Studi tentang efek acteoside (bahan aktif di Cistanche deserticola) pada NAFLD dengan menginduksi autophagy

Abstrak:

 

Tujuan:Untuk mengeksplorasi fungsi penginduksi autophagy dari akteosida bahan aktif (ACT) di Cistanche deserticola dan pengaruhnya terhadap penyakit hati berlemak non-alkohol (NAFLD).

MetodeUntuk mengambil echinacoside dan bertindak sebagai objek penelitian, 1 0 0 μmol/l ACT dan echinacoside (ECH) dikombinasikan dengan inhibitor autophagy-lysosome bleomycin A1 untuk pengobatan intervensi. Immunoblotting protein digunakan untuk mendeteksi tingkat ekspresi relatif dari mikrotubulus penanda autophagy, mikrotubulus protein 1 rantai cahaya 3 (LC 3- II). Sel -sel HepG2 diintervensi dengan konsentrasi ACT secara in vitro yang berbeda, dan viabilitas sel terdeteksi menggunakan metode garam tetrazolium. Intervensi vitro sel HepG2 dengan konsentrasi ACT yang berbeda dikombinasikan dengan Balofloxacin A1, dan deteksi LC {3- II kadar ekspresi protein protein. Model NAFLD yang dibangun secara in vitro dengan intervensi obat digunakan untuk menodai tetesan lipid menggunakan metode pewarnaan o minyak O dan mendeteksi kadar trigliserida intraseluler. Amati lokalisasi protein LC3 dan tetesan lipid melalui teknologi imunofluoresensi. Hasil Undang -Undang dapat secara signifikan menginduksi autophagy dalam sel HepG2, dan tingkat ekspresi LC 3- II protein secara signifikan meningkat dibandingkan dengan kelompok kontrol (diperlakukan dengan ACT saja) (1.36 ± 0. 11, {21}}. masing -masing), dengan signifikansi statistik (P0.05). 50 μmol/L bertindak secara signifikan menginduksi autophagy dalam sel HepG2, dan tingkat ekspresi protein LC 3- II meningkat secara signifikan (masing -masing 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). Tingkat TG sel HepG2 pada kelompok intervensi ACT (19,11 ± 1,68) secara signifikan lebih rendah daripada pada kelompok model sel in vitro NAFLD (34,15 ± 1,90), dan perbedaannya signifikan secara statistik (p<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Kata kunci:Penyakit hati berlemak nonalkohol;Cistanche Deserticola;Acteoside; Autophagy

 

TCM Herb Cistanche untuk pengobatan penyakit hati berlemak non-alkohol (NAFLD)

Klik pic untuk mendapatkan detail lebih lanjut

 

Dalam beberapa dekade terakhir, lemak non-alkoholpenyakit hati(NAFLD) telah menjadi yang paling umumpenyakit hati kronis, dengan prevalensi global sekitar 25% dari populasi orang dewasa, dan dianggap terkait erat dengan sindrom metabolik [1]. Meskipun probabilitas komplikasi terkait hati pada pasien NAFLD kurang dari 10%, NAFLD adalah faktor risiko untuk penyakit terkait hati seperti sirosis dan kanker hati primer, yang memaksakan beban ekonomi yang sangat besar pada pasien [2-5]. Terlepas dari semakin banyak perhatian yang diberikan kepada NAFLD, NAFLD sebagai penyakit kronis penting belum mendapat perhatian yang cukup. Oleh karena itu, pemahaman mendalam lebih lanjut tentang patogenesis NAFLD dan pencarian strategi pengobatan yang efektif telah menjadi masalah mendesak untuk diselesaikan [6-7].

Studi terbaru menunjukkan bahwa autophagy seluler memainkan peran penting dalam fisiologi dan patologi hati [8]. Disfungsi atau disregulasi autophagy dikaitkan dengan berbagai penyakit hati sepertiPenyakit hati terkait alkohol[9], NAFLD [10], steatohepatitis non-alkohol [11], dan karsinoma hepatoseluler [12]. Karakteristik patologis NAFLD adalah deposisi berlebihan trigliserida (TG) dan tetesan lipid netral lainnya (LD) dalam hepatosit di bawah stimulasi non-alkohol. Untuk hati, dua jalur utama yang mengatur katabolisme LDS ini adalah lipolisis dan autophagy.
Jalur lipolisis diatur oleh lipase netral sitoplasma, seperti lipase hormon-sensitif dan adiposa TG lipase. Dalam jalur lipoautophagy yang sesuai, LDS dapat secara selektif diambil dengan secara langsung merekrut protein terkait autophagy untuk membentuk autofagosom, dan kemudian LDS yang dienkapsulasi oleh autofagosom selanjutnya dikirim ke lisosom dan didekomposisi oleh asam lipase dalam lisosom. Oleh karena itu, mengaktifkan lipoautophagy dalam hepatosit telah menjadi strategi yang efektif untuk pencegahan dan pengobatan NAFLD.
Cistanche Deserticola adalah obat herbal Tiongkok yang berharga yang telah banyak digunakan dalam praktik klinis dalam formula obat tradisional Tiongkok. Pada saat yang sama, ini telah lama digunakan sebagai suplemen makanan kesehatan. Cistanche deserticola mengandung berbagai bahan bioaktif, yang paling penting adalah Cistanche deserticola phenylethanol glikosida. Sebagai perwakilan glikosida fenylethanoid, echinacoside (ECH) dan verbascoside (ACT) telah dilaporkan memiliki banyak aktivitas biologis penting, seperti antioksidan, neuroprotektif, imunomodulator, dan perlindungan hati [13]. Dalam hal perlindungan hati, penelitian telah menemukan bahwa ECH dapat melindungi hati dengan mengurangi mediator inflamasi, menghambat transformasi faktor pertumbuhan-, dan mengurangi tingkat ekspresi gen yang berhubungan dengan fibrosis hati. ACT memiliki efek perlindungan yang signifikan pada kerusakan hati yang diinduksi kimia dan obat, seperti alkohol, karbon tetrachloride, dan lipopolysaccharide. ACT mengurangi stres oksidatif yang disebabkan oleh bahan kimia beracun, menghilangkan oksigen reaktif yang terakumulasi di hati, dan mengurangi konsentrasi malondialdehida. Pada saat yang sama, secara signifikan meningkatkan aktivitas superoksida hati dan mengurangi kandungan glutathione, dan secara signifikan meningkatkan kerusakan histopatologis hati dan apoptosis. Namun, tidak ada laporan literatur yang relevan tentang apakah glikosida fenylethanoid dari cistanche deserticola terlibat dalam proses autophagy dalam mengerahkan perlindungan hati. Berdasarkan hal ini, penelitian ini menggunakan metode biologi sel konvensional dan model sel in vitro untuk mengeksplorasi efek penginduksi autophagy dari cistanche deserticola fenylethanoid glikosida dan mengeksplorasi kemungkinan fungsi farmakologisnya, yang bertujuan untuk memberikan dasar ilmiah untuk pengembangan obat di masa depan.

 

1 Bahan dan Metode

1.1 Bahan

1.1.1 Subjek Penelitian ECH dan ACT digunakan sebagai subjek penelitian.

1.1.2 Bahan Sel HEPG2 dibeli dari Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (nomor batch: B21209) dan ACT (Batch Number: B20715, HPLC Purity lebih besar dari atau sama dengan 98%) dari Shanghai Yuanye Biological Company, DMeM Bit High Gluc High Gluc High Gluc High Gluc High High High High High High High High High DMEM. dibeli dari Hyclone Company, USA, serum sapi janin (nomor batch: 04-002-1 a) dibeli dari perusahaan BI, Israel, penisilin/streptomisin (nomor batch: SV30010.01) dibeli dari perusahaan Hyclone, SM, MTT (nomor batch: M8180) dibeli dari Serbuk Hyclone, MTT (nomor batch: M8180) dibeli dari Sed Nomor: BC0625) Kit Deteksi dibeli dari Solebao Company, Beijing, Cina, Oil Red O (nomor lot: o 0625-100 g), dimetil sulfoksida (nomor lot: BCBZ1685) dibeli dari Sigma-Aldrich, AS; Autophagy-lysosome inhibitor bafilomycin A1 (BAFA1, nomor lot: TLRL-BAF1) dibeli dari Invitrogen, USA; Rapamycin aktivator autophagy (nomor lot: S17098) dibeli dari Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Cina; Protein terkait mikrotubulus 1 rantai cahaya 3 (LC3, nomor lot: l7543, spesies: kelinci, rasio pengenceran: 1: 1 000) dan -actin (jumlah lot: zrb1312, spesies: kelinci, rasio pengenceran: 1: {{{{{{{{5 000 yang dilusi; horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (lot number: 4010-05, species: goat anti-rabbit, dilution ratio: 1:1 000) was purchased from Southern Biotech, USA Company, Alexa Fluor fluorescent labeled secondary antibody (lot number: 43328, wavelength: 546, dilution ratio: 1:1000) was purchased Dari Sigma-Aldrich Company, AS, dan Bodipy 493/501 (nomor lot: D3922) dibeli dari Invitrogen Company, AS.

 

1.2 Metode

1.2.1 Kultur sel

Sel -sel HepG2 dikultur dalam media glukosa tinggi yang dimodifikasi Dulbecco yang mengandung 10% serum sapi janin, penisilin 100 U/mL dan 100 ug/ml streptomisin dalam inkubator karbon dioksida 37 derajat dalam 37 derajat. Ketika pertemuan sel mencapai 85%, subkultur, pelapisan, intervensi dan operasi lainnya dilakukan.

 

1.2.2 Deteksi Immunoblotting Protein

1.2.2.1 Perawatan Act dan ECH

LC 3- ⅱ Level ekspresi protein dalam sel HepG2 BAFA1, sebagai penghambat pompa proton, dapat menyebabkan lc 3- ⅱ protein untuk agregat dalam jumlah besar dalam sel, sehingga memperkuat kemampuan induksi autophagy. Oleh karena itu, penggunaan gabungan BAFA1 dapat digunakan sebagai sistem pemantauan autophagy untuk mengevaluasi kemampuan induksi autophagy. Sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik ditransfer ke piring kultur sel 3,5 cm untuk kultur semalam. 100 μmol/L ACT, ECH dan BAFA1 digunakan untuk intervensi selama 12 jam. Sel-sel dicuci dengan larutan buffer fosfat pra-pendingin (PBS) dan segera dilisiskan dalam buffer lisis protein RIPA selama 10 menit. Supernatan disentrifugasi dan konsentrasi protein total ditentukan menggunakan kit uji konsentrasi protein asam bicinchoninic. Setelah kuantifikasi dengan buffer natrium dodecyl sulfate, sampel dipanaskan pada 95 derajat selama 10 menit untuk mendenaturasi protein. Kemudian 30 μl sampel diambil dengan mikropipet dan elektroforesed pada gel poliakrilamida.
Setelah elektroforesis, protein ditransfer dari gel ke susu nitroselulosa, diblokir dengan 1 0% susu semalam, diinkubasi dengan antibodi primer spesifik pada suhu kamar selama 1 jam, dicuci dengan buffer fosfat yang mengandung 0,5% triton, dan diinkubasi dengan antibodi spesifik pada suhu kedua pada suhu kedua. Metode ECL digunakan untuk pengembangan warna. Mereka ditetapkan sebagai kelompok kontrol kosong, grup rapamycin, grup ECH, kelompok ACT, rapamycin+grup BAFA1, grup ECH+BAFA1 dan kelompok ACT+BAFA1.

 

1.2.2.2 Konsentrasi ACT yang berbeda mengintervensi tingkat ekspresi LC 3- ⅱ protein dalam sel Hepg2

Sel -sel HEPG2 fase pertumbuhan logaritmik ditransfer ke piring kultur sel 3,5 cm untuk kultur semalam, dan 25, 50, dan 100 μmol/L ACT yang dikombinasikan dengan BAFA1 digunakan untuk pengobatan intervensi selama 12 jam, dan tingkat ekspresi LC 3- ⅱ protein dideteksi oleh protein yang imunlotting. Kelompok kontrol (kelompok CON, kontrol kosong), kelompok kelaparan (kelompok STA, sel HEPG2 pengobatan kelaparan), 25, 50, dan 100 μmol/l ACT group, dan BAFA1 dikombinasikan dengan kelompok ACT 25, 50, dan 100 μmol/L diatur.

1.2.3 Metode MTT untuk mendeteksi tingkat kelangsungan hidup sel HepG2 yang diobati dengan konsentrasi ACT yang berbeda selama 24 dan 48 jam
Sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik diinokulasi dalam pelat sumur 96- dengan kepadatan inokulasi sedang dan dikultur dalam inkubator selama 12 jam. 2 0, 40, 60, 80, dan 100 μmol/l ACT ditambahkan selama 24 dan 48 jam. Solusi 0,5 mg/mL MTT ditambahkan dalam lingkungan yang gelap dan diinkubasi dalam inkubator. Setelah 4 jam, supernatan dibuang, 100 μl dimetil sulfoksida ditambahkan ke masing -masing sumur, dan sel -sel dikocok dalam pengocok suhu konstan pada 37 derajat selama 10 menit. Nilai kepadatan optik (OD) pada panjang gelombang 490 nm terdeteksi oleh penanda enzim, dan laju kelangsungan hidup sel dihitung.

