Efek Protektif Rebusan Wenshen Shengjing Baru Pada Penurunan Sintesis Testosteron Dan Apoptosis Spermatogenik yang Diinduksi Siklosporin

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

XIAOYAN PAN , XIYAN WANG , XUENAN WANG , WANSHENG ZHANG4 , ZHANXUAN SUN1 , XUAN XUAN LIANG , XUE ZHANG , WENJUN LI dan ZHIXIN LI

Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki potensi efek perlindungan dari Rebusan Wenshen Shengjing baru (WSSJD baru; termasuk Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Deserticola Cistanche, Radix Astragali, Epimedium brevicornum, dan Angelica Sinensis) pada gangguan sintesis testosteron yang diinduksi siklosporin dan apoptosis spermatogenik pada tikus. Sebanyak 90 mencit Kunming jantan dewasa dibagi menjadi 6 kelompok berikut: Kontrol (tanpa intervensi), dimetilsulfoksida (DMSO; hanya menerima DMSO), siklosporin A (CSA), klomifen sitrat (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg /hari), WSSJD (CsA plus WSSJD, obat mentah 12 g/kg/hari) dan WSSJD baru (CsA plus WSSJD baru, obat mentah 12 g/kg/hari). Semua tikus dirawat selama 30 hari melalui gavage oral. Testis kemudian difiksasi dan diwarnai dengan hematoxylin & eosin untuk menilai perkembangan epitel seminiferus. Teknik imunohistokimia digunakan untuk mendeteksi ekspresi reseptor hormon luteinizing (LHR) dan pembelahan rantai samping P450 (P450scc) dalam sel Leydig testis. Selain itu, apoptosis sel spermatogenik di testis dideteksi menggunakan uji pelabelan nick‑end dUTP yang dimediasi deoxynucleotidyl transferase, dan flow cytometry digunakan untuk menganalisis tingkat kelangsungan hidup dan apoptosis awal sperma di epididimis. Dibandingkan dengan kelompok CsA dan CC, pemberian WSSJD baru secara signifikan meningkatkan kadar testosteron serum dan ekspresi LHR dan P450scc dalam sel Leydig testis (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">

Deserticola Cistanche

pengantar

Siklosporin A (CSA) adalah agen imunosupresif yang umum digunakan yang secara khusus menargetkan sel T dan menghambat sekresi interleukin-2, dan secara dramatis meningkatkan tingkat keberhasilan transplantasi hati, ginjal, dan kornea, serta tingkat kelangsungan hidup penerima (1-3). Namun, imunosupresi yang disebabkan oleh penggunaan CsA jangka panjang secara signifikan meningkatkan risiko penyakit kardiovaskular, infeksi, dan tumor ganas (4). Eid et al (5) melaporkan bahwa konsentrasi dan motilitas sperma berkorelasi negatif dengan konsentrasi serum CsA pada penerima transplantasi ginjal laki-laki, menunjukkan bahwa CsA dapat menyebabkan disfungsi sistem reproduksi pada penerima laki-laki. Selanjutnya, telah didokumentasikan bahwa CsA mungkin bertanggung jawab atas gangguan spermatogenesis dan kerusakan pada sistem reproduksi pria (6).

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa CsA menurunkan kadar testosteron serum dengan mempengaruhi biosintesis dan sekresi testosteron di testis. He et al (7) mengamati bahwa tikus yang diobati dengan 40 mg/kg/hari CsA menunjukkan tingkat hormon luteinizing (LH) yang lebih tinggi secara signifikan dan kadar testosteron yang lebih rendah secara signifikan dalam serum, yang menyebabkan gangguan perkembangan testis. Ali et al (8) melaporkan bahwa pengobatan dengan CsA menurunkan ekspresi reseptor LH (LHR) pada membran sel Leydig, yang kemudian menurunkan sintesis dan sekresi testosteron yang dimediasi LH dari sel Leydig. Studi lain oleh Seethalakshmi et al (9) melaporkan bahwa CsA menurunkan kadar testosteron dengan menghambat aktivitas 17 alfa-hidroksilase secara tidak kooperatif dan 17 -aktivitas hidroksisteroid dehidrogenase secara kompetitif selama biosintesis testosteron, dan situs utama untuk penghambatan CsA terganggu adenosin siklik. stimulasi monofosfat. Lebih lanjut, laporan ini menunjukkan bahwa penurunan sekresi testosteron yang disebabkan oleh CsA dalam sel Leydig secara langsung mempengaruhi perkembangan sistem reproduksi pria dan pemeliharaan kemampuan reproduksi. Seethalakshmi et al (10) menyuntikkan testosteron eksogen ke tikus yang diberi CsA untuk meningkatkan kadar testosteron endogen. Diamati bahwa peningkatan dosis testosteron eksogen secara signifikan memulihkan berat organ reproduksi, kadar serum hormon perangsang folikel (FSH), dan meningkatkan jumlah sel germinal, sehingga menunjukkan bahwa kerusakan spermatogenesis yang diinduksi CsA dapat sebagian dicegah oleh eksogen. pemberian testosteron (10). Namun, testosteron eksogen ditemukan tidak cukup dalam memperbaiki jaringan testis yang rusak, karena sekresi testosteron dan spermatogenesis masih dipengaruhi oleh CsA, dan tingkat apoptosis yang tinggi diamati pada sperma dan sel spermatogenik (10).

Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) terdiri dari 15 obat herbal, terutama Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Deserticola Cistanche, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum, dan Angelica Sinensis (11). WSSJD telah ditunjukkan untuk meringankan apoptosis spermatogenik yang diinduksi siklofosfamid (11). Untuk lebih meningkatkan efek terapeutik WSSJD, penelitian ini mengembangkan WSSJD baru berdasarkan mekanisme kerusakan jaringan testis yang diinduksi CsA dengan menyesuaikan dosis komponen WSSJD. Studi farmakologi modern telah menunjukkan bahwa beludru tanduk di WSSJD dapat berfungsi sebagai hormon seks (12); Radix Astragali dapat meningkatkan proliferasi dan suplai nutrisi sel Sertoli testis (13), dan Panax ginseng dapat menurunkan kadar hiperoksida testis dan menghambat apoptosis spermatogenik (14). Obat-obatan yang disebutkan di atas juga dapat meningkatkan fungsi ginjal dan meningkatkan perkembangan sel spermatogenik (12-14). Clomifene citrate (CC) telah terbukti memberikan efek terapeutik pada infertilitas pria dalam studi klinis sebelumnya (15,16). Selanjutnya, CC telah dikaitkan dengan peningkatan parameter testosteron dan semen, dan mekanisme perlindungan CC mungkin serupa dengan WSSJD (15,16). Selain itu, dalam sebuah penelitian oleh Wang et al (17), CC digunakan sebagai kontrol pengobatan untuk menyelidiki efek obat Cina Shengjing pada gangguan spermatogenesis pada tikus. Berdasarkan hal tersebut, CC digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian ini.

Dalam penelitian ini, mekanisme yang mendasari efek perlindungan WSSJD baru di jaringan testis diselidiki untuk menentukan kemanjuran terapi obat yang dimodifikasi. Menjelaskan mekanisme perlindungan dapat memberikan dasar untuk penggunaan WSSJD baru dalam memperbaiki kerusakan spermatogenik yang diinduksi CsA.

Efek dari Cistanche deserticola: Mencegahkerusakan spermatogenik

Bahan dan metode

Hewan. Sebanyak 90 tikus Kunming jantan (8-berusia seminggu; 35-40 g) disediakan oleh Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, China). Penelitian ini dilakukan dengan persetujuan dari Komite Etik Universitas Kedokteran Jilin (Changchun, Cina). Tikus ditempatkan pada 21±3˚C dan kelembaban relatif 55‑65 persen di bawah siklus gelap-terang 12 jam. Tikus diberi akses gratis ke diet tikus laboratorium standar dan air steril.

Persiapan WSSJD. 15 komponen pengobatan Cina dari WSSJD, termasuk Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Deserticola Cistanche, Radix Astragali, Epimedium brevicornum, dan Angelica Sinensis (11), dibeli dari Tongrentang (Beijing, Cina). Bahan-bahan ini direbus sesuai dengan metode tradisional ramuan obat Cina (18). Singkatnya, bahan ditimbang sesuai resep, dan total 250 ml air suling ditambahkan untuk merendam ramuan. Herba direndam selama 30 menit dan kemudian dipanaskan. Ramuan pertama direbus selama 10 menit dan kemudian panas dikurangi menjadi didihkan selama 20 menit. Setelah 30 menit pemanasan, cairan rebusan dipisahkan dari herba, yang selanjutnya didekokasi dengan 200 ml air suling pada 80˚C selama 30 menit. Proses ini diulangi dan volume akhir cairan rebusan disaring melalui 4-5 lapisan kain kasa. Cairan juga diperas dari herbal ke dalam rebusan disaring. Hasil rebusan kemudian dipanaskan pada suhu 80˚C dalam penangas air selama 6‑7 jam sampai konsentrasinya mencapai 2 g obat kasar/ml, dan hasil rebusan disimpan pada suhu 4˚C sebelum digunakan. WSSJD baru disiapkan berdasarkan formulasi WSSJD dengan sedikit penyesuaian pada dosis Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali, dan Epimedium brevicornum. Metode decocting sama dengan WSSJD. WSSJD baru terdiri dari: Panax ginseng, 6 g; Solarium cynomorium, 9 g; Radix Astragali, 12 gram; Epimedium brevicornum, 6 gram; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 gram;Deserticola Cistanche, 9 gram; Angelica Sinensis, 6 gram; Bibit Milkvetch Flatstem, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Rimpang Atractylodes kepala besar, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 gram; kayu manis cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, dan Fructus Foeniculi, 3 g.

Konsentrasi ekstrak obat kasar ditentukan sebagai berikut: Berat bahan mentah/volume akhir. Metode perhitungan ini banyak digunakan dalam studi pengobatan tradisional Tiongkok (19-21). Pemberian obat. Tikus secara acak dibagi menjadi 6 kelompok (15 ekor per kelompok) dan diberikan obat secara intragastrik. Kelompok-kelompok tersebut adalah sebagai berikut: Kontrol (salin normal); dimetilsulfoksida (DMSO); CSA; CC; WSSJD; dan WSSJD baru. Tikus dalam kelompok CsA, CC, WSSJD, dan WSSJD baru disuntik secara intraperitoneal (ip) dengan 15 mg/kg/hari CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, China) selama 30 hari, seperti yang dijelaskan sebelumnya (8 ). Tikus dalam kelompok kontrol dan DMSO menjalani injeksi ip harian dengan volume yang sama dari normal saline atau pelarut DMSO, selama 30-hari periode percobaan. Konsentrasi DMSO yang diencerkan dalam normal saline adalah 3,25 persen (v/v). Kelompok CC diberikan dengan 21,6 mg/kg/hari CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, China) seperti yang dijelaskan sebelumnya (13), yang juga diencerkan dalam 3,25 persen (v/v) DMSO (pH{{14} }.2). Tikus dalam kelompok WSSJD dan WSSJD baru masing-masing diberi 12 g obat mentah/kg/hari WSSJD dan WSSJD baru.Pengecatan hematoxylin dan eosin (H&E). Testis tikus dipanen dan segera difiksasi dalam 4 persen paraformaldehyde (pH=7.2) pada suhu kamar selama 24 jam, diikuti dengan dehidrasi etanol, perlakuan xilena untuk menghilangkan etanol, penanaman lilin, dan pemotongan. Bagian histologis (5 m) diperoleh dengan menggunakan mikrotom putar. Ini ditempelkan pada slide kaca untuk pewarnaan H&E. Potongan testis diamati menggunakan mikroskop histopatologi untuk mengevaluasi perkembangan tubulus seminiferus dan mendapatkan data histometrik. Perkembangan tubulus seminiferus dinilai menggunakan sistem penilaian Johnsen (22).

ELISA. Pada hari ke-30 pengobatan, mencit dibius dengan 10 persen chloral hydrate (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) pada 0,004 ml/g berat badan ip sebelum eutanasia dengan CO2. Darah batang diambil dan serum dipisahkan dan disimpan pada suhu -20C. Secara singkat, darah dikumpulkan ke dalam tabung 1,5‑ml dan disimpan pada suhu 4˚C semalaman. Tabung kemudian disentrifugasi pada 1.300 xg pada suhu 4˚C selama 6 menit dan serum dikumpulkan. Kit ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) digunakan untuk menentukan kandungan serum testosteron (kucing. no. EIA-2380) dan LH (kucing no. EIA-2385 ) sesuai dengan protokol pabrikan. Kerapatan optik (OD) ditentukan menggunakan pembaca pelat mikro Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), dan kadar testosteron dan LH ditentukan berdasarkan kurva standar.

Imunohistokimia. Jaringan testis difiksasi dalam formaldehida 4 persen pada suhu kamar selama 24 jam dan tertanam dalam parafin. Bagian parafin dipotong menjadi bagian 5 m dan kemudian di-dewax. Pengambilan antigen dicapai dengan menginkubasi bagian dalam 0.01 buffer sitrat M (pH=6.0) pada 95‑98˚C selama 5 menit. Bagian kemudian diblokir dengan albumin serum sapi 5 persen (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Jerman; A3675) pada suhu kamar selama 1 jam. Setelah pemblokiran, bagian diinkubasi dengan antibodi poliklonal kelinci terhadap LHR (cat. no. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) atau pembelahan rantai samping P450 (P450scc; cat. no. ab75497; Abcam, Cambridge, UK ; 1:200) pada suhu 4˚C semalaman dalam gelap. Metode streptavidin-biotin complex (SABC) digunakan untuk mendeteksi ekspresi LHR dan P450scc menggunakan kit SABC (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA), sesuai dengan protokol pabrikan. Untuk jaringan yang diisolasi dari tikus kontrol negatif, antibodi primer diganti dengan PBS. Sel Leydig dengan pewarnaan kuning atau coklat pada membran atau plasma dianggap sebagai sel LHR-positif. Lima slide diperoleh dari setiap sampel dan lima bidang di area jaringan Leydig dipilih secara acak dan dinilai di bawah mikroskop fluoresensi (pembesaran, x400). Rata-rata OD sel positif di area jaringan Leydig diperoleh dengan menggunakan perangkat lunak Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Ekspresi LHR dan P450scc sebanding dengan nilai OD, dengan nilai OD yang lebih tinggi mewakili ekspresi protein yang lebih tinggi.

Uji terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)‑mediated dUTP nick‑end labeling (TUNEL). Testis tikus dibedah, dibenamkan dalam lilin, dan dipotong. Bagian (tebal 5-µm) kemudian diwarnai menggunakan kit uji TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), sesuai dengan protokol pabrikan. Singkatnya, jaringan testis dari kontrol (salin normal), DMSO, CsA, CC, WSSJD, dan kelompok WSSJD baru diwarnai menggunakan pengenceran 1:100 antibodi digoksin berlabel biotin selama 30 menit pada 37˚C. Jaringan epitel interstisial tikus yang diwarnai (disediakan dalam kit) digunakan sebagai kontrol positif, dan sampel yang diinkubasi dengan PBS sebagai pengganti antibodi digoksin berlabel biotin digunakan sebagai kontrol negatif. Frekuensi sel TUNEL-positif yang menunjukkan pewarnaan nuklir hijau dievaluasi menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser. Sebanyak 10 bidang acak dinilai di bawah perbesaran tinggi (x400) dan sel-sel positif dihitung. Jumlah rata-rata sel positif per bidang dihitung.

Pewarnaan propidium iodide (PI) atau Annexin V‑fluorescein isothiocyanate (FITC) dan analisis flow cytometry. Cauda epididimis dipanen pada kurban berikut dan epidermis dipotong dengan pisau untuk melepaskan sperma dari epididimis ke dalam 2 ml PBS pada suhu 37˚C untuk mendapatkan suspensi epididimis. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 10 menit untuk memungkinkan sperma berenang keluar. Agregasi sperma dibuang dan sampel sperma yang tersisa diisolasi dan disuspensikan kembali dalam PBS untuk memberikan konsentrasi 106 sel/ml. Apoptosis sperma dianalisis menggunakan kit Deteksi Apoptosis Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China), sesuai dengan protokol pabrikan. Singkatnya, 1 ml suspensi sperma diwarnai dengan 10 l PI atau dengan 500 l binding buffer dan 5 l Annexin V-FITC dalam gelap selama 10 menit pada suhu kamar. Sel segera dianalisis dengan sitometri aliran Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) dan menggunakan Sistem TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Sel-sel pada tahap awal apoptosis diidentifikasi dengan pewarnaan Annexin V-positif dan sel-sel nekrotik diidentifikasi dengan pewarnaan PI-positif.

Analisis statistik. Analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) dan dinyatakan sebagai mean plus atau ± standar deviasi seperti yang ditunjukkan. Perbedaan antar kelompok dievaluasi signifikansinya menggunakan analisis varians satu arah yang diikuti dengan uji post hoc Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Deserticola Cistanche

Hasil

Efek WSSJD baru pada pengembangan tubulus seminiferus testis. Untuk menyelidiki efek perlindungan potensial dari WSSJD baru pada pengembangan tubulus seminiferus testis tikus, morfologi testis tikus yang diwarnai H&E dibandingkan di bawah mikroskop cahaya. Tubulus seminiferus tikus dari kelompok CsA dan CC menunjukkan penyusutan pinggiran tubulus, penurunan diameter tubulus dan pengurangan lapisan epitel seminiferus testis dibandingkan dengan kontrol. Selain itu, sel spermatogenik menunjukkan susunan yang tidak teratur, jumlah sel spermatogenik berkurang dan beberapa sperma matang terlihat di lumen (Gbr. 1). Pada tikus dari kelompok DMSO, WSSJD, dan WSSJD baru, lebih banyak lapisan epitel seminiferus testis terlihat dan pinggiran tubulus seminiferus terintegrasi tanpa penyusutan atau kolaps (Gbr. 1). Skor Johnsen tidak berbeda secara signifikan antara kelompok DMSO dan kelompok kontrol, atau antara kelompok CC dan DMSO. Namun, skor Johnsen menurun secara signifikan pada kelompok CsA dan kelompok WSSJD dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan skor pada kelompok WSSJD dan WSSJD baru meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok CC atau CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">

Efek WSSJD baru pada testosteron serum dan LH. Tingkat testosteron dan LH dalam serum kemudian diukur. Kadar testosteron dan LH serum tidak terpengaruh setelah pemberian DMSO. Sebaliknya, testosteron serum secara signifikan diturunkan, dan LH secara signifikan diregulasi pada tikus yang diobati dengan CsA, relatif terhadap kontrol (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">

Efek WSSJD baru pada ekspresi LHR dan P450scc. Ekspresi P450scc dan LHR dinilai dalam sel Leydig testis dengan imunohistokimia (Gbr. 3 dan 4). Pada kelompok kontrol, LHR diekspresikan pada membran luar sel Leydig antara tubulus seminiferus (Gbr. 3A), dan P450cc diekspresikan dalam sitoplasma sel Leydig testis (Gbr. 4A). Perlakuan DMSO tidak berpengaruh nyata terhadap ekspresi LHR dan P450scc. Sebaliknya, pengobatan CsA secara signifikan menurunkan ekspresi LHR dan P450scc dibandingkan dengan tikus kontrol (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">

Pengaruh WSSJD baru pada apoptosis sel spermatogenik. Apoptosis sel spermatogenik pada testis tikus dianalisis dengan uji TUNEL. Inti sel apoptosis terutama diamati pada spermatogonia dan spermatosit primer (Gbr. 5A). Spermatogonia lebih besar dari spermatosit dan terletak lebih dekat ke membran basal (23). Perlakuan DMSO tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah sel spermatogenik yang mengalami apoptosis pada testis. Sebaliknya, pengobatan dengan CsA secara signifikan meningkatkan jumlah sel spermatogenik apoptosis dibandingkan dengan kelompok kontrol dan DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">

Efek WSSJD baru pada kelangsungan hidup dan apoptosis awal sperma. Untuk memverifikasi efek perlindungan dari WSSJD baru terhadap apoptosis sperma yang diinduksi CsA, kelangsungan hidup dan apoptosis awal sperma di epididimis ditentukan. Sperma epididimis diwarnai dengan PI atau Annexin V dan dianalisis dengan flow cytometry (Gbr. 6 dan 7). Mengikuti hasil yang disebutkan di atas, pengobatan CsA secara signifikan mengurangi persentase sperma hidup dan secara signifikan meningkatkan persentase sperma apoptosis awal (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">

Diskusi

Sebelumnya telah didokumentasikan bahwa penggunaan jangka panjang CsA sebagai agen imunosupresif mempengaruhi kapasitas reproduksi (6). Xu (24) melaporkan bahwa morfologi dan vitalitas sperma pada pasien yang diobati dengan CsA secara signifikan lebih rendah daripada kelompok yang tidak diobati, seperti yang diamati pada sampel air mani dari 26 penerima transplantasi ginjal yang diobati dengan berbagai dosis CsA dan 12 sukarelawan sehat. Juga diamati bahwa tingkat deformitas kepala sperma secara signifikan lebih tinggi pada penerima yang diobati dengan CsA (24). Hasil ini menunjukkan bahwa CsA memiliki efek tergantung dosis pada parameter air mani. Oleh karena itu, penelitian diperlukan untuk mengidentifikasi agen farmakologis baru yang mampu mengurangi kerusakan testis yang diinduksi CsA dan meningkatkan kemampuan reproduksi pria setelah transplantasi organ.

Lingkungan mikro spesifik testis mendorong spermatogenesis, dan dengan demikian gangguan struktur dan fungsi testis dapat menyebabkan penghentian spermatogenik (25). Monteiro et al (26) merawat tikus Wistar dengan CsA dengan dosis 15 mg/kg per hari selama 56 hari, dan mengamati peningkatan proporsi volumetrik jaringan ikat dan penurunan proporsi volumetrik sel Leydig pada tikus yang diobati dengan CsA. Juga diamati bahwa CsA menyebabkan degenerasi epitel seminiferus, mengakibatkan vakuolisasi sel Sertoli, spermatid bulat dan memanjang abnormal, dan akumulasi sitoplasma residu pada batas epitel yang berdekatan dengan lumen (26). Dalam penelitian ini, tikus Kunming diobati dengan 15 mg / kg CsA setiap hari selama 30 hari, yang menyebabkan penyusutan dan penurunan diameter tubulus seminiferus, pengurangan lapisan epitel seminiferus, susunan sel seminiferus yang tidak teratur, penurunan kematangan sperma di lumen dan skor Johnsen menurun secara signifikan.

Selain itu, pengobatan dengan pengobatan CsA merusak struktur testis secara parah. Penelitian ini juga mengevaluasi efek perlindungan dari WSSJD baru, sebagai obat Cina baru, pada testis tikus yang diobati dengan CsA. Diamati bahwa lapisan epitel seminiferus testis dan susunan sel seminiferus dipulihkan setelah pengobatan dengan WSSJD baru. Selain itu, tikus dalam kelompok WSSJD baru menunjukkan tubulus seminiferus terintegrasi tanpa penyusutan atau keruntuhan dan memiliki skor Johnsen yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan CsA. Hasil ini menunjukkan bahwa WSSJD secara signifikan memperbaiki kerusakan testis yang diinduksi CsA, menunjukkan bahwa senyawa obat herbal ini mungkin merupakan pengobatan yang efektif dalam pencegahan kerusakan testis yang diinduksi CsA. Apakah perbaikan sel ini tergantung pada ceruk di dalam epitel juga merupakan pertanyaan penting, yang harus diselidiki dalam penelitian selanjutnya.

Sumbu hipotalamus-hipofisis-testis berperan penting dalam regulasi aktivitas genital (27). Perkembangan dan fungsi organ genital pria diatur oleh hormon dari hipotalamus dan kelenjar pituitari (28). Krueger et al (29) merawat tikus Sprague Dawley dengan 25 mg/kg/hari CsA atau 40 mg/kg/hari CsA selama 6 hari dan mengamati bahwa kadar serum LH dan FSH meningkat 2-4 kali lipat, sementara ekspresi P450scc menurun menjadi 30 persen pada kelompok kontrol. Selain itu, kadar testosteron serum secara signifikan menurun pada tikus yang diobati dengan CsA, mengakibatkan gangguan spermatogenesis (29). Dalam penelitian ini, ditunjukkan bahwa pengobatan CsA secara signifikan menurunkan ekspresi LHR dalam sel Leydig. Meskipun LH serum meningkat, penurunan ekspresi LHR mungkin telah mengganggu pemulihan biosintesis testosteron yang dimediasi LH dan menurunkan ekspresi P450scc, sebagai enzim pembatas laju biosintesis testosteron (30), sehingga mempengaruhi biosintesis testosteron oleh sel Leydig. Bahan baru dalam WSSJD baru, seperti tanduk pilose, menunjukkan efek yang mirip dengan hormon seks (12), yang dapat meningkatkan kadar testosteron serum dan menurunkan kadar LH serum, sehingga meningkatkan ekspresi LHR dan p450scc dalam sel Leydig. Khususnya, hasil saat ini menunjukkan bahwa WSSJD baru merangsang biosintesis dan sekresi testosteron dalam sel Leydig untuk mendorong spermatogenesis.

Stres oksidatif yang diinduksi CSA dan kerusakan testis menginduksi displasia sperma dan sel spermatogenik (31). Telah dilaporkan bahwa pengobatan CsA jangka panjang merusak sistem antioksidan pada jaringan testis hewan, yang menyebabkan penurunan kadar glutathione, glutathione peroksidase, dan tingkat hidrogen peroksida dan peningkatan kadar malonat dialdehida di testis (31). Oleh karena itu, tingkat spesies oksigen reaktif yang berlebihan di jaringan testis tidak dapat dihilangkan, yang menyebabkan peroksidasi lipid membran sperma, kerusakan DNA, dan penurunan vitalitas sperma. Dalam penelitian ini, diamati bahwa pengobatan CsA secara signifikan meningkatkan kerusakan DNA dan tingkat apoptosis sel spermatogenik di tubulus seminiferus. Tingkat kelangsungan hidup sperma di epididimis juga menurun, sedangkan persentase sperma apoptosis awal meningkat, menunjukkan bahwa aktivitas spermatogenik testis rusak secara signifikan. Türk et al (32) mendokumentasikan bahwa efek perlindungan asam ellagic pada kerusakan testis yang diinduksi CsA dikaitkan dengan stres oksidatif pada tikus jantan. WSSJD baru yang digunakan dalam penelitian ini mengandung berbagai komponen antioksidan, termasuk obat herbal Ginseng, yang sebelumnya telah terbukti secara signifikan menurunkan kadar hiperoksida di testis (14).

Dalam penelitian ini, efek WSSJD baru pada gangguan sintesis testosteron dan apoptosis spermatogenik yang diinduksi CsA diselidiki, dan diamati bahwa WSSJD baru secara signifikan menurunkan tingkat apoptosis sel spermatogenik dan sperma, dan dengan demikian memperbaiki kerusakan pada testis seminiferus. epitel. Morfologi tubulus seminiferus testis dan apoptosis sel spermatogenik dan sperma diselidiki menggunakan histokimia dan flow cytometry. Meskipun distribusi siklus sel dan produksi sperma harian tidak diselidiki, mereka akan menjadi fokus studi masa depan oleh kelompok kami.

WSSJD secara signifikan meningkatkan kadar testosteron di testis dan menurunkan apoptosis sel spermatogenik dan sperma, yang secara efektif memperbaiki kerusakan testis yang diinduksi CsA. Hasil ini menunjukkan bahwa WSSJD baru mungkin menjadi agen farmakologis yang berguna dalam pengobatan dan pencegahan kerusakan testis yang diinduksi CsA.

Cistanche deserticola seluruh roorts

Referensi

1. Pedersen M dan Seetharam A: Infeksi setelah transplantasi hati ortotopik. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.

2. Vora GK dan Ciolino JB: Reaksi allograft kornea terkait dengan peradangan nonokular. Digit J Oftalmol 20: 29-31, 2014.

3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P, dan Pistorio ML: Aspek psikopatologis transplantasi ginjal: Kemanjuran tim multidisiplin. Transplantasi Dunia J 4: 267-275, 2014.

4. El-Gowelli HM dan El-Mas MM: Modulasi sentral hipertensi yang diinduksi siklosporin. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.

5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA dan el-SaiedMA: Penilaian karakteristik gerakan sperma pada penerima transplantasi ginjal infertil menggunakan analisis terkomputerisasi. Int J Androl 19: 338-344, 1996.

6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F, dan Shalizar Jalali A: Atenuasi kerusakan sperma yang diinduksi siklosporin dan embriotoksisitas oleh ekstrak air buah crataegus monogyna. Sel J 15: 198-205, 2013.

7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G, dan Chen L: Efek jangka panjang dari konversi dari siklosporin ke rapamycin pada fungsi testis dan morfologi dalam model transplantasi tikus. Transplantasi Proc 45: 763-769, 2013.

8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM dan BelkahiaC: Model hewan toksisitas testis oleh siklosporin: Evaluasi dan perlindungan. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.

9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB dan Menon M: Mekanisme aksi siklosporin dalam penghambatan biosintesis testosteron oleh sel Leydig tikus in vitro. Transplantasi 53: 190-195, 1992.

10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA dan Menon M: Pemeliharaan kuantitatif spermatogenesis pada tikus yang diberi siklosporin dengan pemberian testosteron propionat eksogen. J Androl 11: 491-497, 1990.

11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY dan Li ZX: Efek 'Rebusan Wenshen Shengjing' pada apoptosis sel spermatogenik yang diinduksi siklofosfamid dan dimetilasi histone H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (Dalam bahasa Cina).

12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R dan Tian SJ: Ekstraksi hormon seks dari beludru tanduk dengan CO2 superkritis. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (Dalam bahasa Cina).

13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC dan Tang F: Efek Fructus Lycii dan Radix astragali pada fungsi sel Sertoli pada testis tikus. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (Dalam bahasa Cina).

14. Xu L, Liu XH, dan Zhang L: Pengaruh total ginsenosides pada NO, NOS, dan kapasitas antioksigen total pada testis tikus. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (Dalam bahasa Cina).

15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT dan Hotaling JM: Keamanan dan kemanjuran klomifen sitrat pada pria hiperandrogenik dan subfertil. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.

16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A dan Abdelrahman S: Kombinasi vitamin E dan klomifen sitrat dalam merawat pasien dengan oligo idiopatik sebagai azoospermia: Sebuah percobaan prospektif acak. Andrologi 3: 864-867, 2015.

17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH dan Zhang YX: Butiran Shengjing: Obat Cina yang Efektif untuk Gangguan Spermatogenik pada Tikus. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (Dalam bahasa Cina).

18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (Dalam bahasa Cina).

19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z dan LiD: Formula Yiqi dan Yangyin memperbaiki cedera pada sistem hematopoietik yang disebabkan oleh penyinaran total tubuh. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.

20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T dan Makino T: Pengaruh Shin'iseihaito pada reaksi alergi murine yang disebabkan oleh sensitisasi hidung. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.

21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB, dan Yang Y: Rebusan Mahuang-xixin-fuzi mengurangi infeksi virus influenza a pada tikus sindrom defisiensi ginjal-yang. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.

22. Johnsen SG: Penghitungan skor biopsi testis-metode untuk pendaftaran spermatogenesis pada testis manusia: nilai normal dan hasil pada 335 pria hipogonad. Hormon 1: 2-25, 1970.

23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD, dan Singer-Sam J: Persiapan spermatogonia, spermatosit, dan spermatid bulat untuk analisis ekspresi gen menggunakan penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.

24. Xu LG: Pengaruh siklosporin A pada parameter air mani pasien setelah transplantasi ginjal. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.

25. Pintus E, Ros-Santaella JL, dan Garde JJ: Di luar ukuran testis: Hubungan antara spermatogenesis dan sifat sperma pada mamalia pemuliaan musiman. PLoS One 10: e0139240, 2015.

26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL, dan Dolder H: Infus Heteropterys aphrodisiaca mengurangi efek kolateral siklosporin A pada testis. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.

27. Oseko F, ​​Catatan S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A, dan Imura H: Pengaruh hiperprolaktinemia kronis yang disebabkan oleh sulpiride pada sumbu hipotalamo-hipofisis-testis pada pria normal. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.

28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR, dan Romano MA: Paparan orang dewasa terhadap bisphenol A (BPA) pada tikus Wistar mengurangi kualitas sperma dengan gangguan dari sumbu hipotalamus-hipofisis-testis. Toksikologi 329: 1-9, 2015.

29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM, dan Maines MD: Depresi yang dimediasi siklosporin dari reseptor hormon luteinizing dan biosintesis heme pada testis tikus: Mekanisme yang mungkin untuk penurunan serum testosteron. Endokrinologi 129: 2647-2654, 1991.

30. Nolan CJ dan Payne AH: Genotipe pada lokus P450scc menentukan perbedaan jumlah protein P450scc dan produksi testosteron maksimal dalam sel Leydig tikus. Mol Endokrinol 4: 1459-1464, 1990.

31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A, dan Ceribaşi AO: Lycopene melindungi terhadap toksisitas testis yang diinduksi siklosporin A pada tikus. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A, dan Ateşşahin A: Redaman kerusakan testis dan spermatozoa yang diinduksi siklosporin A yang terkait dengan stres oksidatif oleh asam ellagic. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.