Stx2 Menginduksi Ekspresi Gen Diferensial Dan Mengganggu Gen Irama Sirkadian di Tubulus Proksimal

Abstrak: Escherichia coli penghasil racun Shiga(STEC) menyebabkan cacat tubulus proksimal pada ginjal. Namun, faktor-faktor yang diubah oleh toksin Shiga (Stx) di dalam tubulus proksimal belum diketahui. Kami menentukan reseptor Stx Gb3 pada murine dan ginjal manusia dan mengkonfirmasi ekspresi reseptor di tubulus proksimal. Stx2-menyuntikkan jaringan ginjal tikus danStx2-mengobati sel epitel tubulus proksimal ginjal primer manusia(RPTEC) dikumpulkan dan analisis microarray dilakukan. Kami membandingkan susunan ginjal murine dan RPTEC dan memilih 58 gen umum yang diekspresikan secara berbeda vs. kontrol (0 jam, tanpa perlakuan racun). Kami menemukan bahwa gen yang paling banyak diekspresikan adalah GDF15, yang mungkin terlibat dalam penurunan berat badan yang disebabkan oleh Stx2-. Gen yang terkait dengan aktivitas Stx2 yang dilaporkan sebelumnya seperti src kinase Ya, aktivasi jalur fosforilasi, respons protein terbuka (UPR) dan respons stres ribotoksik (RSR) menunjukkan ekspresi yang berbeda. Selain itu, gen jam sirkadian diekspresikan secara berbeda, menunjukkan bahwa Stx2-menginduksi gangguan ritme sirkadian ginjal. Transporter glukosa Na+ -tubular proksimal yang diatur ritme sirkadian SGLT1 (SLC5A1) mengalami penurunan regulasi, menunjukkan penurunan fungsi tubulus proksimal, dan tikus mengalami glukosuria yang mengonfirmasi disfungsi tubulus proksimal. Stx2 mengubah ekspresi gen pada murine dan tubulus proksimal manusia melalui aktivitas yang diketahui dan gangguan ritme sirkadian yang baru diselidiki, yang dapat menyebabkan disfungsi tubulus proksimal.

Kata kunci:Toksin Shiga tipe 2 (Stx2);tubulus proksimal ginjal; mouse; sel epitel tubulus proksimal ginjal manusia (RPTEC); mikroarray; ritme sirkadian

Kontribusi Utama:Gen yang diekspresikan secara berbeda dari ginjal tikus yang diobati dengan Stx2-dan sel tubulus proksimal primer manusia dianalisis. Selain gen yang terkena dampak Stx2-yang diketahui sebelumnya, gen terkait ritme sirkadian terbukti mengubah ekspresinya dan memiliki pengaruh pada fungsi tubulus proksimal.

1. Perkenalan

Escherichia coli penghasil racun Shiga(STEC) infeksi menyebabkan gejala parah sindrom uremik hemolitik (HUS), yang didefinisikan oleh tiga serangkai gagal ginjal akut, trombositopenia, dan anemia hemolitik [1]. Racun Shiga (Stxs) diduga berperan besar dalam merusak sel pada penyakit menular ini. Histopatologi ginjal yang khas pada HUS mencakup kerusakan glomerulus dan tubulus seperti deposisi fibrin kapiler dalam glomeruli dan nekrosis tubulus [1,2]. Terjadinya disfungsi sebelumnya pada tubulus proksimal pasien yang terinfeksi STEC telah dilaporkan dengan menganalisis urin. Penanda urin fungsional tubulus proksimalN-asetil glukosaminidase(NAG) dan 2 mikroglobulin (2MG) dari urin stadium akut pasien HUS terkait STEC O157- atau O111- diukur meningkat sangat tinggi, menunjukkan disfungsi tubulus proksimal dini [3].

Stxs, termasuk Stx2, terdiri dari satu subunit A dan lima subunit B (toksin A1B5), di mana subunit A memiliki aktivitas enzimatik yang mendepurinasi adenin 4324 dari 28S rRNA dari subunit ribosom 60S, sedangkan subunit B diperlukan untuk mengikat sel inang melalui globotriaosylceramide (GB3). Ada beberapa pengaruh yang diketahui yang diberikan Stxs pada sel. (I) Dengan mengikat reseptornya Gb3, toksin menimbulkan transduksi sinyal melalui keluarga kinase Src Ya [4,5]. Setelah berikatan dengan reseptor, Stxs diinternalisasi ke sel melalui endositosis dan diangkut secara retrograde ke UGD. Stxs melewati endosom dan aparat Golgi di mana subunit A dibelah antara fragmen katalitik A1 dan C-terminal A2 oleh furin [6], meskipun fragmen A1 dan A2 masih terhubung dengan ikatan disulfida. Toksin mencapai RE dan ikatan disulfida dapat berkurang; kemudian, sebuah fragmen A1 dari holotoxin dilepaskan [7,8]. Hal ini terjadi ketika pengaruh tekanan (II) ER terjadi dengan lipatan fragmen toksin yang meniru protein, yang menginduksi respons protein terbuka (UPR). Subunit A dan B mampu mengikat Bip, yang merupakan indikasi menginduksi tekanan ER [9,10]. Fragmen A1 yang terpecah ditranslokasi ke sitoplasma dan mendepurasi adenin dari 28S rRNA ke (III) menghambat sintesis protein. Modifikasi yang disebabkan Stxs pada 28S rRNA menginduksi (IV) respons stres ribotoksik (RSR), yang mengaktifkan kaskade pensinyalan hilir [11]. Pengaruh (II) dan/atau (IV) diketahui menginduksi (V) transkripsi gen tertentu yang menyebabkan sekresi sitokin [12]. Juga, (II) dan (IV) terlibat dalam apoptosis yang diinduksi (VI) Stxs [13-15].

Eksperimen in vitro menggunakan tubulus proksimal manusia dan model tikus in vivo sangat menghubungkan kerusakan tubulus proksimal dengan Stxs. Kultur primer dan garis sel tubulus proksimal manusia sangat rentan terhadap Stxs dan menunjukkan pelepasan sitokin dan kematian sel, termasuk apoptosis [16-20]. Sel epitel tubulus proksimal ginjal primer manusia (RPTECs) mengekspresikan reseptor Gb3, sangat rentan terhadap racun Shiga, dan telah digunakan dalam banyak artikel untuk menganalisis reaksi biologis seperti penghambatan sintesis protein, produksi sitokin dan induksi apoptosis [17,20] . Tikus yang disuntik toksin Shiga tipe 1 (Stx1) menunjukkan glukosuria, yang menunjukkan penurunan reabsorpsi glukosa oleh tubulus proksimal [21]. Ini menunjukkan toksisitas Stxs pada tubulus proksimal baik in vitro dan in vivo. Pada model tikus yang terinfeksi STEC, temuan histopatologi yang sering ditemukan adalah nekrosis sel epitel tubulus dan pengelupasan sel dalam lumen tubulus proksimal [22-24]. Tikus yang disuntik dengan Stx yang dimurnikan (baik Stx1 atau Stx2) juga mengalami pengelupasan tubulus proksimal dengan inti yang relatif utuh [25-27].

Meskipun kerusakan tubulus proksimal yang berhubungan dengan injeksi Stx atau infeksi STEC telah dijelaskan secara fungsional dan histologis, target gen yang terlibat dalam lesi pada tubulus proksimal belum ditunjukkan.

Di sini kami menganalisis ekspresi gen dalam ginjal tikus yang disuntikkan Stx2-dan kultur sel epitel tubulus proksimal ginjal primer manusia (RPTEC) yang diberi perlakuan Stx2-untuk menunjukkan perubahan gen terkait tubulus proksimal yang diinduksi oleh Stx2.

2. Hasil

2.1. Stx2-Patologi Ginjal Tikus yang Disuntik

Untuk mengidentifikasi patologi ginjal murine terkait Stx{0}}, bagian jaringan ginjal dari tikus yang disuntik Stx2-diwarnai dengan Periodic Acid-Schiff (PAS). Noda merah muda yang jelas dan kuat pada sisi luminal sel epitel tubulus menunjukkan glikokaliks batas sikat, yang merupakan karakteristik sel tubulus proksimal. Kami menentukan sel/inti di luar glikokaliks (di dalam ruang luminal) sebagai terlepas dari sel tetangga dan membran basal (yaitu, sel yang terkelupas). Pada Gambar 1B (8 jam pasca Stx2), C, dan D (48 jam pasca Stx2), sel-sel yang terkelupas dengan inti yang relatif utuh ditunjukkan dengan panah. Kami juga mengamati puing-puing sel dalam lumen tubulus proksimal (Gambar 1 panah). Setelah pemberian Stx2, lesi ini tampak cukup jelas, sedangkan pada 0 jam (Gambar 1A, tanpa Stx2), lesi tersebut dapat diabaikan.

Gambar 1. Stx2 menginduksi pengelupasan sel tubulus proksimal pada ginjal murine. Pewarnaan Schiff asam periodik (PAS) pada bagian ginjal murine yang disuntikkan Stx2-ditampilkan. (A) 0 jam (naif), (B) 8 jam, dan (C) 48 jam setelah injeksi Stx2. Panah menunjukkan pengelupasan sel tubulus proksimal. Panah menunjukkan puing-puing sel. Bidang yang diperbesar di dalam (C) ditunjukkan pada (D) dengan sel-sel pengelupasan yang ditunjukkan dengan panah. Batangan di (A–C) menunjukkan 50 µm. Bilah skala di (D) menunjukkan 10 µ

2.2. Ekspresi Gb3 pada Tikus dan Ginjal Manusia

2.2.1. Ekspresi Korteks Ginjal Tikus Gb3

Karena sel tubulus proksimal menunjukkan kerusakan histologis akibat penghinaan Stx2, kami menguji ekspresi reseptor Stx2 globotriaosylceramide (Gb3) di korteks ginjal murine bersama dengan penanda tubular proksimal aquaporin-1 (AQP1). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, sel positif AQP1- menunjukkan positif Gb3 sebagian besar di sisi luminal sel (sel ditandai dengan panah tertutup, sedangkan lumina ditandai dengan tanda bintang). Kami juga mengamati bahwa pewarnaan Gb3 tubular negatif AQP1 mungkin mengumpulkan sel-sel saluran (Gambar 2 panah terbuka) seperti yang dilaporkan [28]. Intensitas pewarnaan Gb3 lebih kuat pada sel AQP1 (-), namun jumlah tubulus jenis ini lebih kecil dibandingkan dengan tubulus proksimal ganda positif Gb3/AQP1 di korteks. Sel endotel CD31-positif adalah Gb3 negatif pada ginjal tikus. Kontrol antibodi yang cocok dengan isotipe untuk Gb3 (IgM tikus) digunakan sebagai kontrol negatif. IgM tikus tidak bereaksi dengan jaringan ginjal tikus (Gambar S1)

2.2.2. Ekspresi Korteks Ginjal Manusia Gb3

Pada jaringan ginjal manusia, Gb3 juga positif pada tubulus proksimal AQP1-positif (Gambar 3, panah tertutup). Lokalisasi Gb3 dalam sel tubulus proksimal lebih kuat pada sisi luminal. Kami juga mengamati sel AQP1(-)Gb3(+) (Gambar 3, panah terbuka) seperti yang kami lakukan pada jaringan murine. Sel endotel manusia mengekspresikan Gb3 (CD31/Gb3 positif ganda, Gambar 3, tanda bintang). Bagian kontrol isotipe dengan IgM tikus tidak menunjukkan reaksi positif pada jaringan ginjal manusia (Gambar S2).

2.3. Analisis Microarray

Karena sel epitel tubulus proksimal tikus dan manusia positif Gb3, hal ini menunjukkan bahwa jenis sel ini dipengaruhi langsung oleh Stx2. Untuk menentukan gen yang terpengaruh Stx2-di murine dan sel tubulus proksimal manusia, kami mengekstraksi RNA total dari ginjal tikus yang disuntik Stx2-dan Stx2-yang merawat RPTEC primer manusia dan menganalisisnya ekspresi gen dengan microarray

2.3.1. Gen yang Diekspresikan Secara Berbeda pada Ginjal Tikus dan RPTEC

Gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG), yang umum pada ginjal tikus dan RPTEC dipilih. Dasar pemilihan DEG yang umum adalah (1) gen dengan perubahan log2-fold (terhadap 0 h) lebih dari 1 atau kurang dari −1 pada ginjal tikus dan microarray RPTEC setidaknya dalam satu- titik waktu dan (2) distribusi perubahan log2-fold suatu gen menyesuaikan dengan kurva kubik, bukan kurva kuadrat, agar lebih mengakomodasi puncak ekspresi gen di tengah perjalanan waktu dalam microarray ginjal. Dengan dua kriteria di atas, kami memilih 58 gen umum antara ginjal tikus yang diobati dengan Stx2-dan RPTEC manusia (Gambar 4A). Pola ekspresi 58 gen pada ginjal tikus ditunjukkan dalam peta panas (Gambar 4B). Sebagian besar gen diregulasi beberapa jam setelah injeksi Stx2; namun, beberapa gen memiliki pola ekspresi lebih awal. Gen yang memiliki lebih dari 1 perubahan log{15}}fold dicantumkan untuk setiap titik waktu (Tabel 1).

Gambar 4. Analisis microarray. (A) Di antara gen yang dianalisis dengan microarray, 147 gen (yang dilingkari hijau), dan 4013 gen (yang dilingkari merah) masing-masing dari ginjal tikus yang diberi perlakuan Stx2-dan RPTEC, terdeteksi memiliki log{ {4}}perubahan lipatan kurang dari −1 atau lebih dari 1. Gen yang diubah dengan perlakuan Stx2 terhadap 0 h di kedua mikroarray (gen/DEG yang diekspresikan secara berbeda) berjumlah 58 (area tumpang tindih merah dan hijau). (B) Peta panas dari 58 gen umum ditampilkan pada garis waktu pengambilan sampel ginjal tikus. Z sama dengan 0 menunjukkan rata-rata nilai perubahan log2-kali lipat suatu gen dan mencerminkan tren ekspresi gen. Jadi, warna kehijauan mewakili nilai yang lebih rendah dibandingkan rata-rata gen tertentu dalam satu baris, sedangkan warna kemerahan mewakili perubahan di atas rata-rata. Data lipat log2-dari 58 gen dari kumpulan data 72 jam yang disuntikkan PBS dibandingkan dengan 0 jam disajikan sebagai Tabel S3 untuk referensi. (C) Grafik batang pengayaan Metascape GO ditampilkan. Sumbu X menunjukkan nilai −log10 p dari istilah GO yang diperkaya di 58 DEG umum sehingga jumlah yang lebih tinggi dari istilah GO yang diperkaya kemungkinan besar relevan dengan sistem. 20 istilah GO teratas yang diperkaya ditampilkan. (D) Analisis STRING dari 58 DEG umum ditampilkan dalam enam cluster yang paling terhubung/terkait. Warna bulat menunjukkan gen yang termasuk dalam kelompok yang sama. Hubungan tindakan antar gen ditunjukkan dengan kode warna dan bentuk akhir. ENSG00000279576 kini diberi kode ENSP00000485396, yang menunjukkan ID manusia dari gen MALAT1.

Untuk menganalisis fungsionalitas DEG umum, kami menggunakan platform Metascape. Ini menetapkan istilah Gene Ontology (GO), yang terdiri dari fungsi molekuler, komponen seluler, dan proses biologis, pada gen yang dipilih. Kami menyimpan 58 DEG umum ke Metascape dan memperoleh 20 istilah GO teratas yang termasuk dalam DEG tersebut (Gambar 4C). Istilah GO dicantumkan dengan gen yang sesuai pada Tabel S1. Untuk melihat daftar gen dalam setiap istilah GO yang ditunjukkan pada Gambar 4C, silakan lihat pengayaan Metascape Tabel S2. Istilah GO yang terkait dengan kematian sel, peradangan, dan kaskade sinyal berada di peringkat 20 teratas seperti yang diharapkan; namun, ritme sirkadian menarik perhatian sebagai istilah GO yang baru. Koneksi yang diketahui dari gen-gen umum ditunjukkan dengan analisis STRING (Gambar 4D). Dalam analisis ini, gen dikelompokkan ke dalam enam kelompok berbeda yang memiliki hubungan yang kuat antara pengikatan, pengaruh (katalisis, aktivasi atau penghambatan), serta koekspresi gen.

2.3.2. Tren Ekspresi Gen

Jejak beberapa ekspresi gen ditunjukkan dalam grafik dengan sumbu x untuk waktu (h) setelah injeksi Stx2 dan sumbu y untuk perubahan log2-fold terhadap 0 h (Gambar 5). Jadi, nilai sumbu y sama dengan 1 berarti perubahan 2-lipat vs. ekspresi 0 h.

Gambar 5. Gen yang diekspresikan secara berbeda dengan garis waktu pengambilan sampel tikus. (A) Pola ekspresi mRNA PDK4 dan CEBPB ditampilkan. (B) gen segera-awal. (C) Ekspresi protein matrikel CYR61 (CCN1) dan CTGF (CCN2). (D) Gen terkait UPR DDIT3 (CHOP, GADD153), mitra pengikat DDIT3 CEBPB, dan faktor umpan balik negatif PPP1R15A (GADD34) ditampilkan. (E) Faktor transkripsi DDIT3 (CHOP, GADD153) dan ATF3 dan GDF15, yang diatur secara transkripsi oleh faktor-faktor ini, ditampilkan. (F) Gen terkait UPR dan RSR ditampilkan. (G) EDN1 sehubungan dengan gen UPR diplot. (H) Puncak awal EDN1 dan EGR1 dan puncak PER1 berikutnya ditunjukkan dengan peningkatan bertahap pada ketiga gen tersebut. (I) Gen dari cluster ungu Gambar 4D adalah gen yang berhubungan dengan ritme sirkadian. (J) Gen inti sirkadian PER1, Arntl (BMAL1), Cry1, dan Jam ditampilkan. (K) PER1 dan gen ginjal yang diatur jam sirkadian ditampilkan. (Kiri) Gen inflamasi dengan gen terkait jalur NF-kB ditampilkan. Untuk melihat titik data log2 individual, lihat Gambar Tambahan S4. Gambar S5, menunjukkan rata-rata log2 dengan batang deviasi standar, disajikan sebagai referensi.

Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko

DAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK ALAMI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK INFEKSI GINJAL