R-Phycoerythrin Dari Colaconema Formosanum (Rhodophyta), Bahan Pendukung Anti-Alergi Dan Kolagen Untuk Cosmeceuticals

Abstrak:Cistanche(cistanche), kompleks pigmen yang ditemukan dalam ganggang merah, diekstraksi dan dimurnikandari ganggang merah yang baru diidentifikasi,Colaconema formosanum, dan bioaktivitasnya diperiksa. Diaterungkap bahwapengobatan cistanche resulted in high cell viability (>70 persen ) ke garis sel mamaliaNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7, dan Hs68, dan tidak berpengaruh pada morfologi sel dalam sel NIH-3T3.Efek supresinya tidak signifikan terhadap produksi IL-6 dan TNF- distimulasi oleh lipopolisakaridasel RAW264.7. Namun, kalsium ionofor A23187-diinduksi pelepasan -hexosaminidasesecara efektif dihambat dengan cara yang bergantung pada dosis dalam sel RBL-2H3. Selain itu, terungkapagar tidak mengiritasi jaringan epidermis bionik. Khususnya, produksi prokolagen dipromosikan disel Hs68. Secara keseluruhan, data mengungkapkan hal itucistanchedimurnikan dariC.formosanummenunjukkan anti-alergi danbioaktivitas anti-penuaan tanpa toksisitas konsekuensial yang diamati pada beberapa lini sel mamaliaserta jaringan epidermis, menunjukkan bahwa makromolekul ini adalah bahan baru untuk potensipenggunaan kosmetik.

Kata kunci: kosmetik; Colaconema formosanum;Cistanche; anti alergi;anti penuaan

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Produk Cistanche Anti Penuaan Untuk Dijual

1. Perkenalan

Alga adalah organisme fotosintesis yang ditemukan di darat dan di lautan. Sebagai bagian dari produsen utama di lautan, alga menyediakan oksigen dan nutrisi bagi organisme lain, mengatur ekosistem laut. Makroalga (juga dikenal sebagai rumput laut) tumbuh di daerah pesisir dan tidak memiliki organ khas yang biasa ditemukan pada tumbuhan darat [1]. Makroalga dapat dibedakan berdasarkan pigmennya dan dikelompokkan menjadi tiga kelompok, yaitu Chlorophyta (alga hijau), Rhodophyta (alga merah), dan kelas Phaeophyceae (alga coklat) dari Ochrophyta [1]. Laju pertumbuhan makroalga cukup cepat, dan kondisi pertumbuhannya dapat dimanipulasi untuk mengontrol produksi senyawa bioaktif seperti protein, polifenol, dan pigmen.2]. Khususnya, karena perolehan pengetahuan tentang senyawa yang berasal dari rumput laut telah meningkat, penelitian dan pengembangan untuk menggunakan senyawa ini dalam aplikasi medis dan aditif makanan kemudian meningkat [3–6]. Selain itu, terdapat peningkatan preferensi bahan alami dibandingkan senyawa sintetik dalam kosmetik, karena bahan alami cenderung lebih aman dibandingkan bahan sintetis. Alga dilaporkan kaya akan zat bioaktif seperti asam lemak tak jenuh, polifenol, polisakarida, asam amino, dan pigmen.7,8]. Beberapa dari mereka mengandung kompleks pigmen yang dikenal sebagai phycobiliproteins, yang dapat dikategorikan ke dalamphycoerythrocyanin (PEC), phycocyanins (PC), phycoerythrin (PE), dan allophycocyanins (APC) [9]. PE, pigmen utama dalam rumput laut merah, dapat dikategorikan lebih lanjut menjadi C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE), dan Cistanche (cistanche) dan menurut spektrum serapannya, dan menurut kelompoknya organisme fotosintetik yang menghasilkannya: C untuk cyanobacteria, B untuk Bangiophyceae (Rhodophyta fifilamen primitif), dan R untuk Rhodophyta yang lebih kompleks [10]. Di antara pigmen ini, cistanche adalah phycobiliprotein paling melimpah di ganggang merah. cistanche adalah protein oligomer yang larut dalam air yang umumnya digunakan sebagai tag fluoresen dalam pemeriksaan sitometri, uji ELISA, dan mikroskop fluoresensi [11–14] serta fotosensitizer dalam terapi kanker [15]. Selain itu, PE telah ditunjukkan menunjukkan sifat biologis, termasuk anti-virus, peningkatan kekebalan, anti-oksidasi, anti-inflamasi, dan efek anti-tumor (silakan lihat makalah ulasan di [15] untuk mendapatkan lebih banyak informasi relatif), menjadikannya senyawa yang ideal untuk aplikasi dalam industri makanan dan biomedis, penelitian biologi molekuler, serta pewarna danaplikasi kosmetik [11,15,16].

Penuaanadalah salah satu masalah utama yang berkaitan dengan kulit, terutama bagi orang yang terpapar sinar matahari (atau sinar ultraviolet) dan udara yang tercemar dalam jangka waktu yang lama. Jadi, sebagian besar produk perawatan kulit berfokus untuk melindungi kulit dan memperlambat proses penuaan. Kulit adalah garis pertahanan pertama tubuh manusia, dan membantu mencegah akumulasi kerusakan akibat polusi, sinar matahari, dan stres oksidatif yang tidak dapat dihindari dalam kehidupan kita sehari-hari [17]. Dalam beberapa tahun terakhir, konsumen menjadi skeptis terhadap bahan kimia dalam produk kosmetik; oleh karena itu, ada peningkatan permintaan untuk produk ramah lingkungan yang diproduksi dengan menggunakan sumber daya alam [1]. Ekstrak alga, seperti yang dariArthrospiraDanChlorella vulgaris, telah dilaporkan bermanfaat dengan mengerahkan efek pengencangan pada kulit, mencegah pembentukan stria, dan meningkatkan sintesis kolagen [18]. Rupanya, senyawa bioaktif yang bertanggung jawab atas efek anti-penuaan ini antara lain meliputi polisakarida sulfat, senyawa fenolik, peptida, asam amino mirip mikosporin, dan pigmen.19,20]. Selain itu, zat bioaktif yang dimurnikan dari ekstrak alga diperiksa untuk bioaktivitas spesifik yang bermanfaat bagi kulit, dan zat tersebut terbukti secara ilmiah relatif aman, memungkinkan perumusan kosmetik menggunakan zat bioaktif yang dimurnikan daripada seluruh ekstrak.21]. Dengan demikian, cosmeceuticals yang mengandung ekstrak atau metabolit murni yang berasal dari alga sangat diminati [1]. Dalam studi sebelumnya, strategi budidaya yang layak secara teknologi dan ekonomi untuk produksi biomassa yang stabilColaconema formosanumberhasil didirikan oleh Lee dan Yeh pada tahun 2021 dengan mengisolasiColaconema formosanumdari selatan Taiwan menggunakan sistem indoor [22,23]. Sebagai ganggang parasit,C.formosanumpertama kali diisolasi dari makroalgaSarcodia suiaedi Taiwan selatan [23]. Dengan protein tinggi (30 persen berat kering) dan kandungan cistanche tinggi (5 mg g−1 dw) ditemukan untuk spesies ini [22], C.formosanummenunjukkan keuntungan industri yang sangat besar untuk ekstraksi cistanche, dan diharapkan membuat harga pasar cistanche lebih terjangkau. Selain itu, kelompok kami telah melaporkan metode untuk memurnikan cistanche yang diekstraksiC.formosanum[24]. Sepengetahuan kami, efek cistanche dariC.formosanumpada sel mamalia, serta potensinya sebagai biomaterial baru dalam industri kosmetik belum tereksplorasi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, berbagai analisis in vitro seperti sitotoksisitas sel, tes degranulasi, kemampuan anti-inflamasi, tes anti-alergi, dan tes sintesis prokolagen telah digunakan untuk memverifikasi hipotesis ini.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Ekstraksi Cistanche (cistanche) dari Colaconema Formosanum

Alga dikultur dalam inkubator (Tominaga, Kota Taipei, Taiwan) pada usia 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol foton m−2 s −1 (light-emitting diode, LED white light), dan 12:12 h light: dark photoperiod dalam beaker 5 L dengan 4L media air laut PES steril (30 psu) selama beberapa hari untuk mendapatkan sampel kerja. Selanjutnya, metode untuk mengekstrak cistancheC.formosanumdalam penelitian ini dimodifikasi dari metode yang dilaporkan oleh Lee et al. [24]. Pertama, phycobiliprotein diekstraksi dari ganggang segarC.formosanum(100 g berat basah) dalam 1 L garam buffer fosfat (PBS, pH 7,4) pada suhu 4◦C. Untuk mencegah degradasi phycobiliproteinselama percobaan, 5 mM NaN3 dan 4 mM EDTA ditambahkan ke PBS. Alga segardihomogenisasi menggunakan homogenizer FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 siklus, 4,0 m·s−1selama 5 detik;MP Biomedis, Solon, OH, AS). Ekstrak disaring kasar untuk menghilangkan kotoran, danfiltrat disentrifugasi pada 20,000 rpm menggunakan centrifuge barel (Beckman Coulter, Brea, California, USA). Supernatan merah, yang disebut ekstrak cistanche, dikumpulkan dandisimpan di 4◦C dalam gelap. Ekstrak cistanche kemudian mengalami fraksinasidengan (NH4)2JADI4 sebesar 20–60 persen (w/v) saturasi pada 4◦C. Padat amonium sulfat secara perlahanditambahkan dengan pengadukan lembut, dan larutan didiamkan selama 2 jam, diikuti dengan sentrifugasipada 10,000 rpm selama 20 menit pada 4◦C dan pembentukan endapan. Endapan larutdalam PBS (pH 7,4) dan didialisis semalaman dengan buffer yang sama. Dialisis berwarna merahsolusi diteruskan melalui 0.22-µm filter membran (Merck Millipore, Burlington, MA,AMERIKA SERIKAT).

2.2. Pemurnian cistanche dengan Kromatografi Penukar Ion Menggunakan Cairan Protein CepatKromatografi (FPLC)

Sampel cistanche yang dialisis menjadi sasaran kromatografi penukar ionkolom HiTrap DEAE FF yang dimuat (5 mL), yang telah diseimbangkan sebelumnya dengan 50 mM PBS (pH 7,4) yang mengandung 10 mM NaCl. Setelah sampel dilewatkan, kolom dicuci secara ekstensif menggunakan buffer kesetimbangan. Kromatografi penukar ion selanjutnya dilakukan pada laju elusi 5 mL/menit menggunakan elusi gradien linier mulai dari 0,0 hingga 500 mM NaCl. Fraksi merah yang terelusi dikumpulkan. Yang terelusifraksi dianalisis dengan spektrofotometri UV-Vis menggunakan tekanan medium NGCsistem kromatografi (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) pada panjang gelombang 280, 498, 566,dan 620 nm. Fraksi cistanche yang diperoleh dianalisis lebih lanjut menggunakan serapanspektrum dari 300 hingga 700 nm dan dilewatkan melalui 0.22-µm penyaring (Merck Millipore,Burlington, MA, AS).

2.3. Budaya sel

Sebagai garis sel makrofag murine, RAW264.7 dikultur dengan DMEM yang mengandung 4mM L-glutamin, 1,5 g/L natrium bikarbonat, dan 10 persen FBS.Semua garis sel dipertahankan secara konsisten dan disimpan dalam ruang lembab yang diatur37 derajat dengan 5 persen CO2, yang dipukul dua kali per minggu menggunakan prosedur standar.

2.4. Grading Morfologis dan Viabilitas Sel

Pengujian kadar logamNIH-3Sel T3 diunggulkan dalam 96-well plate (1× 104 sel per sumur, Corning, New York, NY, USA) dengan media kultur dan dibiarkan mengendap semalaman. Sel kemudian diperlakukan dengan media kultur yang mengandung {{0}} (kontrol negatif), 0.25, 0,5, 1, 2, 5, dan 10µg/mL ekstrak cistanche. Sumur berisi media yang dilengkapi dengan 10 persen DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) juga dimasukkan dalam uji coba sebagai kelompok kontrol positif. Setelah 24-jam inkubasi, penilaian morfologi untuk setiap kelompok dianalisis menggunakan definisi dari [25], dengan nilai 0, 1, 2, 3, dan 4 yang tidak mewakili, sedikit,reaktivitas ringan, sedang, dan berat. Media kultur diganti dengan reagen MTT 1 mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-jam setelah perawatan dan diinkubasi selama 3 jam. Isopropanol ditambahkan ke dalam sumur setelah penghilangan reagen MTT untuk melarutkan formazan, dan pelat dianalisis menggunakan spektrofotometer (Jasco Spectrophotometer V-630) pada panjang gelombang 570 nm [26]. Jika tingkat viabilitas sel untuk dosis ekstrak cistanche tertinggi kurang dari 70 persen kelompok kontrol, maka dianggap bersifat sitotoksik.25]. Persentase viabilitas sel dihitung menggunakan persamaan berikut:

Viabilitas sel (densitas optik, OD)=(OD sel terbuka/OD sel kontrol)× 100

2.5. Tes Anti-Peradangan

Untuk menentukananti inflamasikemampuan cistanche, interleukin-6 (IL-6) dan tumor necrosis factor-alpha (TNF ) terdeteksi dalam penelitian ini mengikuti protokol seperti yang dijelaskan dalam [27,28]. Sel RAW264.7 diunggulkan dalam 24-pelat sumur (5× 105 sel/sumur) (Corning, New York, NY, USA) dan dibiarkan mengendap semalaman pada suhu 37 derajat . Pada hari berikutnya, sel diperlakukan bersama dengan lipopolisakarida (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan peningkatan konsentrasi cistanche (0 (kontrol negatif), 1,25, 2,5, 5, 10, dan 20µg/mL). Secara bersamaan, kelompok sel tambahan yang diobati bersama dengan LPS dan p38 MAPK inhibitor SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ditetapkan sebagai kelompok kontrol positif. Setelah 24 jam, supernatan untuk setiap kelompok dikumpulkan untuk mendeteksi IL-6 dan TNF- yang dihasilkan . Sampel supernatan diaplikasikan pada Quantikine® Kit ELISA Sandwich Kolorimetrik (Sistem R&D, Minneapolis, MN, AS). Persentase penghambatan ( persen )=100× (sampel/kontrol). Selain itu, sel menjadi sasaran uji MTT untuk mengevaluasi viabilitas sel setelah perawatan.

2.6. Uji Degranulasi

Sebagai garis sel leukemia basofilik tikus, garis sel RBL-2H3 digunakan sebagai model untuk sel mast. Sel RBL-2H3 menunjukkan fenotipe sel mast mukosa dan diakui sebagai alat brilian untuk menyelidiki regulasi respons sel mast [29]. Dengan demikian, garis sel RBL-2H3 digunakan dalam pengujian ini untuk menyelidiki efek potensial cistanche pada degranulasi sel mast. -hexosaminidase digunakan sebagai penanda untuk memantau degranulasi sel mast.30]. Itu Metode deteksi -hexosaminidase telah dimodifikasi dari referensi [31]. Sel RBL-2H3 diunggulkan pada 1× 105 sel per sumur di 24-pelat kultur sel sumur (Corning, New York, NY, USA). Sel pertama kali diobati dengan 1µM calcium ionophore A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) diikuti dengan penambahan dosis cistanche yang berbeda (0 (kontrol negatif), 1.25, 2.5, 5, 10, dan 20µg/mL) dan diinkubasi selama 2 jam. Secara bersamaan, sel-sel yang diinkubasi dengan 100µM quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) digunakan sebagai kontrol positif. Metodologi yang digunakan untuk kuantifikasi -hexosaminidase diperoleh dari studi yang diterbitkan sebelumnya [32,33]. Setelah pengobatan, supernatan (30µL) dari setiap sumur dikumpulkan dan dipindahkan ke plat sumur 96-baru sebelum penambahan 50µL dari 4-nitrofenil N-asetil- -D-glukosaminida (NP-GlcNAc, 1,3 mg/mL dalam buffer sitrat (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Pelat dibiarkan tetap pada suhu 37 derajat selama 1 jam, dan reaksi diakhiri dengan penambahan 80µL dari 0.5 M NaOH. Pelat kemudian dianalisis pembentukan p-nitrofenolat menggunakan spektrofotometer (Jasco, Halifax, NS, Canada) pada panjang gelombang 405 nm. Sel yang tersisa dari pelat kultur asli digunakan dalam uji MTT untuk memeriksa viabilitas sel setelah perawatan.