 

1.2.4 Konstruksi in vitro model sel NAFLD

Bobot asam palmitat (PA) ditimbang dan sepenuhnya dilarutkan dalam volume isopropanol tertentu untuk menyiapkan larutan stok 100 mmol/L PA, yang kemudian dibagi dan disimpan dalam kulkas -20 derajat untuk digunakan nanti. Larutan stok PA diencerkan hingga 100 μmol/L menggunakan media kultur lengkap, dan 1% albumin serum bovine bebas asam lemak ditambahkan. Sel -sel diinkubasi pada 37 derajat selama 3 jam untuk menyiapkan solusi induksi. Sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik ditransfer ke piringan kultur sel 3,5 cm pada kepadatan yang sesuai untuk kultur semalam, dan kemudian solusi induksi yang disiapkan digunakan untuk intervensi.

 

1.2.5 ACT Intervensi NAFLD Model Sel In Vitro Deteksi TG dan Pewarnaan Oil Red O

 

1.2.5.1 Deteksi TG

Sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik ditransfer ke piringan kultur sel 3,5 cm untuk kultur sesuai dengan kelompok kontrol kosong, kelompok model dan kelompok intervensi ACT. Kelompok model diinduksi dengan larutan induksi 100 μmol/L PA, dan kelompok intervensi ACT diinduksi dengan 100 μmol/L larutan induksi PA dan 50 μmol/L ACT ditambahkan pada saat yang sama. Waktu intervensi adalah 24 jam. Lepaskan media kultur lama dengan lembut, perlahan-lahan cuci permukaan sel dengan PBS yang didinginkan sebelumnya, tambahkan 100 μl/piring larutan lisis ripa yang telah didinginkan sebelumnya, sepenuhnya pada es selama 15 menit, centrifuge pada 4 derajat dan 12 000 r/menit selama 10 menit, pengambilan supernatan, ambil 10 μl untuk tgetasi tg deteksi 10 menit, mengambil supernatan, mengambil 10 μl untuk enzimatik deteksi tg-tg. Instruksi Kit TG, dan akhirnya memperbaiki tingkat TG per mg protein.

1.2.5.2 Pewarnaan Oil Red O

Sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik ditransfer ke piring kultur 3,5 cm yang ditutupi dengan penutup steril untuk kultur semalam. 100 μmol/L PA menginduksi sel untuk membentuk tetesan lipid. Pada saat yang sama, 50 μmol/L ACT ditambahkan untuk intervensi selama 24 jam.
Slide sel dikumpulkan, dicuci 3 kali dengan PBS yang dikelilingi sebelumnya, difiksasi dengan formaldehida 4% pada suhu kamar selama 10 menit, mencuci permukaan sel dengan PBS, menambahkan larutan kerja pewarnaan O minyak yang disiapkan, diwarnai pada suhu kamar dalam gelap, dan disedot dengan suhu dua kali lipat dengan suhu dua kali lipat dengan suhu dua kali lipat dengan pewarnaan dongeng, dengan suhu ganda, menyuling. disegel, dan difoto di bawah mikroskop.

 

1.2.6 Pengamatan imunofluoresensi autophagosom dan tetesan lipid setelah pengobatan ACT

Sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik ditransfer ke piring kultur 3,5 cm yang ditutupi dengan penutup steril untuk kultur semalam. 1 0 0 μmol/L PA digunakan untuk menginduksi pembentukan tetesan lipid dalam sel. Pada saat yang sama, ACT ditambahkan untuk pengobatan intervensi selama 24 jam. Slide sel dikumpulkan, dicuci 3 kali dengan PBS yang dikelilingi sebelumnya, difiksasi pada suhu kamar selama 10 menit dengan formaldehida 4%, permeabilisasi pada suhu kamar selama 15 menit dengan buffer permeabilisasi yang mengandung 0,1% saponin, diblokir pada suhu kamar selama 1 jam dengan kambing, diinkubasi pada suhu kamar untuk 1 H dengan LC {{{{{{{{{{{{{2 H dengan LC {{{2 H dengan LC {14 H dengan LC {{14 H dengan LC {{14 H dengan LC { Antibodi sekunder berlabel fluoresen, diinkubasi pada suhu kamar dan jauh dari cahaya selama 1 jam. Setelah inkubasi antibodi, slide dicuci 3 kali dengan PBS, counterstain dengan probe bodypy spesifik tetesan lipid 493/503 pada suhu kamar selama 10 menit, dicuci dengan PBS, dan disegel dengan media penyegelan anti-fading, dikeringkan dengan udara dalam gelap, diamati dengan mikroskop laser confocal, dan direkam. Kelompok kontrol kosong, kelompok perlakuan rapamycin dan kelompok intervensi ACT ditetapkan.

 

1.3 Analisis Statistik

SPSS25. 0 Perangkat lunak statistik digunakan untuk analisis data. Data kuantitatif dinyatakan sebagai x ± S. Analisis varians satu arah dan uji LSD-T digunakan. P<0.05 was considered statistically significant.