Stabilisasi Sitoskeleton Aktin Secara Simultan dalam Beberapa Sel Spesifik Nefron Melindungi Ginjal Dari Beragam Cedera

Penyakit ginjal kronisDancedera ginjal akutsecara mekanispenyakit ginjal yang berbeda. Sedangkan penyakit ginjal kronis berhubungan dengancedera podosit, cedera ginjal akutmempengaruhi sel epitel tubulus ginjal. Terlepas dari perbedaan-perbedaan ini,fitur utamakeduanyapenyakit ginjal akut dan kronisadalah sitoskeleton aktin yang tidak teratur. Kami telah menunjukkan hal ituaktivasi farmakologis dinamin GTPasememperbaiki cedera podosit dimodel murine penyakit ginjal kronisolehmempromosikan polimerisasi aktin. Di sini kita menetapkan peran dinamin dalam memodulasi kekakuan dan polaritassel epitel tubulus ginjaldengan menghubungkan silang filamen aktin ke dalam jaringan bercabang. Aktivasi kemampuan pengikatan silang dinamin oleh agonis molekul kecil menstabilkan korteks aktomiosin pada membran apikal terhadap cedera, yang pada gilirannyamempertahankan fungsi ginjaldalam berbagai model murine cedera ginjal akut. Khususnya, agonis dinamin secara bersamaan melemahkan podosit dancedera tubulardalam model murine genetik sindrom Alport. Studi kami memberikan bukti kelayakan dan menyoroti hal tersebutmanfaat terapi pelindung nefron holistik baru.

KLIK DI SINI UNTUK MENGETAHUI FORMULASI HERBAL CISTANCHE BAIK PADA CEDERA GINJAL AKUT

Itupenyebab utama cedera ginjal akut(AKI) adalahiskemia, hipoksia, ataunefrotoksisitas1. Meskipun hal ini dapat diatasi, AKI merupakan masalah kesehatan yang signifikan dengan angka kematian yang tinggi dan tidak adanya pengobatan yang pasti. Terlepas dari etiologinya, AKI terutama melukai sel-sel epitel terpolarisasi dari tubulus ginjal yang mikrovili apikalnya membentuk batas sikat tubular yang berperan dalam koordinasi elektrolit esensial dan transportasi air2. Ciri morfologi awal AKI adalah hilangnya batas sikat dan polaritas sel akibat rusaknya korteks aktomiosin pada membran apikal1.

Pembentukan dan pemeliharaan polaritas sel melibatkan kaskade sinyal, perdagangan membran, dan dinamika sitoskeletal, yang semuanya sangat terkoordinasi3. Organisasi membran apikal sangat ditentukan oleh arsitektur jaringan aktomiosin4, yang membentuk kekakuan korteks, sehingga memfasilitasi pengelompokan protein polaritas. Sementara motor miosin II dianggap sebagai generator utama kekakuan kortikal5,6, arsitektur korteks aktomiosin dibentuk oleh segudang protein pengikat aktin (ABP)7.

Selain ABP yang diketahui, brush border tubulus ginjal juga diperkaya dengan dinamin8, sebuah GTPase yang terkenal karena perannya dalam endositosis9. Dinamin memiliki kecenderungan intrinsik untuk berkumpul menjadi beberapa keadaan oligomerisasi seperti dimer, tetramer, cincin, dan spiral9. Kami mengidentifikasi untuk pertama kalinya interaksi langsung dinamin-aktin dan menunjukkan bahwa oligomerisasi dinamin mengatur polimerisasi aktin dalam podosit, sel khusus yang penting untuk selektivitas filter ginjal. Dengan menggunakan model CKD murine, kami telah menunjukkan bahwa aktivasi polimerisasi aktin yang bergantung pada dinamin membalikkan cedera podosit dengan memulihkan struktur dan fungsinya yang unik12.

Di sini kami menunjukkannya disel epitel tubulus ginjal, dinamin menghubungkan aktin berfilamen (F-aktin) ke dalam jaringan bercabang. Kemampuan ikatan silang Dynamin ditentukan oleh keadaan oligomerisasinya dan panjang F-aktin. Aktivasi farmakologis oligomerisasi dinamin melawan AKI dengan menstabilkan jaringan aktin dan integritas sel, yang sebagian melindungi sel epitel ginjal dari cedera akibat stres oksidatif. Penelitian kami mengidentifikasi korteks aktomiosin pada membran apikal sel tubulus ginjal sebagai target obat pada AKI melalui dinamin sebagai proksi.

Hasil Oligomerisasi dinamin menentukan kekakuan dan morfologi membran apikal.

Untuk menguji peran interaksi dinamin-aktin dalam sel epitel tubulus ginjal terpolarisasi, kami menggunakan Bis-T-23, sebuah aktivator alosterik oligomerisasi dinamin yang bergantung pada aktin dalam sistem yang dilarutkan13, dalam sel11,13, dan dalam seluruh organisme12. Fenotip seluler dinilai dalam sel Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) dengan mengikuti status F-aktin dan pola pewarnaan protein persimpangan ketat zonula occludens-1 (ZO-1), yaitu dianggap sebagai biomarker polaritas sel. Cytochalasin D (CytoD) dan latrunculin A (LatA), yang dikenal sebagai penghambat polimerisasi aktin, menurunkan kadar F-aktin, dan menginduksi pewarnaan ZO-1 yang terputus-putus (Gambar Tambahan 1a). Sebaliknya, Bis-T-23 menginduksi sedikit peningkatan kadar F-aktin tanpa efek apa pun pada pewarnaan ZO-1. Penambahan Bis-T-23 sebelum tetapi tidak setelah LatA, mempertahankan sebagian tingkat F-aktin dan polaritas sel. Baik kendaraan DMSO maupun penghambat dinamin dynole14 tidak menunjukkan efek apa pun (Gambar Tambahan 1a).

Pemindaian mikroskop elektron (SEM) memungkinkan kami untuk memvisualisasikan perubahan morfologi sel yang diinduksi obat dengan fokus pada membran apikal (Gambar 1a). Tinggi sel MDCK rata-rata adalah 11 ± 2 µm, dan panjang rata-rata mikrovili adalah 0.63 ± 0.2 µm (Tabel 1), yang berada dalam kisaran yang diamati pada ginjal15. LatA menurunkan tinggi sel, dan panjang mikrovili dan menggeser mikrovili yang terdistribusi secara seragam ke dalam kelompok, sedangkan Bis-T-23 menginduksi efek sebaliknya (Tabel 1, Gambar 1a). Saat ditambahkan sebelum LatA, Bis-T-23 mempertahankan sebagian tinggi sel dan panjang mikrovili. Karena mikrovili menunjukkan kontrol panjang yang sangat baik yang ditentukan oleh aktin kortikal pada dasarnya16, data ini memberikan bukti bahwa Bis-T-23 memodifikasi korteks aktomiosin pada membran apikal.

Untuk menentukan efek pasti yang dimiliki Bis-T-23 pada aktin kortikal, kami memvisualisasikan korteks aktomiosin di dalam lamellipodia menggunakan mikroskop elektron replika platinum (PR-EM). LatA menurunkan kepadatan jaringan aktin, dan efek ini sebagian dihilangkan dengan penambahan Bis-T-23 sebelum LatA (Gbr. 1b). Ketika LatA mempercepat depolimerisasi filamen aktin dengan mengasingkan monomer aktin, kami selanjutnya memeriksa apakah pelestarian korteks aktomiosin yang diamati oleh Bis-T-23 disebabkan oleh efek positifnya pada polimerisasi aktin. Berbeda dengan stimulasi kuat polimerisasi aktin yang diamati pada ekstrak sel podosit, Bis-T-23 hanya sedikit meningkatkan polimerisasi aktin dalam ekstrak sel MDCK (Gambar Tambahan 1b). Demikian pula, penipisan imun dinamin endogen-2 (Dyn2) dari ekstrak atau penghambatan aktivitas GTPase oleh dinode mengakibatkan penurunan kecil polimerisasi aktin (Gambar Tambahan 1c). Sementara LatA dan CytoD secara signifikan mengganggu polimerisasi aktin, penambahan Bis-T-23 sebelum LatA atau CytoD tidak mampu mengatasi efek penghambatannya (Gambar Tambahan 1d, e). Jasplakinolide, obat yang menginduksi polimerisasi aktin dengan menstimulasi nukleasi filamen aktin , tidak secara signifikan meningkatkan tingkat polimerisasi keseluruhan (Gambar Tambahan 1d), menunjukkan bahwa lisat sel MDCK menunjukkan tingkat aktin terpolimerisasi yang mendekati maksimal. Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa efek Bis-T-23 pada morfologi membran apikal sel MDCK didorong oleh mekanisme selain polimerisasi aktin.