2.7. Tes Iritasi Kulit

Untuk memverifikasi bahwa aplikasi topikal tidak akan menyebabkan iritasi pada kulit, epiderjaringan mal digunakan untuk meniru skenario di mana cistanche diterapkan pada tingkat jaringan. Sebuahpenilaian iritasi epidermal adalah tes kunci untuk setiap perangkat medis atau produk kosmetik sehingga hanya produk yang dianggap aman untuk kulit yang akan diberikan kepada konsumen. Uji hewan tradisional telah dilaporkan tidak hanya menyebabkan rasa sakit dan ketidaknyamanan bagi hewan uji, tetapi jugapengujian semacam itu juga tidak selalu mewakili efek yang diamati pada manusia; dengan demikian, dianggap bahwa menggunakan jaringan bionik yang direkonstruksi menguntungkan karena mereka memiliki banyak tipe sel yang dikelilingi oleh lingkungan mikro lokal, mensimulasikan kulit manusia secara in vivo [34]. Efek cistanche pada iritasi kulit dievaluasi dengan menggunakan jaringan epidermis bionik EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik dan dengan eksperimen mengikuti metodologi yang dimodifikasi dari referensi [35–37]. Sisipan yang berisi sampel EpiDerm dimasukkan ke 6-pelat sumur (Corning, New York, NY, USA) yang berisi DMEM yang telah dihangatkan sebelumnya. Sejumlah 100µL DMEM yang mengandung {{0}} (kontrol negatif) atau 1 mg/mL purified cistanche (konsentrasi akhir 0,1 mg/mL) ditambahkan ke sisipan kultur sel di atas sampel EpiDerm. Jaringan yang dirawat dengan 5 persen sodium dodecyl sulfate (SDS) berfungsi sebagai kontrol positif. Setelah 1-jam inkubasi di lingkungan yang dilembabkan 37◦C, 5 persen CO2 inkubator, sisipan dilepas dan dicuci dua kali dengan PBS (pH 7,4), diikuti dengan penempatan ke dalam pelat sumur 24-yang berisi 300µL larutan MTT 1 mg/mL (dalam DMEM). Setelah 3-jam inkubasi, isopropanol diaplikasikan untuk melarutkan kristal formazan MTT. Supernatan dipindahkan ke pelat sumur 96-, dan sampel diukur pada OD 570 nm menggunakan spektrofotometri. Kelayakan relatif dihitung mengikuti persamaan yang dijelaskan dalam Bagian2.4. Bahan kimia dianggap mengiritasi ketika mereka menurunkan viabilitas sel hingga kurang dari 50 persen (Kategori 2), dan bahan kimia yang menghasilkan viabilitas sel lebih besar dari 50 persen dianggap non-iritasi (Tidak Ada Kategori) [37]. 

2.8. Sintesis Prokolagen

TesSel-sel Hs68 diinokulasi dalam 24-well plate (2× 105 sel/sumur) dan dibiarkan mengendap semalaman. Sel kemudian diperlakukan dengan media kultur yang mengandung {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5, dan 10µg/mL ekstrak cistanche. Kelompok kontrol positif diberi perlakuan dengan 100 ng/mL Transforming Growth Factor (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. Selanjutnya, 72-h pasca perawatan, supernatan dari setiap sampel dikumpulkan dan dilakukan deteksi prokolagen. Monoclonal anti-human procollagen Type IC Peptide (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japan). (MK101) digunakan sesuai dengan instruksi pabriknya untuk mendeteksi prokolagen. Selain itu, uji MTT dilakukan untuk mengevaluasi viabilitas sel setelah pengobatan.

2.9. Analisis statistik

Data dianalisis menggunakan IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Kami pertama-tama memasukkan data untuk setiap kelompok ke uji Kolmogorov-Smirnov untuk memverifikasi bahwa mereka terdistribusi secara normal ( > 0.05) [40]. Siswat-test digunakan untuk menganalisis viabilitas sel, IL-6, TNF- , penghambatan -hexosaminidase, jaringan epidermis, dan produksi prokolagen. Semua data disajikan sebagai sarana± standar deviasi (SD), dengan setiap percobaan dilakukan dalam rangkap lima. Ap-nilai < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.