Pemindaian Mikroskop Konduktansi Ion Glomerulus Manusia Hidup

Untuk informasi selengkapnya:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrew Shevchuk3|Oleg Palygin1|Alexander Staruschenko1,4

1Departemen Fisiologi, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA2Department of Cellular Membranology, Bogomoletz Institute of Physiology, Kyiv, Ukraina3Department of Medicine, Imperial College London, London, UK4Clement J. Zablocki VA Medical Center, Milwaukee, WI, USA

KorespondensiAlexander Staruschenko dan Ruslan Bohovyk, Departemen Fisiologi, Medical College of Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, AS.Email: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Informasi pendanaanDepartemen Urusan Veteran, Nomor Hibah/Penghargaan: I01 BX004024; Institut Jantung, Paru, dan Darah Nasional, Nomor Hibah/Penghargaan: P01 HL116264 dan R35 HL135749; American Physiological Society, Nomor Hibah/Penghargaan: Penghargaan Peningkatan Karir Penelitian; Institut Nasional Diabetes dan Pencernaan danGinjalPenyakit, Nomor Hibah/Penghargaan: DK126720

Abstrak

Kerusakan podosit adalah ciri penyakit glomerulus, seperti glomerulosklerosis segmental fokal, biasanya terkait dengan albuminuria yang nyata dan perkembangan patologi ginjal. Abnormalitas dan kehilangan struktur podosit juga terkait dengan penyakit perubahan minimal dan lebih umumpenyakit ginjal diabetes. Di sini kami menerapkan teknik pemindaian ion conductance microscopy (SICM) pertama kali untuk menilai manusia yang baru diisolasiglomerulustopologi. SICM memberikan kesempatan unik untuk mengevaluasiglomeruluspodosit serta segmen struktural nefron lainnya dengan resolusi mikroskop elektron tetapi dalam sampel hidup. Ditampilkan di sini adalah penerapan metode SICM pada manusia hidupglomerulus, yang memberikan bukti prinsip untuk analisis dinamis morfologi membran di masa depan dan berbagai parameter fungsional dalam sel hidup.

Klik untuk efek samping cistanche dan Cistanche untuk penyakit ginjal

1. PERKENALAN

Glomerulusmewakili seberkas kapiler yang terletak di bagian masuk nefron, di mana darah disaring secara selektif melintasi penghalang filtrasi glomerulus yang terdiri dari sel-sel endotel, membran basal glomerulus, dan podosit. Proses primer dan sekunder dari podosit yang berdekatan terjalin, menciptakan celah diafragma yang menutupi kapiler glomerulus dengan rapat. Diafragma ini memiliki morfologi yang kompleks dan membentuk penghalang akhir untuk penyaringan darah yang berkontribusi pada selektivitas ukuran dan memungkinkan permeabilitas molekul yang lebih kecil dari albumin. Pengurangan jumlah podosit dan penipisan proses kaki dilaporkan pada glomerulosklerosis segmental fokal, penyakit perubahan minimal, dan nefropati diabetik.1-3Selain itu, hilangnya podosit dan modifikasi arsitekturnya dapat terlihat pada tahap paling awal dariginjalpenyakit yang mungkin mendasari/memperburuk perkembangannya. Pencitraan morfologi sel beresolusi tinggi menjadi alat yang penting dan berguna untuk mempelajari struktur seluler dan peran yang dimainkannya dalam fungsi sel dan perkembangan penyakit.4 Scanning electron microscopy (SEM) adalah metode yang banyak digunakan untuk melakukan studi semacam itu. Namun, hal ini memerlukan beberapa prosedur yang kompleks untuk persiapan sampel, sehingga tidak mungkin untuk menganalisis sampel hidup.5 Oleh karena itu, ada kebutuhan kritis untuk mengembangkan alat baru untuk mempelajari perubahan morfologi podosit dalam sampel hidup. Mode Hopping Probe dari Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) adalah teknik yang memungkinkan pencitraan nonoptik resolusi tinggi dari permukaan sel hidup dengan morfologi yang kompleks.6-8Keuntungan utama dari metode ini adalah resolusi spasial yang mendekati beberapa nanometer dan rentang Z (vertikal) yang panjang, yang dapat diterapkan pada sampel hidup dengan morfologi yang berbelit-belit dalam kondisi yang relevan secara fisiologis. SICM adalah teknik pencitraan multimodal yang dapat dikombinasikan dengan teknik mapan lainnya, analisis morfologi membran secara bersamaan dan dinamis, dan berbagai parameter fungsional, seperti volume sel, potensi membran, arus saluran ion tunggal, dan bahkan dinamika kompleks protein membran. dalam sel hidup.9-11 Berikut kami berikan contoh penerapan SICM untuk menganalisis morfologi manusia hidupglomerulusstruktur.

Gejala penyakit ginjal cistanche

2. BAHAN-BAHAN DAN METODE-METODE

Untuk percobaan, kami menggunakan bagian dari area kortikal dari transplantasi manusia yang dibuangginjaldibedah dan disimpan dalam larutan pengawet Wisconsin diikuti dengan inkubasi dalam larutan garam fisiologis teroksigenasi (PSS).12 Glomeruli ginjal diisolasi menggunakan teknik vibrodissociation seperti yang dijelaskan sebelumnya.13 Pendekatan ini memungkinkan isolasi cepat glomeruli ginjal yang diawetkan dengan baik dari manusiaginjal. Untuk melakukan pencitraan SICM, manusia yang baru diisolasiglomerulusditempelkan ke permukaan kaca poli-L-lisin yang ditempatkan ke dalam ruang sel yang diisi dengan larutan PSS. Sampel diposisikan secara manual dalam arah xy di bawah mikroskop optik terbalik Nikon TE2000-U (Instrumen Nikon). Untuk probe melompat, digunakan nanopipet kaca borosilikat pencitraan SICM dengan resistansi sekitar 100 MΩ, yang sesuai dengan perkiraan diameter ujung sekitar 120 nm. Nanopipet ditarik dengan penarik tipe api/coklat horizontal P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Nanopipet diisi dengan larutan PSS yang sama yang digunakan untuk rendaman dan diposisikan dalam arah-z dengan aktuator piezoelektrik. Arus ion yang mengalir melalui nanopipet diukur dengan penguat patch-clamp Axopatch 700B (Axon Instruments) dalam mode penjepit tegangan dan dipantau oleh pengontrol universal yang dimodifikasi khusus (ICAPPIC Ltd, UK), yang secara bersamaan mengontrol posisi sampel dan pipet. 6 Semua percobaan dilakukan pada suhu kamar (20-22 derajat ). Untuk pencitraan struktur berbelit-belit kompleks seperti proses kaki podosit diglomerulus, kami menggunakan mode backstep/hopping SICM yang paling cocok untuk pencitraan topografi sel hidup dengan resolusi tinggi.6,14 Langkah tunggal prinsip hopping terdiri dari peristiwa ketika arus referensi diukur dengan memposisikan nanopipet jauh di atas Sampel. Kemudian, nanopipet mendekati sepanjang sumbu z ke permukaan sampel hingga tingkat arus yang diukur turun ke titik setel preset yang sesuai dengan ~ 1,0 persen -1,2 persen dari arus referensi. Pada saat ini, pendekatan dihentikan, koordinat XYZ dari aktuator piezo XY dan Z dicatat sebagai koordinat permukaan sampel untuk titik pencitraan pertama, dan pipet ditarik menjauh dari permukaan. Prosedur ini kemudian diulang pada setiap titik pencitraan tunggal di sepanjang sumbu xy yang ditentukan oleh resolusi prasetel dan rentang area pemindaian. Untuk Gambar 1B, rentang pemindaian dan resolusi gambar adalah 30 m × 30 m dan 512 px × 512 px, dan untuk Gambar 1C masing-masing adalah 5 m × 5 m dan 480 px × 480 px. Data topografi SICM mentah dan pasca-pemrosesan gambar dilakukan menggunakan perangkat lunak analisis mikroskopi SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, UK).

GAMBAR 1 Aplikasi Pencitraan Scanning Ion Conductance Microscopy. A, Manusia yang baru diisolasiglomerulusmelekat pada permukaan kaca poli-Llisin. Ditampilkan di sebelah kiri adalah mikropipet mendekati permukaan glomerulus untuk melakukan pencitraan SICM. B, Contoh komponen penghalang filtrasi glomerulus, termasuk pembuluh darah tertutup podosit dan proses kaki, divisualisasikan oleh SICM. 45 menit untuk pemindaian area total (30 × 30 m, resolusi 512 × 512 piksel; sumbu z berubah 15 m). C, Pandangan yang diperluas tentang arsitektur proses kaki sekunder podosit manusia yang diungkapkan oleh SICM resolusi tinggi. 12 menit untuk pemindaian area total (resolusi 5 × 5 m, resolusi 480 × 480 piksel; sumbu z berubah 3 m). Bilah skala ditampilkan

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Kualitas gambar SICM sebanding dengan SEM dan memungkinkan pemeriksaan yang tepat dariglomerulusstruktur permukaan, termasuk pembuluh darah dan podosit, dan arsitektur proses kaki sekunder.4 Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menggunakan pencitraan SICM untuk memperkirakan perubahan struktural patologis pada proses kaki podosit pada tikus nefropati diabetik tipe 2 (T2DN).15 Kami melakukan analisis komparatif arsitektur tiga dimensi penghalang filtrasi podosit pada tikus non-diabetes dan T2DN. Data kami mengungkapkan hilangnya proses kaki podosit yang signifikan di glomeruli T2DN memberikan evaluasi yang akurat untuk perubahan histopatologis yang terjadi pada nefropati diabetik yang mendasari nefrinuria dan albuminuria pada tikus ini.15 Di sini, untuk pertama kalinya, kami menunjukkan pendekatan yang berhasil dalam menilai ketiganya. -struktur permukaan dimensional dari glomerulus manusia hidup yang baru saja diisolasi. Glomeruli ginjal manusia adalah struktur bulat dengan diameter sekitar 300 m16; dengan demikian, ujung pipet harus hati-hati mendekati bagian atas area yang diinginkan. Pengaturan SICM kami memiliki rentang pemindai sumbu z 25 m dan sumbu xy 30 × 30 m, yang memungkinkan kami memperoleh gambar resolusi tinggi dari sebagian besarglomeruluspermukaan. Waktu akuisisi sangat tergantung pada rentang pemindaian, resolusi, dan ukuran ujung elektroda lompat. Untuk pencitraan sel hidup dalam struktur kompleks seperti glomerulus yang baru diisolasi, waktu pemindaian bervariasi dari 10 hingga 50 menit per bingkai (lihat legenda Gambar untuk detail lebih lanjut). Efek kumulatif dari resolusi tinggi, area pemindaian yang besar, dan fluktuasi stokastik dalam sistem kehidupan dapat menghasilkan artefak pencitraan yang direpresentasikan sebagai pergeseran horizontal dan vertikal antara siklus reposisi pipet yang diharapkan. Perhatikan bahwa dalam geometri kompleks dengan perubahan mendadak di lokasi permukaan, waktu akuisisi dan artefak pencitraan, seperti piksel gelap atau buruk, dapat meningkat. Gambar topografi SICM (Gambar 1A) menggambarkan kapiler glomerulus yang ditutupi oleh proses kaki podosit primer dan sekunder yang terlihat jelas. SICM memungkinkan memperoleh gambar sampel dengan rentang pemindaian yang berbeda dalam skala nanometer, menjaga tingkat resolusi yang memadai.17 Gambar 1B mewakili arsitektur proses kaki sekunder podosit manusia yang diungkapkan oleh SICM resolusi tinggi. Analisis lebih lanjut dari gambar topografi tersebut dapat digunakan untuk mempelajari perubahan morfologi proses kaki podosit di bawah kondisi patologis dan dalam menanggapi berbagai aplikasi obat.

Penerapan teknik SICM untuk menyelidiki struktur permukaan tiga dimensi dari sampel jaringan lunak, termasuk:glomerulusdan sel podosit, awalnya diperkenalkan oleh Nakajima et al4. Penulis menggunakanginjalirisan untuk membandingkan teknik ini dengan SEM konvensional. Di sini, kami memperluas studi ini ke glomerulus manusia yang hidup. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami mengungkapkan potensi besar teknik SICM untuk pemeriksaan cepat dan andal dariglomeruluspenghalang filtrasi. Salah satu keuntungan besar SICM (selain penggunaan sampel hidup) adalah tidak memerlukan beberapa prosedur persiapan sampel yang biasanya diperlukan untuk pencitraan mikroskop EM, termasuk dehidrasi dan larutan fiksasi. Oleh karena itu, SICM memungkinkan menghindari penyusutan sampel yang diamati dengan EM, yang dapat menyebabkan dimensi aktual yang menyesatkan. Yang penting, SICM real-time pada glomeruli yang baru diisolasi juga memungkinkan pengujian dinamika gerakan proses kaki sebagai respons terhadap paparan akut terhadap obat-obatan yang diminati. Terakhir, pipet SICM dapat digunakan untuk melakukan perekaman patch-clamp dari arus saluran tunggal.18Untuk tujuan ini, setelah rekonstruksi peta topografi, perangkat lunak akuisisi (ICAPPIC Ltd, UK) memungkinkan rem terkontrol dari kaca SICM hopping probe pada permukaan chamber, menurunkan resistensi mikroelektroda terhadap kondisi patch-clamp (7 hingga 12 MΩ) dan membuatnya cocok untuk perekaman saluran tunggal dalam eksperimen yang sama. SICM memungkinkan pemilihan lokasi yang tepat dari elektroda patch-clamp pada permukaan sel berdasarkan data topografi dengan pendekatan vertikal yang terkontrol dengan baik dengan presisi nanometer, menghasilkan pembentukan kontak gigaseal dengan membran seluler yang disebut Smart Patch.19

Singkatnya, metode yang dijelaskan di sini memiliki potensi yang sangat baik untuk studi glomeruli dan segmen nefron yang baru diisolasi lainnya. Selain itu, ini menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk menggunakan manusiaginjalsampel tanpa persiapan yang rumit untuk mengevaluasi perubahan morfologi dalam studi patologi.

Cistanche untuk penyakit ginjal

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian di laboratorium penulis didanai oleh Department of Veteran Affairs I01 BX004024, National Heart, Lung, and Blood Institute R35 HL135749 dan P01 HL116264, National Institute of Diabetes and Digestive and Digestive andGinjalPenyakit R01 DK126720, dan Penghargaan Peningkatan Karir Penelitian Masyarakat Fisiologis Amerika.

KONFLIK KEPENTINGAN

Dr. Andrew Shevchuk adalah pemegang saham dan menerima biaya konsultasi dari ICAPPIC Ltd. Semua penulis lain menyatakan tidak ada kepentingan bersaing

KONTRIBUSI PENULIS

Ruslan Bohovyk: Konseptualisasi (sama); Kurasi data (lead); Analisis formal (memimpin); Tulisan-draf asli (sama); Penulisan-review & editing (sama). Mykhailo Fedoriuk: Kurasi data (mendukung); Analisis formal (mendukung); Penulisan-review & editing (sama). Elena Isaeva: Konseptualisasi (mendukung); Kurasi data (mendukung); Analisis formal (mendukung); Tulisan-draf asli (sup porting); Penulisan-review & editing (sama). Andrew Shevchuk:Konseptualisasi (mendukung); Perangkat Lunak (mendukung); Menulis draf asli (pendukung); Penulisan-review & editing (sama). Oleg Palygin: Konseptualisasi (sama); Analisis formal (mendukung); Metodologi (pendukung); Administrasi proyek (pendukung); Tulisan-draf asli (pendukung); Penulisan-review & editing (sama). Alexander Staruschenko: Konseptualisasi (memimpin); Administrasi proyek (memimpin); Sumber daya (memimpin); Pengawasan (memimpin); Tulisan-draf asli (sama); Penulisan-review & editing (sama).

PERNYATAAN KETERSEDIAAN DATA

Data yang mendukung temuan penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.