Penanda Kualitas Herba Cistanches Berdasarkan Hubungan Efek Spektrum Antioksidan

Abstrak: Tujuan: Untuk menetapkan metode penelitian penanda kualitas (Q-marker) dariCistanches Herba(CH) berdasarkanhubungan efek spektrum antioksidan, memberikan dasar untuk studi zat farmakologis dan pengendalian kualitasnya. Metode: Kromatografi cair kinerja ultra tinggi (UPLC) digunakan untuk membuat profil sidik jari untuk 10 batch CH. Model kerusakan oksidatif sel dibuat menggunakan H2O2, dan kapasitas antioksidan CH ditentukan berdasarkan konsentrasi penghambatan setengah maksimal spesies oksigen reaktif, serta tingkatsuperoksidadismutaseDankatalasesebagaiindikator farmakologis. Hubungan efek spektrum dibangun melalui analisis komponen utama, analisis korelasi Pearson, dan analisis regresi kuadrat terkecil parsial. Itukomponen aktifmenjadi sasaranvalidasi farmakologis. 

Hasil:Profil sidik jari untuk CH dibuat menggunakan UPLC, mengidentifikasi 17 puncak umum. Berdasarkan analisis korelasi efek spektrum, sembilan komponen dipilih. Hasil validasi farmakologis menunjukkan bahwa asam geniposidat, 8-asam epiloganat,Echinacoside,akteosida, isoakteosida, Dantubulosida Amenunjukkan aktivitas antioksidan dengan cara yang bergantung pada konsentrasi.

Kesimpulan: Penelitian ini mengeksplorasi Q-marker untuk CH berdasarkan hubungan efek spektrum, memberikan informasi referensi untuk landasan bahan farmakologis dan peningkatan standar kualitasnya.

Kata kunci:Cistanches Herba; penanda Q;hubungan spektrum-efek; antioksidan

Cistanche deserticola adalah batang berdaging kering dengan daun bersisik dari Cistanche deserticola YCMa atau Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, tanaman milik keluarga Cistanche deserticola orbaceae. Sifatnya hangat, rasanya manis dan asin; ia kembali ke meridian ginjal dan usus besar; ia memiliki efek memberi nutrisi pada Yang ginjal, mengisi kembali esensi dan darah, melembabkan usus dan pencahar, dan merupakan obat penting untuk memperkuat ginjal dan mengisi kembali esensi [2-3]. Ginjal menyimpan esensi, dan esensi serta darah berasal dari sumber yang sama. Jika saripati dan darah kekurangan maka akan mempengaruhi aktivitas kehidupan tubuh manusia secara keseluruhan; sumsum penghasil sari disimpan di dalam tulang, dan otak adalah lautan sumsum. Jika saripati ginjal tidak mencukupi maka tulang akan kehilangan nutrisinya dan otak akan kekurangan sehingga mengakibatkan perubahan degeneratif tulang seperti tekstur kendur, gigi tanggal, hilang ingatan, demensia, dan penurunan fungsi kekebalan tubuh [4-6]. Cistanche deserticola mengandung glikosida feniletanoid, iridoid, lignan, dan komponen struktural lainnya, termasuk echinacoside, verbascoside, verbascoside, asam genipinat, dan 8-asam epistryanic. , tubulin A, dll. [7]. Pengendalian mutu Cistanche deserticola saat ini dalam "Farmakope Republik Rakyat Tiongkok" edisi 2020 hanya menetapkan kandungan echinacoside dan verbascoside, yang tidak dapat sepenuhnya mencerminkan karakteristik tindakan multi-komponen dan multi-target pengobatan tradisional Tiongkok. , yang tidak kondusif untuk pengendalian kualitas dan evaluasinya.

Untuk meningkatkan tingkat kendali mutu pengobatan tradisional Tiongkok dan mengoptimalkan evaluasi mutu pengobatan tradisional Tiongkok, Akademisi Liu Changxiao mengusulkan konsep baru penanda kualitas (Q-marker) pengobatan tradisional Tiongkok [8]. Diantaranya, "efektivitas" adalah elemen inti dalam "Lima Prinsip" Q-marker [9] dan juga merupakan inti dari evaluasi kualitas obat-obatan tradisional Tiongkok.

Mengingat status penelitian saat ini mengenai korelasi yang buruk antara standar kualitas dan kemanjuran obat, mengeksplorasi penanda Q obat-obatan tradisional Tiongkok dan menetapkan standar kualitas yang lebih ilmiah dan masuk akal merupakan hal yang sangat penting untuk meningkatkan kualitas obat-obatan tradisional Tiongkok. Hubungan spektrum-efek menghubungkan puncak kromatografi sidik jari pengobatan tradisional Tiongkok dengan data farmakodinamik spesifik untuk menemukan zat efektif pengobatan tradisional Tiongkok, sehingga mencerminkan kualitas yang melekat pada pengobatan tradisional Tiongkok [10]. Pembentukan model matematika efisiensi spektral dapat memperjelas QMarker pengobatan tradisional Tiongkok dari perspektif "pandangan holistik", memberikan lebih banyak referensi untuk pengendalian mutu pengobatan tradisional Tiongkok di kemudian hari, perumusan standar mutu, dan penyaringan bahan aktif. Penelitian ini menggunakan sidik jari yang dikombinasikan dengan laju setengah penghambatan spesies oksigen reaktif (ROS IC50), kandungan superoksida dismutase (SOD) dan katalase (CAT) untuk mempelajari hubungan efek spektrum pengobatan tradisional Tiongkok, dan menggunakan analisis komponen utama. (PCA) ), analisis korelasi Pearson (PCC) dan analisis regresi kuadrat terkecil parsial (PLS) untuk menganalisis secara komprehensif penanda Q Cistanche deserticola untuk memberikan dasar bagi pengendalian kualitasnya.

1 bahan

1.1 Sampel

Cistanche deserticola dipanen dari Kabupaten Yutian, Xinjiang, dan basis penanaman Praktik Pertanian yang Baik (GAP) Cistanche deserticola di Mongolia Dalam. Itu diidentifikasi oleh peneliti Zhang Tiejun dari Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. sebagai Cistanche tubulosa (Schenk) Wight dan Cistanche deserticola.

YC Ma, informasi detailnya ditunjukkan pada Tabel 1.

1.2 Uji obat

Echinaceaside (nomor batch: 111670-201907, kemurnian: 91,8%) dan verbascoside (nomor batch: 111530-201914, kemurnian: 95,2%) keduanya dibeli dari Institut Pengawasan Makanan dan Obat China; isorescoside (nomor batch: 61303-13 -7), salidroside (nomor batch: 10338-51-9), 8-asam epistrychnoic (nomor batch: 82509-41-9), asam genipinat (nomor batch: Z24A10X95926) , tuberose B (Nomor batch: 112516-04-08), 2-asetil eugenol glikosida (Nomor batch: 94492-24-7) dibeli dari Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., kemurniannya lebih besar dari atau sama dengan 98%; Cistanche glikosida A (Nomor batch: HARUS -20062806, kemurnian: 98,51%), floridin A (nomor batch: MUST19110102, kemurnian: 98,57%) dibeli dari Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; asetonitril dan asam format murni secara kromatografi dibeli dari Perusahaan Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Air Murni (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Perusahaan Solarbio Beijing); dimetil sulfoksida (DMSO, D2660-100ML, Perusahaan Sigma Amerika Serikat); Kit deteksi proliferasi sel solusi tunggal CellTiter 96® AQueous (G3580, Perusahaan Promega Amerika Serikat); Deteksi CAT Kit (S0051), kit deteksi aktivitas SOD (S0101M), dan kit deteksi ROS (S0033S) dibeli dari Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumen

Kromatografi cair kinerja ultra-tinggi PDA kelas H Waters (Waters Company, AS); Saldo elektronik Sartorius BT25S (Sartorius Company, Jerman); Centrifuge desktop berkecepatan tinggi H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpektrumMax M5

Pembaca pelat mikro (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41Mikroskop biologis XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 sel

Sel ginjal embrio manusia sel HEK 293 digunakan dalam percobaan ini dan dibeli dari bank sel Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok.

2 metode

2.1 Pembentukan peta sidik jari

2.1.1 Persiapan larutan uji: Timbang 2 g bahan obat Cistanche deserticola, tambahkan 10 kali jumlah air, panaskan dan refluks 3 kali, setiap kali 1 jam, sentrifugasi pada 1.0 ×105r·min-1 selama 15 menit (radius sentrifugal 300 mm), Gabungkan supernatan dan konsentrat untuk membuat larutan stok dengan konsentrasi massa 100 mg·mL-1, encerkan 10 kali, dan menyaringnya melalui membran filter mikropori 0,22 µm untuk memperolehnya.

2.1.2 Persiapan larutan referensi campuran

Ambil 8-asam epistrirrychnic, salidroside, echinaceaside, cistanche glikosida A, asam genipinat, verbascoside, anthocyanoside A, isorbascoside, dan 2'-asetil eugenol. Zat acuan glikosida dan angiosida B diukur dalam jumlah yang tepat dan ditimbang secara akurat. Tambahkan larutan metanol 50% untuk melarutkan dan siapkan larutan zat acuan campuran dengan konsentrasi massa 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kondisi kromatografi

Kolom ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); fase gerak adalah asetonitril (A) ~ 0.1% larutan asam format (B), program elusi gradien (0 ~ 6 menit, 5% ~ 8% A; 6~10 menit, 8%~15%A ; 10~13 menit, 15%~19%A, 13~20 menit, 19%~25%A); panjang gelombang deteksi adalah 237 nm; laju aliran adalah 0,4 mL·menit –1; suhu kolom adalah 40 derajat; volume injeksi adalah 3 μL.

2.1.4 Referensi pemilihan puncak

Dalam kromatogram cair kinerja ultra (UPLC) Cistanche deserticola, puncak dengan rasio luas puncak terbesar, waktu retensi sedang, dan pemisahan yang baik dipilih sebagai puncak referensi spektrum sidik jari. 2.1.5 Penyelidikan metodologi Uji presisi: Ambil sampel T1 dan siapkan larutan uji sesuai dengan metode di bawah 2.1.1. Suntikkan sampel sebanyak 6 kali terus menerus dan catat sidik jarinya. Hasilnya menunjukkan RSD luas puncak relatif masing-masing puncak adalah 0.10%~4.61%. , RSD waktu retensi relatif adalah 0,08%~1,32%, menunjukkan bahwa instrumen memiliki presisi yang baik.

Uji pengulangan: Ambil sampel T1 dan siapkan 6 sampel larutan uji secara paralel sesuai metode di bawah 2.1.1, dan suntikkan sampel secara terus menerus. Hasilnya menunjukkan bahwa RSD luas puncak relatif dari setiap puncak kromatografi adalah 1,35%~4,80%, dan waktu retensi relatif RSD adalah 0,10%~1,80%, yang memenuhi persyaratan sidik jari dan menunjukkan bahwa pengulangan instrumennya bagus.

Uji stabilitas: Ambil sampel T1 dan siapkan larutan uji sesuai dengan metode di bawah 2.1.1, suntikkan sampel untuk pengujian pada jam 0, 2, 4, 8, dan 12, dan catat sidik jarinya. RSD yang dihitung dari area puncak relatif setiap puncak kromatografi adalah 0,53%~4,82%, dan RSD waktu retensi relatif adalah 0,09%~2,17%, yang memenuhi persyaratan sidik jari dan menunjukkan bahwa produk uji stabil dalam waktu 12 jam.

2.2 Penelitian tentang efek antioksidan Cistanche deserticola

2.2.1 Pembuatan larutan induk Cistanche deserticola:Ambil larutan induk berdasarkan butir 2.1.1, saring dan sterilkan, lalu encerkan dengan media kultur hingga konsentrasi yang diperlukan sebelum digunakan.

2.2.2 Pengaruh Cistanche deserticola dan kontrol positif VE terhadap viabilitas sel HEK 293

Siapkan kelompok normal (suspensi sel), kelompok pemberian Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), kelompok VE (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), masing-masing Tetapkan 6 sumur duplikat pada setiap konsentrasi dan kultur selama 24 jam. Tambahkan 20 µL reagen larutan tunggal CellTiter 96® AQueous ke setiap sumur untuk mendeteksi viabilitas sel. Lanjutkan kultur selama 2 jam. Gunakan microplate reader untuk mendeteksi nilai absorbansi (OD) setiap sumur pada 490 nm. Hitung tingkat kelangsungan hidup sel sesuai dengan rumus (1). Tingkat kelangsungan hidup (%)=(kelompok eksperimen OD/kelompok kosong OD) × 100% (1)

2.2.3 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap ROS yang diinduksi H2O2 pada sel HEK 293

Sel dibagi menjadi kelompok normal (suspensi sel) dan kelompok pemberian Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola dan 60 µm·L–1 H2O2), dan dikultur selama 24 jam. Ikuti langkah-langkah kit deteksi ROS untuk pengoperasian selanjutnya, amati langsung pewarnaan sel melalui mikroskop, dan gunakan pembaca pelat mikro untuk mendeteksi intensitas fluoresensi setiap kelompok. Pengaturan parameter menggunakan panjang gelombang eksitasi 488 nm dan panjang gelombang emisi 525 nm. Percobaan diulang tiga kali.

2.2.4 Pengaruh Cistanche deserticola pada SOD sel HEK 293 yang diinduksi H2O2-

Bagilah sel menjadi kelompok normal (suspensi sel) dan kelompok model

(60 µm·L–1 H2O2), kelompok VE (60 µm·L–1 VE dan 60 µm·L–1 H2O2), kelompok pemberian Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola dan 60 µm·L–1 H2O2 ), kumpulkan sel setelah 24 jam kultur, tambahkan larutan preparasi sampel SOD untuk melisiskan sel, sentrifugasi pada suhu 4 derajat , 12000 r·min-1 selama 5 menit (radius sentrifugal 300 mm), ambil supernatannya sebagai sampel yang akan diuji, ikuti kit deteksi SOD. Ikuti langkah-langkah di bawah ini. Percobaan diulang tiga kali.

2.2.5 Pengaruh Cistanche deserticola pada CAT yang diinduksi H2O2-dalam sel HEK 293

Ikuti metode di bawah 2.2.4 dan pemberian kelompok, tambahkan larutan lisis, sentrifus pada suhu 4 derajat, 12000 r·min-1 selama 10 menit (radius sentrifus 300 mm), ambil supernatan, dan ikuti langkah-langkah di bawah ini Alat deteksi CAT. Operasi tindak lanjut. Percobaan diulang tiga kali.

2.2.6 Analisis statistik

Perangkat lunak SPSS 26.0 digunakan untuk analisis statistik. Masing-masing kelompok data diwakili oleh (±±(). Analisis varians satu arah dilakukan terhadap data yang sesuai dengan distribusi normal. Jika variansnya sama maka digunakan metode Beda Nyata Terkecil (Least-Significant Difference). Jika variansnya tidak rata, metode T3 Dunnett digunakan. GraphPad Prism 8 digunakan untuk membuat grafik, dan P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analisis korelasi spektrum-efek antioksidan Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Area puncak dari puncak umum 10 batch Cistanche deserticola yang telah membentuk sidik jari distandarisasi dengan nilai Z, dan dibuat menjadi matriks data orde 10 × 17, yang diimpor ke perangkat lunak SPSS 26.0 untuk PCA.

2.3.2 PCC Gunakan SPSS 26.0 untuk melakukan analisis bivariat untuk mempelajari hubungan efisiensi spektral antara sidik jari Cistanche deserticola dan antioksidan.

Pengujian signifikansi menggunakan uji dua sisi (T) dengan P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Impor hasil eksperimen luas puncak dan antioksidan terstandar Cistanche deserticola ke dalam perangkat lunak SIMCA-P 14.1, tetapkan luas puncak sebagai variabel X, dan tetapkan indeks farmakodinamik sebagai variabel Y untuk melakukan PLS.

2.4 Verifikasi aktivitas antioksidan penanda Q Cistanche deserticola

2.4.1 Pembuatan cairan induk bahan aktif

Timbang asam genipinat, 8-asam epistriksinat, echinaceaside, verbascoside, isorebascoside, dan anthocyanoside A secara akurat dalam jumlah yang sesuai, lalu tambahkan DMSO untuk melarutkannya ke dalam 10 mmol·L–1 untuk kontrol. solusi produk.

2.4.2 Pengaruh bahan aktif terhadap sitotoksisitas HEK 293

Setelah sel HEK 293 diinkubasi selama 24 jam, 100 µL larutan bahan aktif berdasarkan item 2.4.1 (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1) dari konsentrasi yang berbeda ditambahkan ke masing-masing sumur, dan stimulasi dilanjutkan. CellTiter 96® AReagen larutan tunggal ditambahkan ke sel 24 jam kemudian untuk mendeteksi viabilitas sel.

2.4.3 Efek antioksidan bahan aktif pada sel HEK 293 yang diinduksi H2O2-

Sel dikelompokkan sebagai berikut: kelompok normal, kelompok model, kelompok VE dikelompokkan seperti pada 2.2.4, kelompok eksperimen (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 bahan aktif dan 60 µm·L–1 H2O2), dikultur selama 24 jam. Tentukan kadar ROS intraseluler, kandungan enzim SOD dan CAT sesuai dengan metode masing-masing pada 2.2.3, 2.2.4 dan 2.2.5.

Layanan Pendukung Wecistanche

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko