dengan kendaraan atau CBDIL-12. Plot Pendekatan dan Proyeksi Manifold Seragam mengungkapkan penurunan substansial dalam kompartemen sel epitel tumor, fibroblas, dan endotel (Gambar Tambahan 16b) yang konsisten dengan aktivitas antitumor. Pembuatan profil berbasis penanda dari subset sel imun bawaan dan adaptif (Gbr. 6c,d) dalam data scRNA-seq mengidentifikasi peningkatan substansial dalam sel T CD8+ (7,55 vs. 0,76%) , sel presentasi silang antigen termasuk sel dendritik tipe 1 XCR1+ IRF8+ konvensional (cDC1, 1,33 vs. 0%), makrofag terpolarisasi CD86+ INOS2+ M1 ( 2,26 vs 0%), dan CD64+ F4/ 80+ monosit/makrofag (29,2 vs 4,43%) pada tumor dari kelompok pengobatan CBDIL-12 dibandingkan dengan kelompok kontrol kendaraan. Penurunan makrofag terpolarisasi CD163+ CD206+ M2 imunosupresif (0 vs. 0,25%) dan neutrofil Ly6G+ (0,52 vs. 1,08%) juga dikaitkan dengan terapi CBD-IL-12. Analisis IHC mengonfirmasi bahwa tumor RM9 yang diobati dengan kendaraan umumnya tidak memiliki sel T CD8+ sedangkan tumor yang diobati dengan CBD-IL-12 menunjukkan infiltrasi sel T CD8+ yang signifikan (Gambar Tambahan 16c) . Sel tumor menunjukkan ekspresi yang diperkaya dari subunit proteasome dan immunoproteasome Psmb8 dan Psmb9 serta gen kompleks histokompatibilitas utama kelas I (MHC I) H2-K1, H2-D1, dan B2m, konsisten dengan peningkatan regulasi pemrosesan antigen dan mesin presentasi (Gbr. 6e, Gambar Tambahan 16d). Secara paralel, sel T menunjukkan peningkatan ekspresi gen yang terkait dengan pensinyalan reseptor sel T dan interaksi imunoregulasi antara limfoid dan sel non-limfoid (Gambar 6f, Gambar Tambahan 16e). Sel-sel sistem fagosit mononuklear (MPS) menunjukkan ekspresi gen yang diperkaya terkait dengan pemrosesan antigen dan presentasi silang serta pensinyalan sitokin (Gambar Tambahan 16f, g). Studi-studi ini menetapkan aktivitas antitumor CBD-IL- 12 pada model kanker prostat melalui pemrograman ulang lingkungan mikro tumor dan keterlibatan sistem kekebalan bawaan dan adaptif.

Peningkatan pengendalian tumor dengan terapi STEAP1-mBBζ CAR T cell dan CBD-IL-12 secara bersamaan

Kami selanjutnya berhipotesis bahwa memperluas respons imun antitumor dengan terapi CBD-IL-12 dapat meningkatkan kemanjuran terapi terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR pada kanker prostat dengan memerangi heterogenitas antigen tumor dan menyelamatkan pemrosesan antigen dan presentasi. Oleh karena itu, kami menetapkan metastasis RM9-STEAP1-fLuc non-klonal syngeneic pada tikus hSTEAP1-KI heterozigot jantan dan mengacak pengobatan dengan 5 × 106 sel T tikus yang tidak ditransduksi atau sel STEAP1-mBBζ CAR T tikus dengan injeksi vena ekor dengan atau tanpa terapi CBD-IL-12 mingguan dengan injeksi sinus retroorbital. Kelompok yang menerima terapi CBD-IL-12 saja atau dalam kombinasi dengan terapi STEAP1-mBBζ CAR T tidak menerima siklofosfamid pengurang limfoid (Gbr. 7a). Serial BLI mengungkapkan perkembangan penyakit yang cepat pada tikus yang diobati dengan sel T yang tidak ditransduksi dan CBD-IL-12 sementara tikus yang menerima sel STEAP1-BBζ CAR T yang dikombinasikan dengan terapi CBD-IL-12 menunjukkan perkembangan penyakit yang signifikan keterlambatan perkembangan tumor (Gbr. 7b, c). Yang penting, pengobatan gabungan dengan sel STEAP1- mBBζ CAR T tikus dan CBD-IL-12 mingguan dikaitkan dengan perluasan yang signifikan secara statistik dalam kelangsungan hidup secara keseluruhan bila dibandingkan dengan semua kelompok perlakuan lainnya (Gbr. 7d). Analisis sitokin plasma pada perdarahan retroorbital yang dikumpulkan pada hari ke 0 dan hari ke 8 pengobatan menunjukkan peningkatan yang signifikan pada kadar sitokin proinflamasi IFN-, TNF-, IL-6, dan IL-4 (Gambar 7e, Gambar Tambahan .17) pada tikus yang diobati dengan sel STEAP1-mBBζ CAR T dan CBD-IL-12. Tumor sisa dikumpulkan saat nekropsi dan STEAP1 IHC menunjukkan hilangnya antigen pada tumor dari tikus yang diobati dengan sel STEAP1- mBBζ CAR T saja dan dalam kombinasi dengan CBD-IL-12 (Gbr. 8a). Selain itu, kami mengamati peningkatan ekspresi tumor B2m (Gambar 8a) yang terkait dengan terapi CBD-IL-12. Sel T CD3+ juga meningkat (Gambar 8b) pada kondisi tumor yang menjalani terapi IL-12 tetapi, meskipun ada tren yang diapresiasi, kami tidak menemukan peningkatan sel T intratumoral yang signifikan secara statistik antara STEAP1-mBBζ CAR T cell dan gabungan kelompok perlakuan STEAP1-mBBζ CAR T cell dan CBD-IL-12. Tumor sisa termasuk tumor dari tikus yang diobati dengan kombinasi sel STEAP1-mBBζ CAR T dan CBD-IL-12 yang dikumpulkan pada respons pengobatan maksimal (nadir) pada hari ke 10 dan pada titik akhir perkembangan tumor (kambuh) adalah dipisahkan menjadi sel tunggal dan subset sel imun dikarakterisasi dengan sitometri aliran multiparametrik (Gambar Tambahan 18). Sesuai dengan hasil scRNA-seq kami, pengobatan CBD-IL-12 baik sendiri atau dalam kombinasi dengan sel STEAP1-mBBζ CAR T menyebabkan peningkatan yang signifikan pada CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68 }} Makrofag MHC-II+ (Gambar 8c, d, Gambar tambahan 19a). Sel CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ mewakili makrofag penyaji antigen matang66 dan populasi ini diperkaya secara istimewa dan menunjukkan peningkatan ekspresi nitric oxide synthase (iNOS) yang diinduksi sebagai penanda polarisasi M1 proinflamasi dengan CBD-IL{{84} } terapi. Kami juga mengamati perluasan populasi cDC1 dan pengurangan populasi sel dendritik tipe 2 konvensional (cDC2) (Gambar 8e, Gambar Tambahan 19b). cDC1 telah terlibat dalam aktivasi sel T CD8+ sitotoksik antitumor dan mekanisme potensial resistensi terapeutik. Kami tidak menemukan tanda-tanda migrasi sel ke tumor sementara cDC2 penting untuk aktivasi perbedaan yang signifikan dalam rasio KLRG1+ dan KLRG1- pembunuh alami sel T CD4+ termasuk Tregs67 . Konsisten dengan temuan cDC2, sel-sel di seluruh kelompok perlakuan (Gambar Tambahan 19d). Pembuatan profil frekuensi CD4+ FOXP3+ Treg menunjukkan penurunan asosiasi Treg dari eosinofil F40/80+ SiglecF+ meningkat sementara Ly6G+ dineusiasi dengan terapi CBD-IL-12 (Tambahan Gambar 19c). Yang menarik, trofil menurun dengan penambahan CBD-IL-12 ke STEAP1- kami mengamati bahwa pada tumor yang kambuh setelah kombinasi terapi sel T CAR STEAP1-mBBζ mBBζ CAR (Gbr. 8f, G). Khususnya, pada frekuensi terapi sel CAR T dan CBD-IL-12 terdapat penurunan cDC1 dan neutrofil terkait tumor meningkat dengan pengobatan dengan peningkatan Treg, yang berimplikasi pada berkurangnya priming CD8 STEAP{{120 }}sel T CAR mBBζ dibandingkan dengan sel T yang tidak ditransduksi (54 vs. sel T dan pengayaan sinyal Treg imunosupresif sebesar 34%), berkurang pada kondisi dengan terapi CBD-IL-12, namun meningkat saat tumor kambuh setelah kombinasi STEAP Terapi 1-mBBζ sel CAR T dan CBD-IL-12 (19 hingga 42%). Temuan ini menunjukkan bahwa sifat imunosupresif neutrofil terkait tumor mungkin memainkan peran penting dalam memediasi resistensi pengobatan dan perkembangan tumor. Secara keseluruhan, analisis ini menunjukkan bahwa pengobatan CBD-IL-12 mengembalikan lingkungan tumor imunosupresif yang bermusuhan ke keadaan pro-inflamasi dan memperluas aktivitas antitumor bersamaan dengan terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR yang ditransfer secara adaptif. Kami selanjutnya melakukan analisis repertoar TCR menggunakan sekuensing rantai beta TCR berbasis PCR multipleks pada tumor paru-paru yang dikumpulkan dari masing-masing kelompok perlakuan di nekropsi. Kami mengamati penurunan signifikan dalam klonalitas Simpson pada sampel dari tikus yang diobati dengan CBD-IL-12 saja dan dalam kombinasi dengan terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR yang menunjukkan peningkatan keragaman sel T intratumoral (Gbr. 2). 8 jam). Temuan ini menetapkan bahwa menambahkan CBD-IL-12 sebagai tambahan pada terapi sel T STEAP1 CAR mungkin bermanfaat melalui renovasi lingkungan mikro tumor kanker prostat, meningkatkan pemrosesan dan presentasi antigen, dan melibatkan kekebalan inang untuk mendorong penyebaran epitop.

Gambar 6|Terapi fusi sitokin domain pengikat kolagen sistemik IL-12 (CBD-IL-12) menghambat pertumbuhan tumor kanker prostat dan memprogram ulang lingkungan mikro imun tumor. Skema CBD-IL-12, terdiri dari subunit p35 dan p40 yang digabungkan ke CBD dari domain faktor von Willebrand A3. b Volume tumor subkutan RM9 pada tikus C57Bl/6 syngeneic dari waktu ke waktu dengan pengobatan dengan kendaraan, anti-PD-1 (klon 29 F.1A12) 200 Μg melalui injeksi intraperitoneal setiap 5 hari, atau CBD-IL-12 25 Μg melalui suntikan intravena setiap 5 hari mulai hari ke 0. n=7 tikus dalam kendaraan dan kelompok perlakuan CBD-IL-12 dan n=8 tikus dalam kelompok anti Kelompok perlakuan -PD1. p <0,0001 pada hari ke 9 dan 12. Batang mewakili mean dengan SEM. P-value diperoleh dari ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Dunnett, tidak signifikan. c Plot Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) dari subset sel imun yang berbeda (atas) dari analisis RNA-seq (scRNA-seq) sel tunggal dari lima tumor RM9 yang masing-masing dikumpulkan dari tikus yang diobati dengan kendaraan atau CBD-IL{{41} }. Plot UMAP diwarnai dengan ekspresi gen penanda spesifik subset sel imun untuk pan-monosit/makrofag, makrofag terpolarisasi M1 dan M2, sel dendritik tipe 1 konvensional (cDC1), sel pembunuh alami (NK), dan T helper tipe 1 (Th1) sel. d Plot yang menunjukkan frekuensi populasi sel imun spesifik (relatif terhadap sel imun CD45 +) yang diidentifikasi dengan analisis scRNA-seq termasuk sel T CD4+ dan CD8+, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) dan sel Th2 (cMAF+ Gata3+ ), Ly6C+/− monosit/makrofag (Ly6C+/− Adgre1+ ), makrofag M1 (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), makrofag M2 (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), sel dendritik tipe 2 konvensional (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), sel dendritik CD103+ yang bermigrasi (Itgae+ ), eosinofil (SiglecF+ ), neutrofil (Ly6G+), dan sel NK (Klrb1c+ Ncr1+ ) pada tumor yang diobati dengan kendaraan atau CBDIL-12. Plot gunung berapi menunjukkan ekspresi gen diferensial dalam (e) sel tumor dan (f) sel T dari tumor RM9 pada tikus yang diobati dengan CBD-IL-12 dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan kendaraan. Perubahan lipatan FC, tingkat penemuan palsu FDR. Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Diskusi

Efektivitas terapi sel CAR T dan terapi target berbasis kekebalan lainnya sangat bergantung pada ekspresi antigen yang konsisten pada semua atau sebagian besar sel yang menyusun populasi tumor dalam satu pasien. Namun, heterogenitas antigen terlihat jelas pada tumor padat termasuk kanker prostat, di mana perkembangan menjadi mCRPC dan resistensi pengobatan dikaitkan dengan munculnya subtipe penyakit yang berbeda yang ditandai dengan program transkripsional yang berbeda–71 dan ekspresi antigen permukaan sel. Meskipun PSMA dianggap sebagai salah satu biomarker utama pada kanker prostat dengan ekspresi berlebih yang signifikan yang ditemukan di seluruh spektrum perkembangan penyakit, penelitian kami menguatkan temuan dari publikasi baru-baru ini yang menunjukkan bahwa ekspresi PSMA bersifat heterogen pada mCRPC yang mematikan. Kami menunjukkan bahwa STEAP1 diekspresikan secara lebih luas dibandingkan PSMA pada kondisi ini namun tidak diekspresikan secara seragam pada level tinggi di semua jaringan mCRPC. Tidak ada terapi bertarget antigen tunggal termasuk terapi sel CAR T yang mungkin mampu mengatasi heterogenitas antigen tumor yang sudah ada sebelumnya di mCRPC. Oleh karena itu, sangat penting untuk benar-benar memercayai target terapi tambahan seperti STEAP1 di mCRPC yang memungkinkan terapi kombinatorial yang memberikan tekanan terapeutik yang tidak dapat diatasi. Hal ini termasuk terapi sel T CAR yang ditargetkan secara antigen ganda (misalnya, PSMA dan STEAP1) atau strategi multimodal yang menggabungkan terapi sel CAR T dengan ADC, T-BsAb, atau pengobatan lain yang berpotensi mendorong pembunuhan tumor yang tidak bergantung pada antigen dan tidak bergantung pada antigen. Kami merekayasa terapi sel T CAR bertarget STEAP1-yang sangat spesifik antigen dan secara fungsional melokalisasi epitop yang dikenali oleh CAR ke ECD kedua STEAP1. Sel T STEAP1-BBζ CAR T kami menunjukkan aktivitas antitumor yang substansial terhadap berbagai model kanker prostat yang disebarluaskan baik dalam penelitian manusia-dalam-tikus maupun tikus-dalam-tikus. Yang penting, STEAP1-BBζ CAR kami mampu menginduksi aktivasi sel T dan sitolisis sel target bahkan dalam kondisi kepadatan antigen rendah, sebagaimana dibuktikan oleh reaktivitas terhadap model kanker prostat PC3. Namun, sensitivitas sel T STEAP1-BBζ CAR terhadap tingkat ekspresi STEAP1 yang rendah mungkin bermanfaat dari sudut pandang peningkatan kemanjuran antitumor tetapi juga dapat menonjolkan tanggung jawab dari toksisitas di luar tumor yang sesuai target. Ekspresi sistemik STEAP1 sebelumnya telah dilaporkan hampir tidak ada pada jaringan manusia normal18,72 kecuali kelenjar prostat dimana ekspresi membran dalam sel epitel prostat telah dijelaskan27. Untuk menyelidiki keamanan terapi sel T STEAP1-BBζCAR dalam pengaturan praklinis, kami membuat model tikus STEAP1 yang dimanusiakan. Model tikus hSTEAP1-KI merekapitulasi ekspresi STEAP1 manusia di kelenjar prostat dan menunjukkan ekspresi di korteks adrenal. Yang meyakinkan, terapi sel T STEAP1-BBζ CAR T dengan dosis yang cukup untuk menginduksi aktivitas antitumor tidak menyebabkan toksisitas sistemik yang nyata pada tikus hSTEAP1-KI termasuk toksisitas di luar tumor yang ditargetkan di lokasi STEAP1 manusia ekspresi. Mekanisme berulang dari kekambuhan dan perkembangan kanker prostat setelah terapi sel T STEAP1-BBζ CAR dalam penelitian kami adalah pelepasan antigen tumor. Di satu sisi, temuan ini menggarisbawahi potensi keseluruhan terapi sel T STEAP1-BBζ CAR. Namun, tidak jelas apakah hilangnya ekspresi tumor STEAP1 semata-mata karena heterogenitas antigen tumor yang melekat atau apakah ada juga penurunan regulasi adaptif dari ekspresi STEAP1. Sebuah publikasi baru-baru ini menunjukkan bahwa metilasi promotor STEAP1 memodulasi ekspresi STEAP1 dan deregulasi epigenetik oleh DNA metiltransferase dan penghambatan histone deacetylase sudah cukup untuk meningkatkan regulasi ekspresi STEAP1 secara signifikan73. Pengobatan dengan inhibitor epigenetik dalam kombinasi dengan terapi sel T CAR STEAP1 secara bersamaan dapat meningkatkan ekspresi tumor STEAP1 dan memprogram ulang sel CAR T ke keadaan diferensiasi yang tahan terhadap kelelahan74,75, sehingga mengurangi kehilangan antigen tumor dan meningkatkan kemanjuran antitumor pada kanker prostat. Penelitian kami juga mengimplikasikan STEAP1 memainkan peran fungsional dalam mengatur perkembangan siklus sel dan metabolisme sel pada kanker prostat. STEAP1 unik dari anggota keluarga STEAP lainnya (STEAP2, 3, dan 4) karena tidak memiliki domain oksidoreduktase intraseluler yang diperlukan untuk aktivitas metalo reduktase. Akibatnya, homotrimer STEAP1, tetapi bukan heterotrimer dengan protein STEAP lainnya, tidak memiliki fungsi enzimatik untuk mereduksi Fe3+ menjadi Fe2+ dan Cu2+ menjadi Cu1+. Apakah dan bagaimana keterlibatan STEAP1 dalam ion logam dan metabolisme sel mendorong perkembangan kanker masih belum ditentukan dan layak untuk diselidiki lebih lanjut. Lingkungan mikro tumor kanker prostat yang 'dingin' secara imunologis merupakan penghalang utama terhadap kemanjuran imunoterapi kanker. Misalnya, studi eksplorasi yang terkait dengan uji klinis fase I terapi sel PSMA CAR T yang dilapisi untuk mengekspresikan reseptor faktor pertumbuhan transformasi dominan-negatif (TGF R-DN) di mCRPC menunjukkan bahwa ekspresi molekul pemberi sinyal imunosupresif di lingkungan mikro tumor meningkat. setelah infus CAR T13. Dalam penelitian kami, temuan penting adalah hubungan antara hilangnya ekspresi STEAP1 dan penurunan regulasi pemrosesan dan presentasi antigen, baik pada sel KO STEAP1 maupun pada tumor yang kehilangan antigen STEAP1 setelah terapi sel T STEAP1-BBζ CAR. Dengan demikian, hilangnya antigen STEAP1 pada kanker prostat tidak hanya meningkatkan resistensi langsung terhadap terapi sel T STEAP1-BBζ CAR tetapi juga dapat membatasi kekebalan antitumor adaptif inang. Hilangnya ekspresi antigen target tumor dan konversi ke keadaan yang lebih imunosupresif dengan peningkatan infiltrasi Treg dan ekspresi molekul imunosupresif yang lebih tinggi juga telah diamati dalam studi fase I sel T CAR EGFR-vIII pada peserta dengan glioblastoma berulang76. Penelitian tambahan akan diperlukan untuk memahami mekanisme fungsional yang mendasari hilangnya antigen STEAP1 dan secara lebih umum bagaimana efek dinamis dari terapi sel CAR T adaptif dapat berkontribusi terhadap hilangnya antigen dan imunoediting dengan memodulasi interaksi tumor-imun-stromal pada tumor padat.

Gambar 7|Menggabungkan CBD-IL-12 dengan terapi sel STEAP1-mBBζ CAR T meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan dan tingkat sitokin inflamasi. skema eksperimen tantangan tumor untuk model yang disebarluaskan RM9-hSTEAP1 pada tikus hSTEAP1-KI/+ yang menyelidiki kombinasi CBD-IL-12 dengan STEAP{{1{{18} }}}terapi sel T CAR mBBζ. Cy cyclophosphamide (untuk pengkondisian awal). Dibuat dengan BioRender.com. b BLI langsung serial dari tikus hSTEAP1-KI/ + yang dibuat dengan metastasis RM9-hSTEAP1- fLuc dan diobati dengan suntikan intravena tunggal 5 × 106 tikus yang tidak ditransduksi Sel T atau sel STEAP1-mBBζ CAR T pada hari 0 dengan atau tanpa pengobatan CBD-IL- 12 setiap minggu. X Merah menandakan tikus yang sudah mati. Skala pancaran ditampilkan. (c) Plot yang menunjukkan kuantifikasi fluks total dari waktu ke waktu dari BLI langsung setiap tikus di (b). d Kurva kelangsungan hidup tikus Kaplan–Meier di (b) dengan signifikansi statistik ditentukan oleh uji log-rank (Mantel-Cox) (p=0.002). e Plot yang menunjukkan kadar sitokin serum IFN- (kiri, p=0.002) dan TNF- (kanan, p <0.0001) berdasarkan immunoassay ProcartaPlex dari perdarahan retroorbital tikus hSTEAP1-KI/+ ( n=4 tikus per kelompok) yang mengandung metastasis RM9-hSTEAP1-fLuc sebelum (hari 0) dan setelah pengobatan (hari 8) dengan sel T tikus yang tidak ditransduksi atau STEAP tikus{{38} }mBBζ sel CAR T dengan atau tanpa terapi CBD-IL-12. Bilah kesalahan mewakili mean dengan SEM. Untuk panel (e), nilai p diperoleh dari ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Sidak. Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Gambar 8|Menggabungkan CBD-IL-12 dengan terapi sel T STEAP1-mBBζ CAR memprogram ulang lingkungan mikro imun tumor dan mendorong presentasi antigen dan penyebaran epitop. a Fotomikrograf STEAP1 (atas), B2m (tengah), dan CD3 (bawah) pewarnaan IHC tumor paru RM9-hSTEAP1 setelah pengobatan dengan sel T tikus yang tidak ditransduksi atau sel T CAR STEAP1-mBBζ dengan atau tanpa pengobatan CBD-IL-12. Bilah skala=50 µm. b Plot batang menunjukkan kuantifikasi IHC sel positif CD3 yang menginfiltrasi tumor paru-paru metastatik (n=4 tumor per kelompok). ANOVA satu arah p=0.{{80}}021. Bilah kesalahan mewakili rata-rata dengan SD. Plot yang menunjukkan frekuensi (c) Ly6C− F4/{{20}} MHC-II+ (kiri, ANOVA satu arah p=0.00{ {98}}5) dan Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (kanan, ANOVA satu arah p=0.0017) makrofag, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } Makrofag MHC-II+ (kiri, ANOVA satu arah p=0.0038) dan Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (kanan, ANOVA satu arah p=ns), (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (ANOVA satu arah p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eosinofil (ANOVA satu arah p=0. 0008), dan (g) neutrofil Ly6G+ (ANOVA satu arah p=0.0035) dinormalisasi menjadi sel CD45+ total sebagaimana ditentukan oleh sitometri aliran multiparametrik setelah pengobatan dengan sel T yang tidak ditransduksi, STEAP{{67 }}mBBζ sel CAR T, sel T yang tidak ditransduksi dan CBD-IL-12, dan STEAP1- mBBζ sel CAR T dan CBD-IL-12 pada respons pengobatan maksimal (nadir) dan kekambuhan tumor (kambuh). h Plot batang mewakili klonalitas Simpson sebagai ukuran 'kemerataan' dari repertoar TCR yang dianalisis dengan pengurutan TCRB pada sel-sel yang menginfiltrasi tumor yang dikumpulkan dari tikus di (a). n=4 tumor per kelompok. Nilai-P untuk sel T yang tidak ditransduksi + CBD-IL-12 dibandingkan dengan sel T yang tidak ditransduksi dan sel T CAR STEAP1-mBBζ masing-masing adalah 0,008 dan 0,02; dan sel T CAR STEAP1-mBBζ + CBD-IL-12 dibandingkan dengan sel T CAR yang tidak ditransduksi dan STEAP1-mBBζ masing-masing adalah 0,004 dan 0,01. Bilah kesalahan mewakili rata-rata dengan SD. Untuk panel (c–g) n=3 tumor per kelompok, *p <0,05; **p <0,01, ***p <0,001, nilai p dalam panel (b–h) berasal dari ANOVA satu arah dengan uji perbandingan berganda Dunn. Sumber data disediakan dalam file Data Sumber.

Untuk memperluas respons antitumor, kami menyelidiki pemberian CBD-IL-12 sistemik yang dikombinasikan dengan terapi sel T STEAP1-BBζ CAR dalam model tumor RM9-hSTEAP1 yang disebarluaskan dan sinergis dalam hSTEAP 1-Tikus KI memperkirakan sifat imunosupresif mCRPC berdasarkan karakterisasi RM9 sebelumnya sebagai model imunogenik yang buruk57,77. Pengobatan bersama dengan CBD-IL12 menghasilkan peningkatan kelangsungan hidup secara keseluruhan, produksi sitokin, presentasi antigen tumor, dan keragaman sel T intratumoral yang konsisten dengan penyebaran epitop. Investigasi mendalam terhadap lingkungan mikro imun tumor mengungkapkan bahwa menambahkan CBD-IL-12 ke terapi sel T STEAP1-BBζ CAR menginduksi pengembalian stroma tumor dan meningkatkan makrofag teraktivasi dan cDC1 sekaligus mengurangi neutrofil terkait tumor. Namun, penyembuhannya tidak tercapai dalam penelitian kami, dan kami menyoroti potensi kompensasi, mekanisme adaptif resistensi dan perkembangan tumor termasuk peningkatan frekuensi neutrofil imunosupresif dan cDC2 yang dapat mendorong induksi Treg. Penting untuk diperhatikan bahwa optimalisasi dosis dan jadwal pemberian CBD-IL lebih lanjut-12 mungkin diperlukan untuk memaksimalkan respons antitumor. Namun, hasil ini mendukung penyelidikan pendekatan imunoterapi kombinatorial seperti melapisi sel CAR T untuk mengekspresikan sitokin rekombinan78 (misalnya, IL-2, IL-12, IL-15, atau IL{{24 }}), pengobatan bersamaan dengan imunomodulator (misalnya, anti-PD-1/PD-L1 atau anti-CTLA4), atau radioterapi yang diarahkan pada tumor untuk merombak lingkungan mikro tumor kanker prostat dan meningkatkan fungsi efektor sel CAR T. Sementara naskah ini sedang dalam persiapan, sebuah penelitian dari sebuah kelompok di Norwegia melaporkan pengembangan praklinis terapi sel T CAR STEAP1 dengan aktivitas antitumor dalam model 22Rv1 subkutan pada tikus dengan sistem kekebalan yang lemah79. CAR STEAP1 yang dilaporkan berbeda dari STEAP1-BBζ CAR karena menggabungkan scFv sintetis yang disebut Oslo1 dan engsel CD8 serta domain transmembran. Fitur pembeda lainnya adalah sel T STEAP1-BBζ CAR disiapkan sebagai produk tertentu dengan rasio normal sel T CD4/CD8 sedangkan sel T CAR Oslo1 STEAP1 tidak. Mekanisme studi resistensi dan keamanan terkait dengan terapi sel T CAR Oslo1 STEAP1 tidak dilaporkan. Namun, akan menarik untuk melihat bagaimana perbedaan dalam rekayasa CAR dan komposisi produk sel ini dapat berdampak pada kemanjuran, persistensi, dan keamanan antitumor baik sebagai terapi sel T CAR Oslo1 STEAP1 maupun terapi sel T STEAP1-BBζ CAR kami program diterjemahkan ke klinik. Temuan penelitian kami telah menghasilkan kemitraan dengan Program Terapi Eksperimental (NExT) National Cancer Institute (NCI) untuk menerjemahkan terapi sel T STEAP1-BBζ CAR menjadi uji coba pertama pada manusia untuk pria dengan mCRPC. Sinyal keamanan dan kemanjuran dari uji klinis fase awal ini akan membantu menentukan apakah ada gunanya menyelidiki pendekatan terapeutik ini untuk jenis kanker lain yang sangat mengekspresikan STEAP1.

Referensi

1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Statistik kanker, 2022. CA: Cancer J. Dokter 72, 7–33 (2022).

2. Armstrong, AJ dkk. Prediksi kelangsungan hidup lima tahun dan hasil keamanan dengan enzalutamide pada pria dengan kanker prostat yang resisten terhadap pengebirian metastatik yang naif kemoterapi dari Uji Coba PREVAIL. euro. Urol. 78, 347–357 (2020).

3. Fizazi, K. dkk. Abiraterone plus prednison pada kanker prostat yang metastatik dan sensitif terhadap pengebirian. N.Inggris. J.Med. 377, 352–360 (2017).

4. Scher, HI dkk. Peningkatan kelangsungan hidup dengan enzalutamide pada kanker prostat setelah kemoterapi. N.Inggris. J.Med. 367, 1187–1197 (2012).

5. Parker, C. dkk. Radium pemancar alfa-223 dan kelangsungan hidup pada kanker prostat metastatik. N.Inggris. J.Med. 369, 213–223 (2013).

6. Sartor, O. dkk. Lutetium-177–PSMA-617 untuk kanker prostat resisten pengebirian metastatik. N.Inggris. J.Med. 385, 1091–1103 (2021).

7. Kantoff, PW dkk. Imunoterapi Sipuleucel-T untuk kanker prostat yang resisten terhadap pengebirian. N.Inggris. J.Med. 363, 411–422 (2010).

8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ Mengemudi sel T CAR ke depan. Nat. Pendeta Klinik. Onkol. 13, 370–383 (2016).

9. Weiner, GJ Membangun terapi berbasis antibodi monoklonal yang lebih baik. Nat. Pendeta Kanker 15, 361–370 (2015).

10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA Terapi sel T CAR untuk limfoma sel B: hasil uji klinis dari produk yang tersedia. Adv Terapi. Hematol. 10, 2040620719841581 (2019).

11. Terapi sel Sterner, RC & Sterner, RM CAR-T: keterbatasan saat ini dan strategi potensial. Kanker Darah J.11, 69 (2021).

12. Slovin, SF dkk. Studi fase 1 sel P-PSMA-101 CAR-T pada pasien dengan kanker prostat tahan pengebirian metastatik (mCRPC). J.Klin. Onkol. 40, 98–98 (2022).

13. Narayan, V. dkk. TGF yang menargetkan PSMA -sel CAR T lapis baja yang tidak sensitif pada kanker prostat yang resistan terhadap pengebirian metastatik: uji coba fase 1. Nat. medis. 28, 724–734 (2022).

14. Paschalis, A. dkk. Heterogenitas antigen membran spesifik prostat dan cacat perbaikan DNA pada kanker prostat. Euro. Urol. 76, 469–478 (2019).

15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Mengemudi MOBIL di jalan heterogenitas antigen yang tidak rata pada tumor padat. Saat ini. Pendapat. imunol. 51, 103–110 (2018).

16. Morgan, RA dkk. Laporan kasus tentang efek samping yang serius setelah pemberian sel T yang ditransduksi dengan reseptor antigen chimeric yang mengenali ERBB2. mol. Ada. Selai. sosial. Gen Ada. 18, 843–851 (2010).

17. Lee, JK dkk. Profil permukaan permukaan sistemik mengidentifikasi antigen target untuk terapi berbasis kekebalan pada subtipe kanker prostat stadium lanjut. Proses. Natal. Akademik. Sains. AS 115, E4473–e4482 (2018).

18. Hubert, RS dkk. STEAP: antigen permukaan sel spesifik prostat yang sangat diekspresikan pada tumor prostat manusia. Proses. Natal Acad. Sains. AS 96, 14523–14528 (1999).

19. Nolan-Stevaux, O. Abstrak DDT02-03: AMG 509: Sebuah novel, manusiawi, perpanjangan waktu paruh, sel T bispesifik STEAP1 × CD3 yang merekrut antibodi XmAb® 2+1. Res Kanker. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).

20. Grunewald, TG dkk. Ekspresi STEAP1 yang tinggi dikaitkan dengan peningkatan hasil pada pasien sarkoma Ewing. Ann. Onkol. Mati. J.Eur. sosial. medis. Onkol. 23, 2185–2190 (2012).

21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. STEAP1 diekspresikan secara berlebihan pada kanker: target terapi yang menjanjikan. Biokimia. Biofisika. Res. Komunitas. 429, 148–155 (2012).

22. Oosterheert, W. & Gros, P. Struktur mikroskop cryo-elektron dan fungsi enzimatik potensial dari antigen epitel enam transmembran manusia dari prostat 1 (STEAP1). J.Biol. kimia. 295, 9502–9512 (2020).

23. Jiao, Z. dkk. Antigen epitel enam transmembran dari ekspresi prostat 1 mendorong metastasis kanker ovarium dengan membantu perkembangan transisi epitel ke mesenkim. Histokimia. Biol Sel. 154, 215–230 (2020).

24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, CR & Maia, CJ STEAP1 diekspresikan secara berlebihan pada kanker prostat dan lesi neoplasia intraepitel prostat, dan berhubungan positif dengan skor Gleason. Dalam Onkologi Urologi: seminar dan investigasi asli. jilid. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014).

25. Huo, S.-f. dkk. STEAP1 memfasilitasi metastasis dan transisi epitel-mesenkim adenokarsinoma paru melalui jalur pensinyalan JAK2/STAT3. biosci. Rep.40, BSR20193169 (2020).

26. Gomes, IM dkk. Knockdown STEAP1 menghambat pertumbuhan sel dan menginduksi apoptosis pada sel kanker prostat LNCaP yang melawan efek androgen. medis. Onkol. 35, 1–10 (2018).

27. Protein Gomes, IM, Maia, CJ & Santos, CR STEAP: dari struktur hingga aplikasi dalam terapi kanker. mol. Res Kanker. MCR 10, 573–587 (2012).

28. Danila, DC dkk. Studi fase I DSTP3086S, konjugat obat-antibodi yang menargetkan antigen epitel enam-transmembran prostat 1, pada kanker prostat yang resistan terhadap pengebirian metastatik. J.Klin. Onkol. Mati. Selai. sosial. Klinik. Onkol. 37, 3518–3527 (2019).

29. Kelly, WK dkk. Studi fase I AMG 509, sel T STEAP1 x CD3 yang merekrut terapi imun XmAb 2+1, pada pasien dengan kanker prostat tahan pengebirian metastatik (mCRPC). J.Klin. Onkol. 38, TPS5589–TPS5589 (2020).

30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Novel antibodi bispesifik anti-STEAP1 yang ampuh untuk mengarahkan sel T untuk imunoterapi kanker. J. Imun lainnya. Kanker 9, e003114 (2021).

31. Schober, SJ dkk. Sel T CD4(+) TCR-Transgenik Terbatas MHC Kelas I Terhadap STEAP1 Memediasi Pengendalian Tumor Lokal Sarkoma Ewing Di Vivo. Sel 9, 1581 (2020).

32. Roudier, MP dkk. Heterogenitas fenotipik karsinoma prostat stadium akhir yang bermetastasis ke tulang. Bersenandung. jalan. 34, 646–653 (2003).

33. Gomes, IM, Santos, CR, Socorro, S. & Maia, CJ Enam antigen epitel membran trans prostat 1 diatur ke bawah oleh hormon seks dalam sel prostat. Prostat 73, 605–613 (2013).

34. Tajam, A. dkk. Ekspresi varian sambungan reseptor androgen-7 muncul dengan resistensi pengebirian pada kanker prostat. J.Klin. Menginvestasikan. 129, 192–208 (2019).

35. Bakht, MK dkk. Diferensiasi neuroendokrin kanker prostat menyebabkan penekanan PSMA. Endokr.-Relat. Kanker 26, 131–146 (2018).

36. Ihlaseh-Catalano, SM dkk. Ekspresi berlebih protein STEAP1 adalah penanda independen untuk kekambuhan biokimia pada karsinoma prostat. Histopatologi 63, 678–685 (2013).

37. Gomes, IM dkk. Knockdown STEAP1 menghambat pertumbuhan sel dan menginduksi apoptosis pada sel kanker prostat LNCaP yang melawan efek androgen. medis. Onkol. 35, 40 (2018).

38. Logan, AC dkk. Faktor-faktor yang mempengaruhi titer dan infektivitas vektor lentiviral. Bersenandung. Gen Ada. 15, 976–988 (2004).

39. Morgan, RA, Gray, D., Lomova, A. & Kohn, DB Terapi gen sel induk hematopoietik: kemajuan dan pembelajaran. Sel Induk Sel 21, 574–590 (2017).

40. Larson, SM dkk. Pengembangan praklinis modifikasi gen sel induk hematopoietik dengan reseptor antigen chimeric untuk imunoterapi kanker. Bersenandung. Imunoterapi Vaksin. 13, 1094–1104 (2017).

41. Salter, AI dkk. Analisis fosfoproteomik dari pensinyalan reseptor antigen chimeric mengungkapkan perbedaan kinetik dan kuantitatif yang mempengaruhi fungsi sel. Sains. Sinyal. 11, eaat6753 (2018).

42. Majzner, RG dkk. Menyesuaikan persyaratan kepadatan antigen untuk aktivitas sel CAR T. Penemuan Kanker. 10, 702–723 (2020).

43. Challita-Idul Fitri, PM dkk. Antibodi monoklonal terhadap enam antigen epitel transmembran prostat-1 Menghambat Komunikasi Antar Sel In vitro dan pertumbuhan xenograft tumor manusia In vivo. Res Kanker. 67, 5798–5805 (2007).

44. Hudecek, M. dkk. Domain spacer ekstraseluler non-sinyal dari reseptor antigen chimeric sangat menentukan aktivitas antitumor in vivo. Imunol Kanker. Res. 3, 125–135 (2015).

45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ Ekspresi STEAP1 dan STEAP1B dalam garis sel prostat, dan regulasi diduga STEAP1 melalui mekanisme pasca-transkripsional dan pasca-translasi. Gen Kanker 5, 142–151 (2014).

46. ​​Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: prediksi konsensus topologi protein membran. Asam Nukleat Res. 37, W465–W468 (2009).

47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Memprediksi topologi protein transmembran dengan model Markov tersembunyi: aplikasi untuk melengkapi genom. J.Mol. biologi. 305, 567–580 (2001).

48. Panjang, AH dkk. 4-1Kostimulasi BB memperbaiki kelelahan sel T yang disebabkan oleh sinyal tonik reseptor antigen chimeric. Nat. medis. 21, 581–590 (2015).

49. Berger, C. dkk. Transfer adaptif sel T CD8+ efektor yang berasal dari sel memori pusat membentuk memori sel T persisten pada primata. J.Klin. Selidiki. 118, 294–305 (2008).

50. Gattinoni, L. dkk. Subset sel T memori manusia dengan sifat seperti sel induk. Nat. medis. 17, 1290–1297 (2011).

51. Xu, Y. dkk. Sel induk memori T yang berkerabat dekat berkorelasi dengan ekspansi CAR.CD19-sel T yang dipelihara secara in vivo oleh IL-7 dan IL-15. Darah 123, 3750–3759 (2014).

52. Cieri, N. dkk. IL-7 dan IL-15 menginstruksikan pembuatan sel T induk memori manusia dari prekursor naif. Darah 121, 573–584 (2013).

53. Hansel, DE dkk. Mutasi gen TP53 bersama pada karsinoma neuroendokrin sel kecil primer dan adenokarsinoma prostat yang berbeda secara morfologis dan fenotip. Prostat 69, 603–609 (2009).

54. Cuzick, J. dkk. Nilai prognostik dari tanda tangan ekspresi RNA yang berasal dari gen proliferasi siklus sel pada pasien dengan kanker prostat: studi retrospektif. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).

55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA Isolasi dan karakterisasi PAGE-1 dan GAGE-7. Gen baru diekspresikan dalam model perkembangan kanker prostat LNCaP yang memiliki homologi yang sama dengan antigen terkait melanoma. J.Biol. kimia. 273, 17618–17625 (1998).

56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Perkembangan ketidakpekaan androgen dalam model tikus in vitro baru untuk kanker prostat. J. Biokimia Steroid. mol. biologi. 52, 403–413 (1995).

57. Murad, JP dkk. Pra-pengkondisian memodifikasi TME untuk meningkatkan kemanjuran sel T CAR tumor padat dan kekebalan pelindung endogen. mol. Ada. Selai. sosial. Gen Ada. 29, 2335–2349 (2021).

58. Brunda, MJ dkk. Aktivitas antitumor dan antimetastatik interleukin 12 melawan tumor murine. J.Eks. medis. 178, 1223–1230 (1993).