Studi tentang efek acteoside (bahan aktif di Cistanche deserticola) pada NAFLD dengan menginduksi autophagy

2 Hasil

2.1 Perbandingan LC 3- ⅱ Tingkat ekspresi protein dalam sel HepG2 yang diobati denganBertindak dan ech ekspresi relatif lc 3- ⅱ proteinDalam sel Hepg2 yang diperlakukan dengan BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) secara signifikan lebih tinggi dari pada kelompok kontrol kosong (0. The relative expression of LC{{1{{20}}}}Ⅱ protein in HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group (1.24±{{30}}.06) was higher than that in the rapamycin group (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Ekspresi protein Lc 3- ⅱ dalam sel HepG2 pada kelompok ECH+BAFA1 dan kelompok ACT+BAFA1 [0,43 ± 0,02 dan 1,36 ± 0,11, masing -masing secara signifikan lebih tinggi dari pada kelompok ECH dan kelompok ACT [(0,18 ± 0,01 dan 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28,<0.05).

TCM Herb Cistanche untuk Perlindungan Hati

2.2 Perbandingan LC 3- ⅱ Tingkat ekspresi protein dalam sel HepG2 yang diobati dengan konsentrasi ACT yang berbeda

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Level ekspresi protein sel HepG2 dalam BAFA1 dikombinasikan dengan 25, 5 {{18}, dan 1 {0 0 {29 {29 ± {27 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {29 {27 {29 {29 {29 {29 {29 {27 {29 {27 {29 {29 { 1,83 ± 0. 53, dan 0. 97 ± 0,25, masing -masing) secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok ACT 25, 50, dan 100 μmol/L (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18, dan 0,30 ± 0,15, dengan masing -masing), dengan masing -masing), dengan masing -masing), dengan masing -masing), dengan masing -masing), dengan masing -masing), dengan masing -masing), dan 0,15, dengan peringkat 0,15, dan 0,3,30 ± 0,15, dengan peringkat 0,15, dengan masing -masing), dan 0,30 ± 0,15, dan 0,30 ± 0,15, dan 0,30 ± 0,15, dan 0,30, dan 0,30, dan 0,30 ± 0,3.<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Catatan: A. immunoblotting protein; B. Hasil analisis semi-kuantitatif; Dibandingkan dengan kelompok ACT tanpa BAFA1, AP<0.05.
Gambar 1 Perbandingan LC 3- ⅱ Tingkat ekspresi protein dalam sel HepG2 yang diobati dengan konsentrasi ACT yang berbeda

2.3 Perbandingan viabilitas sel HepG2 yang diobati dengan konsentrasi ACT yang berbeda selama 24 dan 48 jam

Nilai OD sel HepG2 setelah intervensi dengan 0, 2 0, 4 {{1 {0}, 6 0, 8 {{16}, dan 1 {{18} {{22 {{16}, dan 1 {{18} {{{22 {{16} {{{{18 {{{18 {{{{18 {{{18 {{{{18 {{{18 {{18 {{{18 {{{18 {{{18 {{18 {{18 {{18 {{18 {{{18 {{18 {{18 {{18 {{{18 {{18 {{18 {{18 {{18 {{18 { 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}. 0. 94 ± 0. 15, dan 0. 94 ± 0. 20, masing -masing; dan nilai OD sel HepG2 setelah intervensi selama 48 jam adalah 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13, dan 0,09 ± 0,22, masing -masing. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam nilai OD sel HepG2 setelah 24 dan 48 jam intervensi dengan konsentrasi ACT yang berbeda (f =0. 213, 0.213, p =0. 96, 0.36). Lihat Gambar 2.

CATATAN: A. Sel HepG2 diobati dengan konsentrasi ACT yang berbeda selama 24 jam; B. Sel HepG2 diobati dengan konsentrasi ACT yang berbeda selama 48 jam.

Gambar 2 Nilai OD pada 570 nm setelah 24 dan 48 jam pengobatan dengan konsentrasi ACT yang berbeda

2.4 Perbandingan kadar TG dan pewarnaan minyak merah dalam model sel in vitro NAFLD setelah intervensi ACT

Tingkat TG sel HepG2 pada kelompok model (34,15 ± 1,90) secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok kontrol kosong (14,17 ± 2,74) dan kelompok intervensi ACT (19,11 ± 1,68), dan perbedaannya secara statistik (p<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

CATATAN: A. Level TG; B. Pewarnaan Oil Red O (20 ×); dibandingkan dengan grup model, AP<0.05.
Gambar 3 Perbandingan kadar TG dan pewarnaan minyak merah dalam model sel in vitro NAFLD setelah pengobatan ACT

2.5 Perbandingan autophagosom dan tetesan lipid setelah pengobatan ACT dibandingkan dengan kelompok kontrol kosong, tetesan lipid sel HepG2 pada kelompok perlakuan rapamycin dan kelompok intervensi ACT meningkat secara signifikan, dan autophagosom LC3 dari sel HepG2 pada kelompok intervensi ACT meningkat secara signifikan, dan co-localized. Lihat Gambar 4.

3 Diskusi

NAFLD adalah penyakit hati kronis yang paling umum di dunia, menyumbang sekitar 1/4 dari total populasi dunia, dan telah menjadi masalah kesehatan masyarakat global. Overnutrition adalah faktor utama yang mendorong NAFLD. Asupan nutrisi yang berlebihan oleh sel -sel hati menyebabkan deposisi lemak yang berlebihan dalam sel, yang menyebabkan reaksi lipotoksik seperti stres sel (stres oksidatif dan stres retikulum endoplasma), aktivasi inflammasom, dan apoptosis sel, dan selanjutnya menyebabkan serangkaian runcing liver, seperti radang -lereng fenotyposis, seperti serangkaian radang -livate, seperti radang -livering, seperti radang -livate, seperti serangkaian radang -lereng fenotye, seperti serangkaian radang liver, seperti serangkaian radang -liver. [14-15]. Dalam beberapa tahun terakhir, penelitian telah menunjukkan bahwa autophagy memainkan peran penting dalam mencegah pengembangan NAFLD manusia. Hasil deteksi indeks terkait autophagy pada hati pasien dengan NAFLD dan penyakit hati berlemak non-alkohol dan hati tikus diet gemuk dan lemak tinggi menunjukkan bahwa proses autophagy dalam hepatosit diblokir, yang menyebabkan akumulasi besar-besaran TG intraseluler dan tetesan lipid lainnya [16]. Studi lain telah menunjukkan bahwa setelah gen kunci 7 autophagy hepatosit secara khusus tersingkir pada tikus yang diberi diet tinggi lemak, tingkat TG pada hepatosit tikus meningkat secara signifikan [17]. Namun, setelah overekspresi gen ATG7 atau intervensi dengan penginduksi autophagy seperti rapamycin dan carbamazepine, degenerasi lemak di hati tikus berkurang secara signifikan [{{11}].
Ini menunjukkan bahwa degenerasi lemak hati dapat dikurangi secara signifikan dengan meningkatkan aktivitas autophagy hati, memberikan strategi yang efektif untuk pengobatan NAFLD. Produk alami, sebagai sumber utama pengembangan obat baru, banyak digunakan dalam pencegahan dan pengobatan berbagai penyakit hati. Sebagai produk yang sangat baik yang biasa digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok, Cistanche deserticola telah menarik perhatian luas untuk efek farmakologisnya seperti perlindungan saraf, imunomodulasi, antioksidan, antikanker, dan perlindungan hati. Sejauh ini, lebih dari 120 senyawa telah diisolasi dari Cistanche deserticola, termasuk glikosida fenylethanoid, terpenoid dan glikosida mereka, lignan dan glikosida, oligosakarida, poliol, dan polisakarida [21]. Di antara mereka, glikosida fenylethanoid adalah kelas senyawa yang paling banyak dipelajari dalam bahan aktif Cistanche deserticola. ECH dan ACT adalah senyawa representatif dari glikosida cistanche deserticola fenylethanoid, yang memiliki efek positif pada antioksidan, melindungi hati, miokardium, sel saraf dan meningkatkan memori [22-23]. Namun, tidak ada laporan literatur yang relevan tentang apakah glikosida Cistanche deserticola fenylethanoid terlibat dalam proses autophagy dalam melindungi hati.

Autophagy adalah proses degradasi diri yang ada di mana-mana di dalam tubuh. Ini adalah proses katabolik di mana autofagosom menurunkan limbah metabolisme seluler. Proses autophagy umumnya mencakup tiga proses: inisiasi autophagy, ekstensi membran autophagic dan pembentukan lisosom autofagik, yang terutama diatur oleh protein target rapamycin dan jalur pensinyalan fosfatidylinositol -3 kinase. Autophagosom adalah penanda autophagy seluler. Dalam proses pembentukan autophagosome, serangkaian protein terkait autophagy termasuk ATG5 ~ 12 dan LC3 memainkan peran penting. Oleh karena itu, penelitian ini membangun sistem evaluasi autophagy, mendeteksi tingkat ekspresi protein penanda autophagy LC3 pada tingkat molekuler, dan mengevaluasi kemampuan induksi autophagy dari dua glikosida fenylethanoid dari cistanche deserticola dalam sel HepG2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa setelah penambahan pengobatan BAFA1 berdasarkan intervensi rapamycin inducer autophagy, lc intraseluler 3- ⅱ dari sel HepG2 meningkat secara signifikan, menunjukkan bahwa sistem evaluasi autofag dapat secara akurat mengevaluasi aktivitas induksi autofag dari obat; Setelah ECH dan ACT diobati dengan BAFA1, ekspresi protein Lc 3- ⅱ dalam sel HepG2 pada kelompok ECH+BAFA1 dan kelompok ACT+BAFA1 secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok ECH dan kelompok ACT, dan perbedaannya secara statistik (P signifikan secara statistik (P secara statistik (P. signifikan secara statistik (P secara statistik signifikan secara statistik (P secara statistik (P. signifikan secara statistik secara statistik (P. signifikan secara statistik secara statistik secara statistik secara statistik secara statistik secara statistik<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and mengerahkan perlindungan hatidan fungsi biologis lainnya. Kedua, keamanan adalah pertimbangan utama dalam pengembangan obat. Untuk mengevaluasi keamanan ACT, penelitian ini lebih lanjut menguji efek ACT pada viabilitas sel HepG2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa viabilitas sel HepG2 hampir tidak terpengaruh oleh intervensi dengan konsentrasi ACT yang berbeda, menunjukkan bahwa ACT dapat digunakan sebagai kandidat obat untuk mempelajari lebih lanjut efek farmakologis dan mekanisme molekulernya.

Autophagy adalah proses biologis yang sangat terkonservasi dalam sel, dan sedikit perubahan dalam konsentrasi obat akan mempengaruhi tingkat autofagosom seluler. Untuk lebih menentukan konsentrasi optimal ACT untuk menginduksi pembentukan autofagosom dalam sel HepG2, penelitian ini menggunakan konsentrasi ACT yang berbeda yang dikombinasikan dengan BAFA1 untuk mengobati sel HepG2 dan mendeteksi tingkat ekspresi LC 3- ⅱ protein dalam sel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 50 μmol/L ACT dapat secara signifikan meningkatkan tingkat autofagosom dalam sel HepG2. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan 50 μmol/L ACT untuk campur tangan dalam model sel NAFLD yang dibangun secara in vitro, dan secara awal mengeksplorasi hubungan antara ituperlindungan hatifungsi dan autophagy.
Studi terkait pada model sel NAFLD telah menunjukkan bahwa setelah intervensi in vitro dengan asam lemak bebas, kadar TG sel HepG2 meningkat secara signifikan, dan agregasi tetesan lipid berminyak dapat diamati dengan jelas dalam sel [{{1}]. Dalam penelitian ini, 100 μmol/L PA digunakan untuk melakukan intervensi dalam sel HepG2 in vitro selama 24 jam. Tingkat TG sel HepG2 dalam kelompok model secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok kontrol kosong. Pada saat yang sama, agregasi tetesan lipid dapat dengan jelas diamati dalam sel, menunjukkan bahwa model sel NAFLD berhasil dibangun. Untuk lebih mengamati efek ACT pada model sel NAFLD, 50 μmol/L ACT digunakan untuk campur tangan dalam model sel in vitro NAFLD, dan efek ACT pada NAFLD dievaluasi dengan deteksi level TG dan pewarnaan minyak merah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa setelah intervensi ACT, tingkat TG dan jumlah tetesan lipid berminyak dalam sel HepG2 secara signifikan lebih rendah daripada yang ada dalam kelompok model, menunjukkan bahwa ACT memiliki aktivitas mengurangi TG dalam model sel NAFLD yang diinduksi PA. Untuk mempelajari lebih lanjut hubungan antara aktivitas penurun lipid ACT dan autophagy seluler, penelitian ini menggunakan LC 3- ⅱ Antibodi protein spesifik dan probe fluoresen Bodipy untuk co-stain autophagosom dan tetesan lipid. Diamati bahwa jumlah autophagosom dalam sel HepG2 setelah intervensi ACT secara signifikan meningkat dibandingkan dengan kelompok kontrol, yang konsisten dengan hasil protein immunoblotting dalam penelitian ini, lebih lanjut mengkonfirmasi bahwa ACT memiliki aktivitas penginduksi autofag dalam sel HepG2. Selain itu, setelah intervensi obat, autophagosom intraseluler dan tetesan lipid co-localized, menunjukkan bahwa efek ACT pada peningkatan degenerasi lemak NAFLD yang diinduksi PA dapat melibatkan keterlibatan autofag seluler. Namun, dalam model sel NAFLD, apakah ACT mengerahkan aktivitas farmakologisnya untuk mengurangi kadar TG intraseluler melalui jalur lipofagik masih perlu dijelaskan lebih lanjut dengan memblokir proses autofag intraseluler.
Singkatnya, di antara dua senyawa fenylethanol glikosida Cistanche deserticola, ACT memiliki kemampuan yang signifikan untuk menginduksi autophagy dalam sel HepG2. Pada saat yang sama, dalam model sel steatosis hepatik yang diinduksi PA, CT secara signifikan mengurangi tingkat TG dalam sel HepG2. Setelah intervensi ACT, autophagosom dan tetesan lipid dalam sel HepG2 memiliki hubungan co-lokalisasi tertentu, menunjukkan bahwa autophagy mungkin merupakan jalur baru yang terlibat dalam proses farmakologis ACT dalam hal perlindungan hati. Lihat Gambar 5. Dalam penelitian selanjutnya, mekanisme aksi ACT dalam menurunkan lipid akan dipelajari lebih lanjut secara rinci menggunakan autophagy blocker untuk meletakkan dasar bagi pengembangan obat baru di masa depan.