Spermidine Mengurangi Intrauterine Hypoxia-Induced Offspring Kerusakan Mitokondria Miokardial Baru Lahir pada Tikus Dengan Menghambat Stres Oksidatif Dan Mengatur Kontrol Kualitas Mitokondria Bagian 2
Jul 05, 2023
4.4. Efek Spermidine pada Aktivitas Antioksidatif Miokard dan Apoptosis pada Keturunan Baru Lahir yang Terpapar Hipoksia Intrauterin
Glikosida cistanche juga dapat meningkatkan aktivitas SOD di jaringan jantung dan hati, dan secara signifikan mengurangi kandungan lipofuscin dan MDA di setiap jaringan, secara efektif mengais berbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi dari kerusakan DNA yang disebabkan oleh radikal OH. Cistanche phenylethanoid glycosides memiliki kemampuan pemulungan radikal bebas yang kuat, kemampuan mereduksi yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktivitas SOD dalam suspensi sperma, mengurangi kandungan MDA, dan memiliki efek perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida Cistanche dapat meningkatkan aktivitas SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan jaringan paru-paru tikus tua yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangi kandungan MDA dan kolagen di paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, memiliki efek pemulungan yang baik pada DPPH, memperpanjang waktu hipoksia pada tikus tua, meningkatkan aktivitas SOD dalam serum, dan menunda degenerasi fisiologis paru-paru pada tikus tua eksperimental Dengan degenerasi morfologi seluler, percobaan telah menunjukkan bahwa Cistanche memiliki kemampuan antioksidan yang baik dan berpotensi menjadi obat untuk mencegah dan mengobati penyakit penuaan kulit. Pada saat yang sama, echinacoside di Cistanche memiliki kemampuan yang signifikan untuk mengais radikal bebas DPPH dan dapat mengais spesies oksigen reaktif, mencegah degradasi kolagen yang diinduksi radikal bebas, dan juga memiliki efek perbaikan yang baik pada kerusakan anion radikal bebas timin.
Klik Cara Menggunakan Cistanche Tubulosa
【Untuk info lebih lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Kami mengukur aktivitas enzim antioksidan SOD dan CAT di miokardium dengan kolorimetri (Gambar 4A dan B). Ditemukan bahwa aktivitas SOD dan CAT pada kelompok IUH secara signifikan lebih rendah dibandingkan pada kelompok kontrol (P < 0.05); Dibandingkan dengan kelompok IUH, aktivitas SOD dan CAT pada kelompok SPD meningkat secara signifikan (P < 0.05), dan DFMO menghilangkan efek SPD (P < 0. 05). Selanjutnya, kami mengevaluasi apoptosis sel dengan mendeteksi inti TUNEL-positif (Gambar 4CandD) dan ekspresi protein pro-apoptosis BAX dan anti-apoptosis BCl-2 (Gambar 4E dan F). Kami melihat bahwa jumlah kardiomiosit TUNELpositif dan rasio ekspresi protein BAX/BCL2 secara substansial lebih tinggi pada kelompok IUH dibandingkan pada kelompok kontrol (P <0,05). Sebaliknya, rasio sel TUNEL-positif dan rasio ekspresi protein BAX/BCL2 lebih rendah pada miokardium tikus yang diobati dengan SPD dibandingkan pada kelompok IUH (P <0,05). DFMO menghilangkan efek SPD (P <0,05). Singkatnya, SPD yang diberikan in utero dapat membalikkan penurunan aktivitas enzim antioksidan dan peningkatan apoptosis sel pada jantung keturunan yang diinduksi oleh IUH.
4.5. Efek Spermidine pada Produksi Spesies Oksigen Reaktif, Potensi Membran Mitokondria, dan Mitofag pada Kardiomiosit yang Terpapar Hipoksia
Disfungsi mitokondria terutama dimanifestasikan sebagai peningkatan produksi ROS, penurunan sintesis ATP, dan akumulasi mitokondria disfungsional. Potensi membran mitokondria (∆Ψm) adalah gradien elektrokimia proton (H + gradien konsentrasi dan perbedaan potensial transmembran) melintasi membran dalam mitokondria, yang terbentuk selama transfer elektron dari rantai pernapasan oksidatif mitokondria, di mana sejumlah kecil ROS diproduksi. Dengan demikian, tingkat ROS dan perubahan ∆Ψm adalah indikator utama fungsi mitokondria. Hasil produksi ROS yang berlebihan dalam akumulasi mitokondria disfungsional; mitokondria yang rusak terutama dihilangkan oleh mitophagy. Untuk menyelidiki apakah SPD eksogen dapat memengaruhi integritas fungsi mitokondria dalam kardiomiosit dalam kondisi hipoksia, pertama-tama kami memeriksa level ROS menggunakan probe fluoresensi DHE (Gambar 5A). Kami mengamati bahwa produksi ROS meningkat setelah kardiomiosit terpapar hipoksia selama 24 jam (P < 0.05) dan bahwa SPD menghambat produksi ROS yang diinduksi hipoksia (P < 0 .05); namun, DFMO menghilangkan penurunan produksi ROS yang dimediasi oleh SPD ketika DFMO disuplai ke kardiomiosit yang dirawat oleh SPD (P <0.05) (Gambar 5C). Selanjutnya, ∆Ψm dideteksi menggunakan probe fluorescent TMRE (Gambar 5B). Semakin kuat intensitas fluoresensi merah, semakin tinggi potensi mitokondria (P < 0.05). Kami melihat bahwa intensitas fluoresensi merah secara signifikan lebih rendah pada kelompok IUH dibandingkan kelompok kontrol (P < 0.05). Dibandingkan dengan kelompok IUH, intensitas fluoresensi merah lebih tinggi pada pengobatan SPD (P <0,05), dan DFMO menghapus efek SPD sekali lagi (P <0,05) (Gambar 5D). Kemudian kami memperkirakan colocalization mitokondria (diberi label dengan MitoTracker green) dengan lisosom (diberi label oleh Lyso-Tracker red), yang memungkinkan kami untuk mengukur degradasi mitokondria autofagik (Gambar 5E). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5F, dibandingkan dengan kontrol, hipoksia menurunkan kolokalisasi Mito-Tracker Green dan Lyso-Tracker Red pada kardiomiosit (P <0,05). Namun, dibandingkan dengan kelompok hipoksia, persentase colocalized mitokondria dan lisosom lebih tinggi pada kelompok perlakuan SPD (P <0,05), dan DFMO menghilangkan efek SPD (P <0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa hipoksia meningkatkan produksi ROS dan menurunkan ∆Ψm dan mitofag; SPD dapat meringankan kerusakan mitokondria yang diinduksi hipoksia dengan merangsang mitofag dan menghambat stres oksidatif.
4.6. Efek SPD pada sistem MQC miokard pada bayi baru lahir yang terpapar IUH
Kontrol kualitas mitokondria (MQC), termasuk proses autophagy mitokondria, biosintesis mitokondria, dan fusi dan fisi mitokondria, sangat penting untuk mempertahankan morfologi, kuantitas, dan fungsi normal mitokondria dan memastikan fungsi normal dan metabolisme sel. Mitophagy mengatur MQC dan memediasi degradasi autofagik ekstensif mitokondria sebagai respons terhadap perubahan jalur dan fisiologis. Kami pertama kali mengevaluasi mitophagy dengan mengamati pembentukan mitophagosome dengan TEM (Gambar 6A - C). Menurut hasil, beberapa struktur abnormal atau mitokondria fragmentasi tertutup dalam membran autofagik membran ganda, yang merupakan mitofagosom, dan menunjukkan bahwa mitofag aktif pada kelompok kontrol. Namun, jumlah mitofagosom sangat menurun pada miokardium kelompok IUH. Menariknya, miokardium kelompok SDP menunjukkan fenotip mitofag yang hampir identik dengan kelompok kontrol, sementara DFMO menghilangkan efek yang diinduksi oleh SPD. Mitokondria adalah organel yang sangat dinamis, mengalami peristiwa fisi dan fusi konstan yang terkait dengan fungsinya. Kami selanjutnya memeriksa fragmentasi mitokondria menggunakan TEM (Gambar 6A). Kami menemukan bahwa jumlah mitokondria kecil dan fragmen meningkat secara signifikan oleh IUH, dibandingkan dengan kontrol (P < 0.05), menunjukkan bahwa fisi mitokondria meningkat secara luas. Perubahan ini tertahan oleh perlakuan SPD, dan DFMO juga menghapus peran SPD sekali lagi (Gambar 6D). Selanjutnya, DRP1 dan MFN2 (protein pengatur dinamika mitokondria) terdeteksi (Gambar 6E - G). MFN2 menurun secara signifikan, sedangkan DRP1 meningkat dan diamati pada kelompok IUH dibandingkan dengan kelompok kontrol (P < 0.05). Sedangkan DRP1 diatur ke bawah dan MFN2 diregulasi dengan pengobatan SPD eksogen (P < 0.05), DFMO menghapus efek yang diinduksi oleh SPD. Biosintesis mitokondria berkoordinasi dengan mitofag untuk menghilangkan mitokondria yang rusak atau berlebih, menghasilkan mitokondria baru, dan mempertahankan homeostasis MQC dalam kondisi stres. Akhirnya, kami mengevaluasi ekspresi protein terkait biosintesis mitokondria, termasuk SIRT-1, PGC-1 , NRF-2, dan TFAM, dengan analisis imunoblot (Gambar 6H - L). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, ekspresi SIRT-1, PGC-1 , NRF-2, dan TFAM menurun secara signifikan pada miokardium kelompok IHU (P <0,05). Dibandingkan dengan kelompok IUH, ekspresi protein SIRT-1, PGC-1 , NRF-2, dan TFAM pada kelompok SPD meningkat secara signifikan (P <0,05). DFMO menghapus efek SPD (P <0,05). Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa IUH mengarah pada disfungsi MQC pada miokard anak berumur satu hari dan bahwa pengobatan SPD secara signifikan menghambat ketidakseimbangan sistem MQC pada keturunan neonatal yang terpapar IUH.
5. Diskusi
Penyakit jantung adalah tantangan kesehatan utama di seluruh dunia. Telah dibuktikan bahwa hipoksia janin kronis dapat memicu disfungsi jantung yang berasal dari janin dan memprogram peningkatan risiko penyakit jantung pada keturunan dewasa. Jantung memiliki tingkat metabolisme yang tinggi, dan ketergantungannya pada fungsi mitokondria untuk produksi energi sangat penting untuk fungsi jantung yang normal. Namun, efek IUH pada fungsi mitokondria jantung dan mekanisme terkaitnya serta fokus strategi pencegahan perlindungan jantung pada mitokondria pada bayi baru lahir masih belum diketahui. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa tikus satu hari di luar musim semi yang terpapar IUH menunjukkan kelainan yang signifikan dalam pertumbuhan dan perkembangan, pematangan kardiomiosit, terutama dalam struktur dan fungsi mitokondria miokard, dan suplemen SPD eksogen di dalam rahim dapat meredakan IUH ini. perubahan dengan menghambat stres oksidatif miokard dan mengurangi apoptosis. Yang penting, kami memperhatikan bahwa pengobatan SPD prenatal dapat secara signifikan membalikkan kelainan mitophagy dan biogenesis, dan fragmentasi mitokondria dalam miokardium tikus baru lahir yang diinduksi oleh IUH. Sepengetahuan kami, penelitian ini adalah laporan pertama tentang efek perlindungan SPD pada kerusakan jantung bayi baru lahir yang diinduksi IUH dengan mengatur mekanisme MQC dan kemudian meningkatkan fungsi mitokondria.
Bukti yang cukup menunjukkan bahwa pembatasan pertumbuhan intrauterin mengganggu jalur perkembangan sistem janin, yang dapat merusak fungsi jantung di kemudian hari (5, 7, 37). Dalam penelitian kami, IUH menyebabkan retardasi pertumbuhan dan kerusakan jantung pada tikus keturunan neonatal, karena tikus baru lahir satu hari yang terpapar IUH menunjukkan penurunan berat badan yang signifikan, dan berat badan serta peningkatan rasio berat badan/berat badan. Selain itu, susunan serabut miokardium tidak teratur, miofilamen rusak, infiltrasi sel inflamasi terlihat di antara miofilamen, dan deposisi kolagen miokardium meningkat. Temuan ini konsisten dengan temuan yang dilaporkan oleh Ducsay et al. (2) dan Thompson et al. (7). Pada beberapa model hewan, jantung janin yang terpapar hipoksia kronis menunjukkan pematangan dan proliferasi kardiomiosit yang berkurang dan penurunan jumlah kardiomiosit (38, 39). Demikian pula, penelitian kami juga menunjukkan bahwa proporsi kardiomiosit binukleat meningkat dan ekspresi Ki67 menurun pada kelompok IUH. Waktu di mana kardiomiosit menjadi bi/multi-nukleasi bertepatan dengan waktu ketika mamalia kehilangan potensi regeneratifnya (40). Pematangan jantung janin penting untuk kesehatan jantung anak. Dengan demikian, IUH membuat kardiomiosit menarik diri dari siklus sel sebelumnya, dan gangguan pematangan kardiomiosit menyebabkan gangguan plastisitas pertumbuhan jantung pascakelahiran.
Tak perlu dicatat bahwa mitokondria adalah organel seluler utama yang terlibat dalam produksi ROS; mitokondria disfungsional tidak hanya diproduksi sebagai respons terhadap penurunan produksi ATP tetapi juga peningkatan stres oksidatif dan apoptosis (41). Dalam penelitian ini, IUH secara signifikan menurunkan aktivitas enzim antioksidan SOD dan CAT, menurunkan fungsi pernapasan mitokondria dan kadar ATP, meningkatkan ekspresi BAX/BCL2, dan merusak struktur mitokondria pada miokardium tikus yang baru lahir satu hari. Temuan ini didukung oleh peneliti lain (11), yang mendokumentasikan bahwa paparan hipoksia kronis ibu selama kehamilan dapat menurunkan aktivitas IV kompleks mitokondria dan menginduksi apoptosis pada jantung janin tikus jangka pendek. Kami berpendapat bahwa kompromi mitokondria mungkin mendukung stres oksidatif dan kegagalan energi selama perkembangan janin yang berpuncak pada cedera jantung perinatal. Ini bisa menjadi alasan utama peningkatan risiko kardiovaskular pada keturunan kehamilan yang diperumit oleh hipoksia janin kronis. Dengan demikian, mitokondria dapat diimplementasikan sebagai target intervensi terapeutik untuk melindungi fungsi jantung pada keturunannya. Aljunaidy dkk. melaporkan bahwa pengobatan ibu dengan antioksidan mitokondria MitoQ mencegah stres oksidatif plasenta, menyelamatkan pertumbuhan janin, dan meningkatkan fungsi jantung pada keturunan yang terpapar IUH (42).
Spermidin adalah poliamina dengan berbagai fungsi biologis. Seperti yang kami sebutkan, SPD dapat menghambat akumulasi ROS yang diinduksi H2O2- dan mencegah penurunan potensi membran mitokondria (MMP) dan tingkat ATP dalam kardiomiosit tikus neonatus dan sel H9C2 yang dikultur. Selain itu, SPD dapat mempromosikan biogenesis mitokondria dan meningkatkan fungsi mitokondria pada jantung yang menua (43). Poliamina spermine dan spermidine dapat mempengaruhi proteom mitokondria dinamis, sehingga mencegah perubahan terkait usia pada fungsi jantung dan penuaan jantung (36). Penelitian lain juga menunjukkan bahwa tambahan SPD menunda penuaan jantung dengan meningkatkan mitofag dan meningkatkan respirasi mitokondria pada tikus (44). ODC adalah enzim kunci dari sintesis poliamina, dan dilaporkan bahwa penghancuran ODC secara in vivo atau penerapan DFMO, penghambat ODC yang ireversibel menghasilkan perkembangan konseptus yang terganggu dan retardasi pertumbuhan janin karena ketersediaan poliamina yang tidak mencukupi (45, 46). Studi kami saat ini menunjukkan bahwa pengobatan dengan 5 mg/kg/hari SPD pada tikus yang terpapar IUH mencegah retardasi pertumbuhan dan perubahan struktur morfologi jantung dan pematangan pada bayi baru lahir. Selain itu, peningkatan stres oksidatif jantung yang diinduksi IUH, peningkatan apoptosis, dan penurunan pernapasan mitokondria pada keturunan neonatal juga dicegah oleh SPD, sementara DFMO yang diberikan kepada ibu menghapuskan perlindungan yang dimediasi SPD untuk jantung neonatal. Telah didokumentasikan dengan baik bahwa poliamina terlibat dalam angiogenesis dan embriogenesis plasenta serta pertumbuhan dan perkembangan embrionik dan janin (47). Zhu dkk. melaporkan bahwa kadar poliamina lebih rendah dalam plasma vena umbilikalis dari janin babi dengan pembatasan pertumbuhan intrauterin (IUGR), dan SPD tambahan pada ibu dapat mencegah IUGR (48). Spermidin adalah senyawa dengan keamanan yang wajar dan toksisitas yang lebih rendah (49). Meningkatnya jumlah studi praklinis dan klinis telah menunjukkan bahwa diet SPD memiliki efek kesehatan seperti antipenuaan, perlindungan kardiovaskular, neuromodulasi, dan fungsi anti-inflamasi, seperti injeksi SPD intraperitoneal (50 mg/kg) pada tikus melindungi terhadap kolagen yang diinduksi. arthritis dengan menghambat polarisasi makrofag M1 dalam jaringan sinovial (50). Suplementasi dengan 10 mg/kg/hari SPD membalikkan kerusakan jantung terkait usia pada tikus (36). Lebih penting lagi, sang ibu melakukan intervensi dengan 5 mg/kg/hari SPD selama akhir kehamilan untuk meningkatkan penurunan fungsi kognitif dan saraf yang diinduksi IUH (51) dan kerusakan stres oksidatif jantung pada keturunan tikus (32). Oleh karena itu, kami menggunakan dosis SPD yang sama (5 mg/kg/hari) untuk tikus hamil yang terpapar IUH seperti pada penelitian kami sebelumnya. Kami menduga bahwa suplementasi SPD ibu selama kehamilan hipoksia dapat meningkatkan kadar SPD dalam sirkulasi janin, yang mungkin terkait dengan perlindungan terhadap stres oksidatif yang mengakibatkan plasenta, yang akan melindungi mitokondria di jantung yang sedang berkembang dari pemrograman oleh IUH, tindakan dari SPD dapat dicapai dengan mekanisme antioksidatif, anti-apoptosis, dan proliferasi yang kuat.
Mekanisme kontrol kualitas mitokondria sangat penting untuk mempertahankan morfologi, jumlah, dan fungsi normal mitokondria dan memastikan fungsi normal dan metabolisme sel (16). Bukti terbaru telah mengungkapkan bahwa mekanisme MQC memainkan peran yang menentukan dalam pematangan mitokondria miokard perinatal dan perkembangan jantung (14). Gong dkk. pertama kali melaporkan bahwa mitokondria seperti janin yang belum matang secara langsung terdegradasi oleh mitofag yang dimediasi-Parkin selama periode pascakelahiran awal (19). Sementara itu, biogenesis mitokondria meningkat secara dramatis (52), dan faktor fusi dan fisi mitokondria diregulasi secara transkripsi di jantung setelah lahir (20, 21). Namun, lebih sedikit yang diketahui tentang efek IUH pada MCQ pada miokardium bayi baru lahir. Dalam penelitian ini, kami pertama kali mengamati bahwa jumlah mitophagosome menurun secara signifikan pada miokardium kelompok IUH, menunjukkan bahwa IUH mengganggu mitophagy miokard tikus yang baru lahir. Selanjutnya, kami mengamati ekspresi PGC-1 yang menurun secara signifikan (pengatur utama biogenesis mitokondria) dan ekspresi molekul pensinyalan hulu dan hilirnya, termasuk SIRT-1, TFAM, dan NRF{{10} } dalam miokardium kelompok IUH. Selain itu, kami menemukan bahwa paparan IUH membuat mitokondria menjadi lebih kecil atau terfragmentasi dan ekspresi DRP1 meningkat; Namun, ekspresi MFN2 menurun pada miokardium tikus yang baru lahir, menunjukkan bahwa fisi mitokondria diregulasi, dan fusi diregulasi ke bawah. Temuan ini mencerminkan hubungan sebab-akibat antara ketidakseimbangan mekanisme MQC dan kerusakan miokardium yang diinduksi IUH pada bayi baru lahir. Proses MQC yang kompleks ini berfungsi bersama satu sama lain untuk menghilangkan mitokondria disfungsional dengan cara yang spesifik dan terarah dan mengoordinasikan biogenesis organel baru, yang penting untuk homeostasis kardiovaskular. Banyak sinyal intraseluler dan ekstraseluler dapat mengatur kejadian MQC, termasuk stres oksidatif, potensi keruntuhan membran, apoptosis, dan lain-lain. Di sini, ketidakseimbangan MQC mitokondria dapat dikaitkan dengan peningkatan stres oksidatif dan peningkatan apoptosis di jantung tikus keturunan yang terpapar IUH. Oleh karena itu, sangat penting untuk mempertahankan mekanisme MQC yang sesuai untuk memastikan jaringan mitokondria yang sehat di jantung bayi baru lahir yang terpapar IUH.
Mengingat bahwa tingkat SPD plasenta sangat terkait dengan pembatasan pertumbuhan janin (53), SPD dapat mengatur MQC dalam model hewan yang berbeda. Misalnya, SPD adalah penginduksi autophagy yang kuat dan spesifik untuk memperpanjang umur, yang dapat melindungi proses penuaan beberapa jaringan, termasuk jantung, otak, dan otot rangka (44, 54, 55). Spermidin dapat meringankan penuaan jantung dengan meningkatkan biogenesis mitokondria (43). Dalam penelitian ini, kami menerapkan SPD pada tikus ibu dan menemukan bahwa SPD dapat menormalkan ketidakseimbangan MQC miokardium pada keturunan yang terpapar IUH. Namun, pengobatan ibu dengan penghambat ODC DFMO menghilangkan efek SPD, menunjukkan bahwa intervensi SPD dapat mencegah MQC abnormal pada miokardium tikus keturunan satu hari yang terpapar IUH. Singkatnya, kerja MQC yang sangat baik dalam miokardium anak yang baru lahir dapat menyempurnakan struktur, fungsi, dan pematangan mitokondria, sehingga mewujudkan transformasi dari kapasitas glikolisis intrauterin menjadi pasokan energi oksidasi asam lemak pascakelahiran dan memenuhi peningkatan beban jantung setelah lahir. . Selain itu, percobaan kami pada kardiomiosit menunjukkan bahwa SPD dapat menghambat peningkatan produksi ROS yang diinduksi hipoksia, penurunan ∆Ψm, dan gangguan degradasi mitokondria autophagic. Kami menyimpulkan bahwa efek menguntungkan dari SPD dapat dikaitkan dengan peningkatan kadar SPD dalam plasenta dan sirkulasi dengan menerapkan SPD ibu, sehingga melindungi mitokondria miokard keturunan dari program pengembangan oleh IUH.
5.1. Kesimpulan
Penelitian ini menyoroti bahwa terapi SPD dalam rahim dapat melindungi miokardium suatu hari - jantung anak dari efek buruk hipoksia prenatal. Perubahan postnatal yang disebabkan oleh SPD ini dapat dicapai dengan antioksidan dan anti-apoptosis dan dengan mengatur jalur MQC, sehingga mengurangi perkembangan mitokondria yang diprogram di jantung yang terpapar IUH. Ada beberapa keterbatasan dalam penelitian ini. Kami tidak melakukan percobaan farmakokinetik pada SPD, dan dengan demikian, kami tidak dapat menentukan tingkat SPD yang tepat dalam sirkulasi janin saat ibu diberikan SPD. Dalam penelitian kami selanjutnya, kami akan menyelidiki lebih lanjut konsentrasi darah efektif SPD menggunakan plasenta janin. Temuan ini memberikan kerangka kerja baru untuk studi masa depan untuk menentukan peran SPD dalam mencegah mitokondria miokard keturunan IUH neonatal.
【Untuk info lebih lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