Mengingat pengetahuan umum tentang lokalisasi Dyn2 dan F-aktin yang diperkaya di perbatasan sel epitel ginjal, dan peran dinamin dalam endositosis, kami selanjutnya menyelidiki apakah Bis-T-23 memengaruhi aktin secara tidak langsung melalui perubahan endositosis. Seperti yang diharapkan, baik Dyn2 dan F-aktin berkolokasi di korteks aktomiosin di bawah membran apikal, di dalam mikrovili, dan di lubang berlapis clathrin (CCP), yang ditentukan oleh bentuk dan ukurannya yang berbeda (Gambar Tambahan 1f). Kami memeriksa dinamika CCP menggunakan mikroskop fluoresensi refleksi internal total (TIRF)18,19. Bis-T-23, bahkan pada konsentrasi tertinggi, tidak berpengaruh pada distribusi masa hidup CCP, sedangkan dynole menurunkan jumlah CCP produktif (Gambar Tambahan 1g). Kurangnya korelasi antara tingkat endositosis dan perubahan morfologi sel menegaskan bahwa Bis-T- 23 menargetkan aktin kortikal tanpa mempengaruhi peran dinamin dalam endositosis.

Karena polaritas sel ginjal dipertahankan oleh arsitektur dan kontraksi jaringan aktomiosin yang berkelanjutan, yang membentuk kekakuan sel pada membran apikal, kami selanjutnya mengukur kekakuan sel menggunakan mikroskop kekuatan atom (AFM). Sistem Nanowizard IV dan perangkat lunak analisis JPK digunakan untuk menentukan perubahan Modulus21 Young dalam pengaturan eksperimental yang berbeda (Gambar Tambahan 2a). Pengobatan dengan LatA menghasilkan penurunan yang signifikan dalam kekakuan kontak sel-sel dan kekakuan sel apikal dalam sel MDCK (Gambar 1c – e). Sebaliknya, Bis-T-23 secara signifikan meningkatkan kekakuan sel dibandingkan dengan kendaraan DMSO (Gambar 1c – e), konsisten dengan efek positifnya pada tinggi sel, jumlah mikrovili, dan kepadatan jaringan aktin (Tabel 1 dan Gambar 1b)22. Penambahan Bis-T-23 sebelum LatA sangat mengurangi efek negatif LatA pada kekakuan sel (Gbr. 1c – e), sesuai dengan efek positif Bis-T-23 pada jaringan aktin dan morfologi sel apikal (Tabel 1, Gambar 1b).

Gambar 1 Oligomerisasi dinamin mendefinisikan kekakuan sel dengan mempengaruhi arsitektur aktin dalam sel epitel ginjal. a Gambar SEM Representatif sel MDCK yang diobati dengan DMSO (0.1%) atau Bis-T-23 (30 µM, 0.1% DMSO) untuk 1 0 menit sebelum penambahan DMSO (0.1%) atau LatA (0.2 µM, 0.1% DMSO) untuk 2{{23} } mnt. Gambar insets yang diperbesar (daerah kotak oranye) menunjukkan susunan, distribusi, dan kepadatan mikrovili pada membran apikal. b Gambar PR-EM representatif dari sel MDCK diperlakukan seperti dijelaskan pada (a). Gambar menunjukkan perubahan organisasi korteks aktomiosin dalam sel MDCK dalam kondisi yang ditunjukkan. c Gambar representatif dari peta Modulus Young sel MDCK diperlakukan seperti dijelaskan pada (a). d, e Grafik batang mewakili Modulus Young yang menggambarkan kekakuan sel yang diukur pada persimpangan sel-sel (d) atau pada membran apikal (e). Setiap simbol mewakili kekakuan rata-rata dari satu sel. Hasil yang ditunjukkan pada d, e dihasilkan dari setidaknya 10 sel dari setidaknya tiga cawan kultur. Bilah kesalahan, rata-rata ± SD (*P Kurang dari atau sama dengan 0,05, **P Kurang dari atau sama dengan 0,01, ***P Kurang dari atau sama dengan 0,001, ****P Kurang dari atau sama dengan 0,0001, tidak berpasangan uji-t dua sisi). tidak, tidak signifikan.

Kami juga telah menentukan kekakuan sel menggunakan sistem BioScope II sebagai pendekatan eksperimental alternatif untuk AFM. Dalam hal ini, kurva indentasi gaya diperoleh mengikuti model Discer dan rekan kerja yang dihitung dengan perangkat lunak Matlab23. Tren serupa sehubungan dengan kekakuan sel dicatat untuk interaksi antara LatA dan Bis-T-23 (Gambar Tambahan 2b, 2c). Selain itu, dynode tidak menunjukkan efek apa pun pada kekakuan sel, sedangkan CytoD secara signifikan menurunkan kekakuan sel (Gambar Tambahan 2d, e), sesuai dengan fenotip aktinnya (Gambar Tambahan 1a). Bersama-sama, data ini menetapkan korelasi antara status korteks aktomiosin, kekakuan sel, morfologi membran apikal, dan polaritas sel. Temuan ini juga secara meyakinkan menunjukkan peran oligomerisasi dinamin dalam menentukan parameter mekanis polaritas sel epitel melalui pengaruhnya pada korteks aktomiosin.

Dynamin menghubungkan filamen aktin menjadi jaringan bercabang yang mendasari polaritas sel. Untuk menjelaskan mekanisme molekuler dimana oligomerisasi dinamin mempengaruhi arsitektur korteks aktomiosin, kami selanjutnya menguji efek dinamin pada filamen aktin dalam sistem yang dibentuk kembali. Berdasarkan hipotesis saat ini, panjang filamen aktin menentukan cara ikatan silangnya6. Karena panjang rata-rata filamen aktin kortikal dalam jaringan di ujung depan adalah antara 100 dan 150 nm24, kami menguji efek dinamin pada pengorganisasian filamen pendek yang dihasilkan dengan membatasi F-aktin dengan gelsolin (Gsn-aktin) (Gbr. 2). 2a). Penambahan Dyn2 menghasilkan pembentukan jaringan yang besar dan bercabang (Gbr. 2b, c). Berdasarkan ukuran dan bentuk Dyn2 rekombinan (Gbr. 2d), jaringan dibentuk terutama oleh dimer Dyn2 (Dyn2DIMER) dan tetramer (Dyn2TETRA) yang berinteraksi dengan beberapa filamen aktin (Gbr. 2e): Dyn2DIMER terikat hingga dua filamen, Dyn2TETRA mengikat hingga empat filamen, dan Dyn2RING mengikat hingga enam filamen. Perbesaran gambar yang rendah mengungkapkan bahwa jaringan yang bergantung pada dinamin membentuk pola bentuk seperti cincin yang lebih kecil dan lebih besar (Gbr. 2c).

Untuk mengkorelasikan pengamatan dari sistem yang dibentuk kembali dengan peran dinamin dalam sel, kami selanjutnya menentukan lokalisasi Dyn2 endogen pada jaringan aktin kortikal menggunakan antibodi anti-Dyn2 monoklonal diikuti oleh antibodi sekunder terkonjugasi emas (Gambar Tambahan 3a-c). Seperti yang terlihat dalam sistem yang dibentuk kembali, dinamin dikaitkan dengan sejumlah F-aktin yang berbeda dalam jaringan bercabang (Gbr. 2f). Bersama-sama, data ini mengidentifikasi aktivitas baru dinamin, yaitu menghubungkan silang F-aktin ke dalam jaringan bercabang.

Untuk mengkorelasikan kemampuan ikatan silang dinamin dan efek perlindungan Bis-T-23 pada korteks aktomiosin dan morfologi membran apikal, kami selanjutnya menguji efek Bis-T-23 pada mediator dinamin jaringan dalam sistem yang dibentuk kembali (Gbr. 3a). Berdasarkan plot kontur, yang memberikan representasi topografi dari berbagai kepadatan filamen, Bis T-23 meningkatkan kepadatan jaringan secara keseluruhan (Gbr. 3a), yang dapat dijelaskan oleh peningkatan jumlah F-aktin yang terikat pada dinamin karena peningkatan oligomerisasinya. Selain itu, dinamin lebih kuat berikatan silang dengan filamen pendek daripada F-aktin panjang (Gbr. 3a – c), menunjukkan bahwa kemampuan dinamin untuk membentuk jaringan bercabang ditentukan oleh status oligomerisasi dan panjang filamen aktin. Kemampuan untuk menghubungkan filamen aktin ke dalam jaringan dimiliki oleh dua isoform dinamin, yang diekspresikan di mana-mana Dyn2 dan dinamin spesifik neuron-1 (Dyn1) (Gbr. 3b, c).

Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Toko:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop