Efek Protektif Dan Mekanisme Procyanidins Pada Penyakit Parkinson In Vivo Dan In Vitro Part 1

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Abstrak:Penelitian ini mengkaji mekanisme molekuler procyanidins(PCs) terhadap neurotoksin 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin(MPTP) dan metabolitnya {{6 }}metil-4-fenilpiridinium (MPP plus ) menginduksi model penyakit Parkinson (PD). In vitro, sel PC12 diinkubasi dengan PC atau deprenil selama 24 jam dan kemudian diekspos ke 1,5 mM MPP plus selama 24 jam. In vivo, larva ikan zebra (regangan AB) 3 hari pasca pembuahan (pdf) diinkubasi dengan deprenil atau PC dalam 400 uM MPTP selama 4 hari. Dibandingkan dengan MPP*/MPTP saja, PC secara signifikan meningkatkan aktivitas antioksidan (misalnya, glutathione peroksidase (GSH-Px), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT)), dan penurunan tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) dan malondialdehid (MDA). ). Lebih lanjut, PC secara signifikan meningkatkan akumulasi Nrf2 nuklir dalam sel PC12 dan meningkatkan ekspresi NQO1, HO-1, GCLM, dan GCLC di kedua sel PC12 dan ikan zebra dibandingkan dengan MPP*/MPTP saja. Studi saat ini menunjukkan bahwa PC memiliki efek neuroprotektif, mengaktifkan jalur faktor-eritroid nuklir 2-terkait faktor 2 (Nrf2)/antioksidan response element (ARE), dan mengurangi kerusakan oksidatif pada model PD yang diinduksi MPP plus / MPTP.

Kata kunci:prosianidin; Penyakit Parkinson; sel PC12; ikan zebra; Jalur Nrf2/ARE

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

1. Perkenalan

Penyakit Parkinson (PD) adalah sindrom neurodegeneratif progresif yang disebabkan oleh tidak adanya neuron dopaminergik di substansia nigra. Manifestasi klinisnya meliputi keterbelakangan motorik, tremor, kekakuan dan ketidakstabilan postur [1-6]. Metode yang efektif untuk mencegah atau membalikkan degenerasi saraf pada pasien PD masih belum jelas. Oleh karena itu, penemuan dan pengembangan obat antiparkinson baru tetap menjadi prioritas utama dalam pencarian pengobatan PD.

Meskipun patogenesis PD masih belum jelas, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa stres oksidatif memainkan peran kunci dalam hilangnya neuron dopaminergik [7,8]. Dopamin dapat mengalami oksidasi yang dikatalisis oleh auto atau enzim untuk memimpin produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan molekul kuinon elektrofilik [9], kedua proses yang mungkin mendasari kerentanan neuron dopaminergik terhadap stres oksidatif dan elektrofilik[10-12 ]. Oleh karena itu, metode yang mungkin untuk pencegahan atau pengobatan PD mungkin dengan melengkapi pengobatan dengan antioksidan untuk menghilangkan ROS yang berlebihan. Memang, senyawa bioaktif alami menguntungkan karena sering kali aman bagi konsumen dan memiliki sangat sedikit (jika ada) efek samping [13]. Oleh karena itu, senyawa antioksidan dari sumber daya alam dapat membantu dalam pengobatan PD.

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan

Procyanidins (PCs) adalah senyawa fenolik alami dari flavonoid, termasuk oligomer monomer katekin dan epikatekin [14]. PCs adalah nutrisi alami dan antioksidan dengan efek antioksidan lebih kuat dari vitamin C dan E [15]. Jalur Nrf2/ARE adalah jalur antioksidan yang signifikan. Nrf2 dilepaskan dari Keap1 oleh ROS atau melalui reaksi elektrofilik. Setelah itu, senyawa tersebut kemudian berikatan dengan elemen respon antioksidan (ARE) di dalam nukleus dan memediasi ekspresi peroksiredoksin dan enzim detoksifikasi fase II (H2O-1, GCLC, GCLM, dan NQO-1), yang bertindak sebagai pemulung ROS dan melindungi sel dari kerusakan oksidatif [16].

Otak ikan zebra embrio mengandung beberapa kelompok neuron dopaminergik, noradrenergik, dan adrenergik di lokasi yang mirip dengan yang ditemukan di otak orang dewasa [17-19]. Pada 3 hari pasca fertilisasi (pdf), neuron dopaminergik diamati di diensefalon ventral, pretektum, lokus coeruleus, bulbus olfaktorius, dan retina [20]. Dibandingkan dengan model tikus percobaan, model ikan zebra dikaitkan dengan periode percobaan yang lebih pendek, biaya yang lebih rendah, dan pengurangan kompleksitas dalam manipulasi gen [21. Sel pheochromocytoma tikus (sel PC12) sangat mirip dengan neuron dalam morfologi, struktur, dan fungsi [22]. Mereka sangat konsisten dengan sel saraf kultur primer dan memiliki keunggulan kultur yang mudah dan stabil [23]. Sel PC12 telah banyak digunakan sebagai model untuk mempelajari sel saraf [24-26].

Neurotoksin 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) telah terbukti menyebabkan sindrom pada manusia yang menyerupai penyakit Parkinson. MPTP menyebabkan degenerasi selektif neuron dopaminergik di substansia nigra, dan pasien menunjukkan gejala termasuk tremor, imobilitas, dan gaya berjalan terseok-seok [27].MPTP dimetabolisme menjadi 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP) di glial sel di otak. Setelah dilepaskan dari glia, MPP plus diangkut ke neuron dopaminergik melalui transporter dopamin (DAT) [28] dan terakumulasi di mitokondria, di mana diyakini menyebabkan kematian sel dengan mengganggu enzim pernapasan dan menyebabkan kerusakan oksidatif [29,30] . Studi sebelumnya telah menemukan bahwa PC mencegah beberapa proses penuaan tikus betina [31] dan memiliki efek perlindungan tertentu pada saraf [32,33]. Namun, apakah PC dapat mencegah atau membalikkan degenerasi saraf pada PD dengan mengatur jalur Nrf2/ARE masih belum jelas. Penelitian ini menggunakan sel PC12 yang diobati dengan MPP [34,35] dan ikan zebra yang diobati dengan MPTP [36] untuk menilai efek perlindungan dan mekanisme potensial PC pada model PD.

2. Hasil

2.1.Efek PC pada MPP plus -Induced Cytotoxicity of PC12 Cells

Inkubasi sel PC12 hingga 1,5 mM MPP plus selama 24 jam menghasilkan viabilitas sel sebesar 58,88 persen (Gambar la). Pretreatment sel dengan PC melindungi sel PC12 dari MPP plus kerusakan yang diinduksi dengan meningkatkan viabilitas sel (Gambar 1b). Tidak ada perbedaan mencolok dalam tingkat kelangsungan hidup sel antara kelompok PC 4ug/mL dan kelompok 30 M deprenil (kelompok kontrol positif) (Gambar 1b).

2.2. PCs Mengurangi MPP plus -Induced Oxidative Stress dan Peningkatan Aktivitas Enzim Antioksidan

Tingkat ROS dan malondialdehid (MDA) menunjukkan tingkat keparahan kerusakan oksidatif. Mengekspos sel PC12 ke 1,5 mM MMP plus selama 24 jam meningkatkan level ROS dan MDA, yang dihambat oleh PC pada 4ug/mL (Gambar 2a-c). Untuk mengevaluasi lebih lanjut efek PC pada kemampuan antioksidan sel PC12 yang diobati dengan MPP plus, kami mengukur aktivitas glutathione peroxidase (GSH-Px), katalase (CAT), dan superoksida dismutase (SOD) dan mengamati bahwa MPP plus pengobatan menekan GSH-Px , CAT, dan aktivitas SOD. Namun, efek MPP plus ini diselamatkan oleh paparan PC pada 4 ug/mL Gambar 2d-f）.

2.3.Efek PC pada Jalur Nrf2/ARE di MPP plus Sel PC12 yang Diinduksi

Ekspresi faktor nuklir-eritroid 2-faktor terkait 2 (Nrf2) diregulasi, dan level Keap1 diturunkan regulasi setelah perawatan PC (Gambar 3a-c). PCs（4 ug/mL） memfasilitasi lokalisasi nuklir Nrf2 di bawah kondisi lesi MPP (Gambar 3d-f). Selain itu, data Western blot menunjukkan peningkatan regulasi yang nyata dalam ekspresi heme oxygenase 1(H2O-1), quinone oxidoreductase 1(NQO1), subunit katalitik glutamat-sistein ligase (GCLC) dan subunit pengubah ligase glutamat-sistein (GCLM). ) ekspresi setelah pengobatan PC(4 ug/mL), dibandingkan dengan paparan MPPt saja (Gambar 3g-k).

2.4.Nf2/ARE Signaling Terkait dengan Efek Neuroprotektif dan Antioksidan yang Dimediasi oleh PCS

Knockdown Nrf2 oleh siRNA secara efektif menghapus ekspresi Nrf2 (Gambar 4a,b). Memang, pengobatan Nrf2 siRNA membatalkan tindakan perlindungan PC terhadap MPP plus kerusakan oksidatif yang diobati, sebagaimana dibuktikan oleh berkurangnya viabilitas sel pada kelompok yang ditransfeksi Nrf2 siRNA (Gambar 4c). Selain itu, efek PC pada MDA dan SOD dibalikkan oleh knockdown Nrf2 dalam kondisi lesi MPP (Gambar 4d,e.

2.5.Pengaruh PC terhadap Motilitas Laroae Ikan Zebra pada Perlakuan MPTP

MPTP mengurangi total jarak berenang ikan zebra. Perlakuan PC (4,8 dan 16 ug/mL) menyelamatkan defisit lokomotif yang diinduksi MPTP dan meningkatkan jarak total yang ditempuh relatif terhadap kelompok MPTP (Gambar 5a,b). Selanjutnya, deprenyl tampaknya menawarkan perlindungan dari kerusakan akibat MPTP dan digunakan sebagai kontrol positif. Khususnya, PC 16 ug/mL） dan deprenil 40 M） saja tidak memengaruhi perilaku gerak larva ikan zebra normal.

2.6.Efek PC pada Cedera Neuron Dopaminergik yang Diinduksi MPTP pada Ikan Zebra

Embrio ikan zebra yang diinkubasi dengan MPTP menunjukkan penurunan densitas tirosin hidroksilase(TH) yang signifikan secara statistik (Gambar 6a,b). Namun demikian, pengobatan dengan 16 ug/mL PC secara signifikan membalikkan penurunan kepadatan sel THt（Gambar 6a,b）.

Figure 2. PCs reduced MPP+-induced oxidative stress and increased antioxidant enzyme activity. (a) ROSlevels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured by imageJsoftware;(c)MDA levels;(d) GSH-Px activity;(e)CAT activity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons:ns, p>0.05;*,p<><0.01;,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Figure 3. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPP+-induced PC12 cells. (a)Protein levels of Nrf2 and Keep-1, as determined by Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Keap1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(d) protein expression levels of nuclear Nrf2 and cytoplasmic Nrf2, as determined by Western blotting; (e) nuclear Nrf2/LaminB protein relative expression (ratio to control); (f) cytoplasmic Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(g) protein levels of HO-1, NQO1, GCLCand GCLM, as determined by Western blotting;(h)HO-1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(i) NQO1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(j) GCLC/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(k) GCLM/GAPDH protein relative expression (ratio to control). F and pvalues of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><0.01;the error="" bars="" are="">

Figure 4. Nrf2/ARE signaling is related to the neuroprotective and antioxidant effects mediated by PCs.(a) Knockout efficiency was detected by determination of Nrf2 protein expression using Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Cell viability;(d) MDA levels;(e) SODactivity. Find values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p >0.05;*,p<0.05;**,p><0.01;**,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Gambar 5. Pengaruh PC pada motilitas larva ikan zebra pada pengobatan MPTP. (a) Pola khas jejak renang larva ikan zebra di setiap kelompok; (b) Jarak total rata-rata larva ikan zebra di setiap kelompok. Nilai F dan p dari analisis varians satu arah disajikan di atas grafik. Hasil uji post hoc Tukey disajikan untuk perbandingan terpilih: **,p<0.001; the="" error="" bars="" are="">

Artikel ini diekstrak Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules