Pembelajaran Ketakutan Sebelumnya Memungkinkan Asimilasi Cepat Kenangan Ketakutan Baru Langsung Ke Jaringan Kortikal Bagian 3

Desain eksperimental

Reproduksibilitas data dinilai dengan ulangan yang berbeda (Tabel S1). Eksperimen inaktivasi CNQX pertama di Te2 (Gambar 1A-1C) dilakukan dalam jumlah ulangan yang lebih banyak karena ini adalah eksperimen pertama yang kami lakukan dan berfungsi untuk menguji hipotesis utama penelitian kami. Hewan secara apriori ditugaskan ke kelompok perilaku berbeda dengan berat badan seimbang. Hewan jantan dari induk yang sama ditugaskan secara acak ke setiap kelompok eksperimen. Kami pertama-tama membahas hipotesis utama penelitian kami, yaitu, inaktivasi kortikal mungkin berdampak berbeda pada konsolidasi memori ketakutan baru pada tikus yang naif secara eksperimental dan pada hewan yang telah mempelajari peristiwa ketakutan sebelumnya.

Hewan jantan memiliki ingatan yang sangat kuat karena naluri bertahan hidup dan keinginan untuk bereproduksi lebih kuat. Hewan yang bertahan hidup di alam liar perlu mengingat banyak informasi geografis, jenis makanan, jejak predator, dan lokasi anggota kelompok agar lebih beradaptasi dengan lingkungan dan melindungi kehidupan.

Misalnya, singa jantan perlu mengingat status seluruh wilayah, hubungan keanggotaan, dan lokasi pesaing untuk melindungi wilayah dan statusnya. Zebra jantan perlu mengingat lokasi sumber air dan makanan di padang rumput untuk bertahan hidup dan berkembang biak. Sebuah perusahaan soda pernah memasang iklan yang menunjukkan bahwa seekor beruang kutub jantan dapat mengingat seorang penyelam dan aroma uniknya sehingga ia dapat mengidentifikasinya saat mereka melihatnya lagi.

Oleh karena itu, hewan jantan perlu memiliki daya ingat yang kuat dalam hal menjaga wilayahnya, menyediakan makanan yang cukup, dan memperbanyak keturunan. Hal ini juga menjadikan mereka subjek penting dalam penelitian manusia, misalnya untuk mengeksplorasi penyakit seperti gangguan memori dan penyakit Alzheimer.

Di dunia manusia, kita juga bisa mengambil inspirasi dari ingatan hewan jantan. Paparan terus-menerus terhadap hal-hal baru, pembelajaran terus-menerus, dan pemikiran dapat meningkatkan daya ingat dan kemampuan beradaptasi kita, serta meningkatkan standar hidup dan efisiensi kerja kita. Oleh karena itu, marilah kita belajar dari hewan jantan, terus mengumpulkan ilmu dan pengalaman, memiliki naluri bertahan hidup dan keinginan berkembang biak yang kuat, serta menciptakan masa depan yang lebih baik. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat kita. Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche deserticola merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat daging cincang berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak dalam berbagai cara.

Klik tahu cara meningkatkan fungsi otak

Jika terdapat perbedaan statistik antara kelompok-kelompok ini, kami akhirnya melakukan kelompok kontrol tambahan melalui suntikan saline. Pendekatan serupa diterapkan pada percobaan optogenetik, di mana kelompok kontrol AAV dilakukan hanya setelah perbedaan statistik antara tikus naif dan tikus yang dilatih sebelumnya terdeteksi. Jadwal percobaan ini memungkinkan kami menghindari kelompok kontrol yang tidak perlu dan penggunaan hewan yang tidak perlu, yang merupakan isu utama dalam undang-undang Eropa dan Italia tentang eksperimen hewan (prinsip 3 R).

Prosedur perilaku

Semua percobaan dilakukan selama fase cahaya siang hari (08.00 hingga 16.00). Hewan diangkut secara tunggal dari fasilitas ke ruang percobaan dalam ember transparan kecil yang berbeda tergantung pada permintaan percobaan.

Pelatihan pendengaran: Sesi perilaku pertama. Hewan yang mengalami ketakutan pendengaran (CS1-CS2). Pada kelompok ini, tikus diambil secara hati-hati dari kandang rumahnya dan dibawa dari ruang kandang ke ruang kedap suara. Sesampainya di sana, hewan ditempatkan di dalam alat pengkondisian yang terdiri dari sangkar hitam persegi panjang (35 × 40 cm) yang dilengkapi dengan kisi-kisi batang baja tahan karat (diameter 1 cm, jarak 1,5 cm) yang dihubungkan ke pengaturan pengiriman kejutan.

Tikus dibiarkan tanpa gangguan selama 1 menit. Setelah waktu ini, 7 rangsangan terkondisi (CS) yang terdiri dari nada murni dengan frekuensi 15 kHz (masing-masing berdurasi 15 detik, 80 dB, interval uji coba 36 detik) diberikan. 1 detik terakhir dari setiap nada dipasangkan dengan US yang menyakitkan (0,5 mA, 1 detik). Di akhir sesi pengkondisian, tikus dibawa kembali ke kandang rumahnya.

Hewan yang hanya mengalami kejutan (shock-CS2). Dalam kelompok ini, tikus ditempatkan dengan cara yang sama di dalam alat pengkondisian yang sama. Segera setelah itu, setiap tikus dikenai 7-goncangan kaki (1 s, 0,5 mA) satu demi satu. Setelah stimulasi selesai, hewan dibawa kembali ke kandang asalnya. Ketetapan waktu dalam sangkar pengkondisian kurang dari 9 detik. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa prosedur ini memungkinkan untuk menghindari proses asosiatif antara rangsangan nyeri dan rangsangan sensorik [29,30].

Hewan yang dikondisikan oleh bau (odor-CS2). Dalam kelompok ini, tikus ditempatkan di dalam kandang hitam persegi panjang yang sama dengan yang digunakan pada kelompok eksperimen di atas dan dihubungkan ke pengaturan pengiriman kejutan. Tikus dibiarkan tidak diganggu selama 2 menit. Setelah waktu ini, 7 CS yang terdiri dari aroma vanila diberikan (masing-masing berdurasi 10 detik, interval percobaan 24 detik). 1 detik terakhir dari setiap bau dipasangkan dengan US yang menyakitkan (0,5 mA, 1 detik). Modul pengkondisian ditempatkan di dekat sumber ventilasi untuk menghindari persistensi rangsangan yang diberikan setelah diimbangi. Kandangnya dipastikan dengan kisi-kisi atas. Bau disajikan menggunakan olfaktometer pengenceran aliran. Udara bersih (1,5 L/menit) dialirkan ke katup solenoid, yang bila dioperasikan, mengalirkan udara ke dalam botol 15 ml yang berisi 10 ml bau vanila.

Hewan yang hanya memiliki nada (Tone-CS2). Tikus dalam kelompok ini ditempatkan di dalam kandang hitam yang sama dan disajikan dengan nada 15-kHz (7 rangsangan, durasi 15 detik, ITI 36 detik) yang disampaikan tanpa adanya AS.

Hewan yang sudah terpapar sebelumnya (Tone-CS1-CS2). Tikus ditempatkan di dalam kandang pengkondisian dan, 1 menit kemudian, mereka disajikan 20 kali dengan nada 15-kHz saja, dan 24 jam kemudian nada yang sama dipasangkan dengan AS menjadi CS1.

Hewan yang dikondisikan oleh kebisingan putih (WN-CS2). Pada kelompok ini, tikus ditempatkan di dalam kandang berbentuk persegi panjang berwarna hitam dan dibiarkan selama 1 menit tanpa gangguan. Setelah waktu ini, 7 CS yang terdiri dari WN (masing-masing berdurasi 15 detik, 75 dB, interval antar percobaan 36 detik) diberikan. 1 detik terakhir setiap nada dipasangkan dengan US yang menyakitkan (0,5 mA, 1 s). Di akhir sesi pengkondisian, tikus dibawa kembali ke kandang rumahnya.

Pembelajaran ketakutan pendengaran: Pelatihan perilaku kedua. Dua minggu setelah prosedur yang dijelaskan dalam paragraf di atas, hewan dilatih dalam tugas pengkondisian rasa takut pendengaran yang berbeda. Tikus dimasukkan ke dalam kotak pengupas standar, seperti pada pekerjaan kami sebelumnya [10], dan dibiarkan tanpa gangguan selama 2 menit. Setelah waktu ini, 7 CS yang terdiri dari nada murni dengan frekuensi 3 kHz (masing-masing berdurasi 8 detik, 80 dB, interval antar-percobaan 22 detik) dikirimkan. 1 detik terakhir dari setiap nada dipasangkan dengan US yang menyakitkan (0,5 mA, 1 detik). Di akhir sesi pengkondisian, tikus dibawa kembali ke kandang rumahnya.

Takut retensi memori. Retensi memori ketakutan pendengaran yang baru diperoleh ke CS2 (3 kHz) diuji 4 hari kemudian. Untuk eksperimen optogenetika, pengujian memori terkini dilakukan dengan pengiriman laser 24 jam setelah pembelajaran CS2-US dalam analogi dengan interval waktu di mana kami melakukan inaktivasi kortikal melalui pemberian CNQX (yaitu, 24 jam setelahnya pelatihan). Tikus terbiasa dengan peralatan yang berbeda dari yang digunakan untuk pengkondisian dan ditempatkan di ruangan yang berbeda untuk menghindari perilaku ketakutan yang terkondisi terhadap isyarat kontekstual [10,62].

Peralatan baru ini terdiri dari sangkar plastik transparan dengan sisi dicat hitam yang dibungkus dalam kotak peredam suara yang dilengkapi dengan kipas angin, yang menghilangkan udara berbau dari dalam selungkup dan menghasilkan kebisingan latar belakang sebesar 60 dB. Hewan diizinkan menjelajahi kandang selama 5 menit sehari selama sesi pembiasaan. Pada hari tes retensi memori rasa takut, setelah 2 menit eksplorasi bebas, kami mengirimkan 4 CS2 dengan frekuensi 3 kHz (8 detik—22 ITI) yang tidak diikuti oleh AS mana pun.

Jika diperlukan oleh permintaan eksperimental, tikus kemudian diuji untuk retensi memori rasa takut jarak jauh, yang diperoleh 2 minggu sebelum uji coba pengkondisian rasa takut pendengaran yang kedua. Untuk tujuan ini, 7 hari setelah tes retensi memori rasa takut pada nada 3-kHz, hewan ditempatkan dalam lingkungan baru (kandang bergaris hitam dan putih) dan kemudian disajikan dengan nada 15-kHz. Empat nada disajikan dengan interval 36 detik.

Pelatihan kontekstual: Sesi perilaku pertama. Kelompok pengondisian rasa takut kontekstual (CtxA-CtxB). Pada kelompok ini, tikus diambil secara hati-hati dari kandang rumahnya, dimasukkan ke dalam ember, dan dibawa dari ruang kandang ke ruang kedap suara. Sesampainya di sana, hewan-hewan ditempatkan di dalam peralatan pengondisian yang terdiri dari sangkar hitam persegi panjang yang disebutkan di atas, dilengkapi dengan kisi-kisi batang baja tahan karat yang dihubungkan ke pengaturan pengiriman kejutan. Tikus dibiarkan tanpa gangguan selama 1 menit. Setelah waktu ini, 5 US (0,5 mA, 1 detik) diberikan dengan interval waktu 51 detik. Di akhir sesi, hewan-hewan tersebut dibawa kembali ke kandangnya masing-masing.

Grup khusus kejutan (shock-CtxB). Tikus, setelah ditempatkan di dalam peralatan pengkondisian, segera menerima 5-goncangan kaki (1 s, 0.5 mA) satu demi satu. Ketetapan waktu dalam sangkar pengkondisian kurang dari 7 detik. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa prosedur ini memungkinkan untuk menghindari proses asosiatif antara rangsangan nyeri dan rangsangan sensorik [29,30].

Grup khusus kejutan (shock-CtxB). Tikus, setelah ditempatkan di dalam peralatan pengkondisian, segera menerima 5-goncangan kaki (1 s, 0.5 mA) satu demi satu. Ketetapan waktu dalam sangkar pengkondisian kurang dari 7 detik. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa prosedur ini memungkinkan untuk menghindari proses asosiatif antara rangsangan nyeri dan rangsangan sensorik [29,30].

Pengkondisian rasa takut kontekstual baru dan retensi memori rasa takut baru-baru ini. Dua minggu setelah prosedur yang dijelaskan dalam paragraf di atas, semua kelompok dilatih untuk mengaitkan lingkungan kontekstual baru (modul kotak skinner, ditempatkan di ruangan berbeda) dengan US yang menyakitkan (00,5 mA, 1 s) . Setiap hewan ditempatkan di dalam ruangan baru dan dibiarkan tidak terganggu selama 2 menit. Kemudian, dipaparkan ke 5 US yang dipisahkan dengan interval 30 detik.

Retensi memori ketakutan kontekstual diuji 4 hari setelah prosedur pengondisian rasa takut dengan memasukkan kembali tikus ke dalam ruang kotak Skinner selama 3 menit. Untuk percobaan optogenetika, tes memori terkini dilakukan dengan pengiriman laser 24 jam setelah pembelajaran CtxB-US dalam analogi interval waktu di mana kami melakukan inaktivasi kortikal melalui pemberian CNQX (yaitu, 24 jam setelah pelatihan). Jika diperlukan oleh permintaan eksperimental, tikus kemudian diuji untuk retensi memori rasa takut yang jauh dengan menempatkan hewan dalam konteks yang dipasangkan ke AS 2 minggu sebelum asosiasi baru.

Hewan dibawa dalam 2 ember berbeda ke ruang pendingin sesuai dengan prosedur kontekstual yang berbeda.

Ukuran pembekuan. Dalam semua prosedur eksperimental, penilaian retensi memori rasa takut ditentukan sebagai respons pembekuan [10], dianalisis sebagai tidak adanya mobilitas somatik kecuali gerakan pernapasan. Untuk setiap hewan, jumlah waktu (dalam detik) yang dihabiskan dalam pembekuan diukur secara offline oleh 2 pengamat independen yang tidak mengetahui kelompok hewan tersebut.

Prosedur operasi

Untuk mengelola zat yang dipilih di lokasi target, tikus dibius dengan isofluran: Induksi dilakukan pada 4% [vol/vol] dalam 2 L/menit udara medis dan diperluas hingga paparan terus menerus pada 2% [vol/vol]) ketika tikus dipasang di alat stereotaxic.

Sayatan pada tengkorak dibuat, dan lubang duri kecil dibor untuk memungkinkan penetrasi jarum infus berukuran 28-. Jarum suntik 10-ul Hamilton yang dipasang pada pompa infus digunakan untuk mengalirkan zat. Setelah infus, jarum dibiarkan di tempatnya selama 3 menit lagi. Sayatan kemudian ditutup dengan klip luka stainless steel, dan hewan tersebut diberi suntikan ketoprofen analgesik/anti-inflamasi subkutan (2 mg/kg berat badan), dan hewan tetap hangat dan diawasi sampai pemulihan dari anestesi.

Seperti pada penelitian sebelumnya [10,32-34], kanulasi hewan tidak diperlukan, karena senyawa aktif diberikan secara langsung secara stereotoksik. Prosedur ini menguntungkan karena trauma bedah yang melekat pada prosedur kanulasi permanen dapat dihindari, sehingga membatasi trauma pada penetrasi jarum tunggal [10,32-34]. Memang benar, anestesi umum tidak secara signifikan mempengaruhi konsolidasi memori [10,32-34]. Untuk memastikan bahwa waktu pemberian senyawa yang terkait dengan uji coba pembelajaran akurat sehingga tikus menerima senyawa yang dipilih sekitar 1 jam dan sekitar 1 hari setelah pelatihan, anestesi isofluran diinduksi 5 menit sebelum waktu injeksi yang direncanakan, misalnya pada 55 menit. menit pada tikus yang diobati 60 menit setelah pelatihan dan 23 jam dan 55 menit pada hewan yang disuntik pada 24 jam setelah pelatihan. Masing-masing tikus dikondisikan dan kemudian dioperasikan secara terpisah. Hewan yang termasuk dalam kelompok perilaku berbeda dimanipulasi dengan cara disisipkan.

Penghambat selektif reseptor AMPA/kainate glutamat CNQX ({{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] dilarutkan dalam larutan garam steril (NaCl, 0.9%) dan diatur hingga pH 7,4 dengan HCl. Inhibitor sintesis protein anisomisin (Merck, 125 ug/ul) dilarutkan dalam HCl ekuimolar, diencerkan dengan garam steril, dan diatur hingga pH 7,4 dengan NaOH. Saline steril (0,9% NaCl) digunakan sebagai pengendali kendaraan. Zat-zat ini disuntikkan secara bilateral dengan kecepatan 0,1 ul/menit dan volume 0,5 ul per lokasi pada koordinat stereotoksik berikut yang diambil dari atlas Paxinos dan Watson [26], dengan bidang kortikal Te2 dirujuk ke atlas Zilles [25]:

Korteks pendengaran sekunder (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Korteks cingulate anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Volume injeksi (00,5 ul per situs) dipilih berdasarkan penelitian sebelumnya di mana senyawa aktif disuntikkan dalam Te2 [10,34] dan ACC [55,63] pada tikus dewasa.

Untuk menonaktifkan hipokampus dorsal, senyawa aktif disuntikkan pada volume 0,6 ul per lokasi pada koordinat stereotaxic berikut:

Hipokampus Punggung: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Lesi ireversibel pada hipokampus dorsal diinduksi dengan pemberian NMDA (Tocris, 18 ug/ul, dilarutkan dalam larutan garam steril, 0,4 ul per lokasi) dengan kecepatan 0.1 ul/ min di titik-titik pada koordinat tersebut di atas. Koordinat yang sama digunakan untuk kontrol yang disuntik garam dan hewan yang dioperasikan secara palsu.

Retrobeads Merah (Lumafluor, pengenceran 1:2 dalam larutan garam, 0.6 ul) disuntikkan dalam BLA sesuai dengan koordinat berikut: AP: −2.8; L: ±5,4; DV: −8.3.

Pada akhir percobaan, jejak jarum pada kasus suntikan CNQX, anisomisin, atau saline atau perluasan lesi pada kasus suntikan NMDA diverifikasi secara histologis. Tikus dibius secara mendalam dan diberi perfusi intrakardial dengan formaldehida 4%. Otak mereka dibelah pada ukuran 30 μm pada cryostat. Bagian serial yang diwarnai dengan Nissl disiapkan menggunakan prosedur konvensional dan bagian tersebut diverifikasi secara histologis di bawah mikroskop yang diperbesar pada 2,5×.

Eksperimen optogenetik

Suntikan virus. Virus terkait adeno AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry dan vektor kontrol AAV5:CaMKII -cherry diperoleh dari University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, Amerika Serikat). KalimatTiter virus adalah5:8 Titer virus adalah 5,8 × 10^12 vg/ml untuk kedua virus. Penggunaan promotor CaMKII memungkinkan ekspresi transgen yang mendukung neuron piramidal. Virus ditempatkan di freezer bersuhu −80˚C. Infus virus yang menargetkan Te2 atau ACC dilakukan pada koordinat stereotaxic di atas pada volume 0,5 ul untuk setiap lubang. Virus disuntikkan dengan kecepatan 0,1 ul/menit, dan jarum dibiarkan di tempatnya selama 5 menit lagi. Suntikan virus dilakukan 4 minggu sebelum percobaan optogenetika.

Penerangan.

Serat optik (Plexon, inti 200/230 μm; panjang 10 mm) ditanamkan secara bilateral di BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm dari bregma). Penghambatan optogenetik dari proyeksi Te2 ke BLA atau proyeksi ACC ke BLA diperoleh dengan menggunakan Sistem Stimulasi Optogenetik PlexBright yang digabungkan dengan dioda laser (Laserglow Technologies). Cahaya kuning (589 nm) dihasilkan dan dilewatkan melalui serat optik. Kepadatan daya diperkirakan pada ujung serat optik adalah 10 hingga 15 mW untuk penerangan lokasi proyeksi. Selama retensi memori rasa takut, emisi cahaya dimulai 4 detik sebelum timbulnya nada, bertahan sepanjang nada, dan dihentikan 4 detik setelah offset nada. Hewan yang termasuk dalam kelompok pengkondisi rasa takut kontekstual menerima stimulasi cahaya selama seluruh eksplorasi konteks (3 menit). Tikus dibiasakan dengan kabel patch selama 2 hari sebelum percobaan retensi memori.

Imunohistokimia. Setelah menyelesaikan percobaan optogenetika, tikus dibius secara mendalam dan diberi perfusi intrakardial dengan 4% PAF untuk memeriksa difusi virus. Otak dibedah, disimpan semalaman pada suhu 4˚C, dan terakhir dipindahkan ke sukrosa 30%. Bagian koronal (30 μm) dipotong pada cryostat dan dikumpulkan dalam PBS. Bagian yang mengambang bebas diinkubasi dalam larutan pemblokiran selama 1 jam di RT. Kemudian, mereka diinkubasi dalam antibodi tikus monoklonal primer anti mCherry (pengenceran 1:500, Abcam) dalam larutan pemblokiran semalaman di RT. Selanjutnya, bagian dicuci dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam di RT dengan antibodi anti-tikus fluoresen sekunder AlexaFluor-568 (1:600, Invitrogen) yang diencerkan dalam PBS. Bagian dicuci dalam PBS, dipasang dengan media pemasangan yang mengandung DAPI (Vektor), dan ditutup penutupnya.

Otak tikus yang menjalani suntikan NMDA juga dikumpulkan. Bagian yang mengambang bebas, setelah beberapa kali pembilasan, diinkubasi dengan antibodi anti-Neun tikus monoklonal primer (1:1,000 pengenceran, Merck) dalam larutan pemblokiran semalaman pada suhu kamar. Selanjutnya, bagian dicuci dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan antibodi anti-tikus kuda yang terbiotinilasi (pengenceran 1:200, Vektor). Kompleks avidin-biotin (kompleks ABC 1:100, Vektor, 2 jam setengah inkubasi) digabungkan dengan diaminobenzidine (0,03%, Merck) untuk menodai Neun. Bagian kemudian dibilas dalam PBS dan dipindahkan ke slide berlapis gelatin, didehidrasi, dan ditutup dengan kaca penutup.

Bagian Te2 dari tikus yang disuntikkan manik-manik retro menjalani inkubasi dengan antibodi anti-Fos kelinci poliklonal primer (1:2,000, Cell Signaling) dalam larutan pemblokiran semalaman di RT. Selanjutnya, irisan dicuci dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam di RT dengan anti-kelinci Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, dalam PBS). Akhirnya, bagian yang diberi imunolabel dicuci dalam PBS, dipasang pada slide yang dilapisi gelatin, dan ditutup dengan media pemasangan yang dilengkapi dengan DAPI.

Mikroskopi

Pelabelan mCherry diperiksa dengan menggunakan mikroskop confocal Zeiss Airyscan: Dua laser digunakan (405 dan 561 nm), masing-masing sesuai dengan spektrum emisi puncak untuk DAPI (pewarnaan Nissl untuk inti sel) dan Alexa 568 (mCherry ), masing-masing. Untuk menganalisis difusi virus di tempat suntikan, mikrograf Te2 dan ACC diperoleh sebagai gambar mosaik (masing-masing diperoleh dengan menggunakan objektif 10x). Terminal akson ke BLA dianalisis dengan menggunakan tujuan 40x sebagai tumpukan z 10 bagian, berjarak 1 μm (159 μm persegi; fraksi zoom, 1,0).

Untuk hewan yang disuntik retrobeads yang menjalani imunolabeling cFos, gambar diperoleh pada pembesaran 40× (159 μm persegi; fraksi zoom, 1.0) dengan 3 laser berbeda, sesuai dengan spektrum emisi puncak untuk DAPI (pewarnaan Nissl untuk inti sel), AlexaFluor 488 (cFos), dan Texas Red (Retrobeads), masing-masing. Bagian berukuran 0,7 μm diperoleh sepanjang tumpukan z 10-μm. Jumlah inti yang mengekspresikan cFos, berlabel manik-manik, dan positif ganda (berlabel manik-manik cFos+) dihitung untuk setiap hewan di wilayah Te2 pada koordinat anteroposterior dari 6,7 hingga 7,3 mm dari bregma [10]. Data kemudian dirata-ratakan untuk menghasilkan rata-rata setiap hewan dan hasilnya dibandingkan secara statistik. Gambar bagian dengan pewarnaan DAB Neun dianalisis menggunakan perangkat lunak Neurolucida yang terhubung ke mikroskop melalui kamera CCD berwarna [10].

Analisis data dan kriteria eksklusi

N untuk setiap kelompok ditetapkan secara apriori berdasarkan penelitian kami sebelumnya [10,16,17], karya yang diterbitkan sebelumnya di lapangan (lihat referensi untuk ACC [6,22,55] dan Te2 [10,59]), dan melalui estimasi G-power, sesuai tabel berikut (Tabel 1):

Untuk setiap analisis, kami memperkirakan jumlah rata-rata akhir 8 hingga 10 hewan untuk setiap kelompok. Kelompok dijalankan dengan kontrol internal dalam sesi eksperimen yang sama (Tabel S1). Mengingat variabilitas prosedur bedah dan perilaku, kami secara apriori memasukkan lebih banyak subjek eksperimen (hingga 15% lebih banyak) yang dalam beberapa kasus memenuhi kriteria eksperimental dan dimasukkan, sehingga menghindari pengecualian yang sewenang-wenang. Dalam kasus penelitian hipokampus, untuk menilai efek suntikan NMDA dan CNQX pada interval waktu yang berbeda, kami menyeimbangkan jumlah total hewan kontrol antara tikus yang dioperasikan dengan kendaraan dan tikus yang dioperasikan secara palsu di antara kelompok yang berbeda.

Analisis perilaku, inspeksi histologis, dan jumlah sel dilakukan secara membabi buta. Hewan dengan lokalisasi jalur jarum yang tidak memadai atau lesi dalam kasus lesi ireversibel NMDA dikeluarkan dari analisis data (Tabel S1). Dalam studi farmakologi, kami mengecualikan 57 hewan dari total 465 hewan karena penempatan jarum yang salah (22/255 untuk Te2, 31/179 untuk ACC, dan 4/31 untuk hipokampus). Dalam studi penelusuran, pada 21 hewan, kami mengeliminasi 3 subjek yang injeksi retrobeadsnya melewatkan BLA. Dalam studi optogenetika Te2, pada total 30 hewan, kami mengecualikan 1 tikus karena penempatan serat optik tidak di atas wilayah target, 1 tikus. Bagaimanapun, virus tidak ada di Te2, dan 2 tikus karena penyebaran virus masing-masing kurang dari 4,7% dan 5,3% dari area Te2 di tempat suntikan. Pada tikus yang dimasukkan dalam analisis statistik, difusi virus minimal adalah 39,6% pada koordinat stereotaxic lebih anterior dan 50,2% pada koordinat stereotaxic lebih posterior.

Demikian pula pada percobaan optogenetika ACC, pada total 32 hewan, 2 ekor tikus dieliminasi karena penempatan serat optik tidak di atas wilayah target. Dua tikus dikeluarkan karena tidak ada virus di ACC, 1 hewan karena virus berada di korteks motorik sekunder yang berdekatan, dan 1 tikus karena difusi virus kurang dari 2,3% area ACC di tempat suntikan. Pada tikus yang tersisa, difusi virus minimal adalah 33,3% pada koordinat stereotaxic lebih anterior dan 42,2% pada koordinat lebih posterior.

Dalam studi lesi NMDA, lesi sebagian besar menargetkan wilayah CA1 di hipokampus dorsal. Perluasan lesi hipokampus minimal (merah) dan maksimal (merah muda) pada seluruh area hipokampus dorsal masing-masing adalah 23,2% dan 53,5% pada koordinat stereotaxic lebih anterior dan 28,3% dan 62,3% pada koordinat lebih posterior. Dari total 73 hewan, 4 ekor tikus dieliminasi karena tidak ada lesi, sedangkan 3 hewan tambahan dibuang karena perluasan lesi kurang dari 5.0% (yaitu 4,8%, 4,3%, 3,1 %) mengenai area hipokampus pada 2 koordinat.

Analisis kontur area dilakukan melalui inspeksi visual dan kuantifikasi manual menggunakan alat kontur wilayah perangkat lunak ZEN 3.0. Nilai luas kemudian dinormalisasi pada total luas wilayah. Koordinat stereotoksik Te2, ACC, dan hipokampus didasarkan pada atlas Paxinos [26] dan, dalam kasus Te2, dengan bidang kortikal dirujuk ke atlas Zilles [25].

Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai mean ± SEM. Semua data lulus uji Levene untuk kesetaraan varians. Dengan demikian, statistik parametrik digunakan di seluruh percobaan. Data dari 2 kelompok dibandingkan menggunakan uji-t Student yang tidak berpasangan 2-berekor. Perbandingan beberapa kelompok dinilai menggunakan uji 1-way ANOVA dengan uji post hoc Tukey. Untuk mengatasi perbedaan antara dan di dalam kelompok, kami menghitung model ANOVA desain campuran 3 × 2 dengan grup (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) sebagai perantara- variabel subjek dan kondisi (sebelum dan sesudah pengondisian +injeksi terkini) sebagai variabel dalam subjek. Jika interaksi kelompok × kondisi signifikan, kami melakukan analisis efek utama sederhana dan kami menyesuaikan setiap nilai p dengan koreksi Bonferroni. Untuk setiap model ANOVA campuran, kami menilai asumsi Sphericity melalui Uji Sphericity Mauchly.

Parameter statistik (yaitu, nilai n yang tepat untuk setiap kelompok, SEM, uji statistik, ukuran efek, dan nilai p yang tepat) dilaporkan dalam legenda. Untuk ukuran sampel yang sama, ukuran efek untuk uji-t tidak berpasangan ditentukan dengan menghitung Cohen's d atau Glass's d sesuai dengan kesamaan SD, sedangkan untuk ukuran sampel yang berbeda, Hedges'g. Korelasi antara jumlah sel dan pembekuan dihitung menggunakan koefisien Pearson. Untuk menentukan apakah data memenuhi asumsi pendekatan statistik, kami menolak hipotesis nol pada tingkat P < 0,05. Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS Statistics 22 (IBM).

Informasi pendukung

S1 Gambar. Pembesaran jalur jarum Te2 (A) dan ACC korteks (B) yang disuntik dengan CNQX, dipilih sebagai contoh. (C) Ketika direpresentasikan dengan konteks yang sama 2 minggu setelah prosedur, hewan yang hanya menerima kejutan menunjukkan respons rasa takut yang rendah, menunjukkan bahwa prosedur tersebut tidak menimbulkan pembekuan terkondisi dalam konteks di mana kejutan diberikan. (D) Hasil serupa seperti pada Gambar 1 diperoleh dengan menyeimbangkan 2 nada yang digunakan sebagai CS (CS1, 3 kHz dan CS2, 15 kHz) (Uji t siswa, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass d=4.14). (E) Pada tikus yang dikondisikan bau-CS, pembekuan terhadap bau, 2 minggu setelah pengkondisian, tetap tinggi meskipun diuji di lingkungan yang berbeda sehubungan dengan konteks pengkondisian, sehingga menunjukkan bahwa rasa takut secara khusus dikaitkan dengan penyampaian isyarat ini. Bilah skala, 300 μm. ��P < 0,01. Semua data adalah mean dan SEM. Rangkuman data Gambar S1 dapat dilihat pada informasi pendukung pada file bernama Data Gambar Pendukung S1. (TIF)

Gambar S2. Injeksi CNQX mengganggu retensi ingatan ketakutan pendengaran baru-baru ini pada tikus di mana generalisasi ketakutan diturunkan dengan nada saja sebelum paparan atau dengan menggunakan nada white noise sebagai CS1. ANOVA desain campuran 3 × 2 (efek utama grup: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, efek utama dari kondisi: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grup × interaksi kondisi F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) menunjukkan bahwa pembekuan pada nada 3 kHz sebelum dikaitkan dengan AS lebih rendah pada hewan yang menerima pra-paparan nada 15 kHz sebelum pasangan 15 kHz-AS (n=10, p=0.001) atau pada tikus yang dikondisikan pada derau putih (n=13 , p=0.008) dibandingkan dengan hewan CS1-CS2 (n=22) yang menunjukkan respons generalisasi rasa takut yang bervariasi. Namun, setelah pembelajaran CS-US dan suntikan cnqx di korteks Te2, memori rasa takut baru-baru ini mengalami gangguan pada semua kelompok (p > 0,05). Efek utama sederhana dalam kelompok (sebelum dan sesudah pembelajaran CS-US diikuti dengan injeksi cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Nada-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Semua data adalah mean dan SEM. Ringkasan data Gambar S2 dapat ditemukan di Informasi pendukung dalam file bernama Data Gambar Pendukung S1. (TIF)

S3 Gambar. (A) Contoh acak injeksi retrobeads yang menargetkan BLA. (B dan C) Contoh penempatan serat optik di atas BLA hewan yang disuntik vektor AAV pada korteks Te2 (B) dan ACC (C). Bilah skala, 500 μm.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Dr. E. Manassero atas dukungan dan nasihatnya yang tiada henti.

Kontribusi Penulis

Konseptualisasi: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Kurasi data: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Analisis formal: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Akuisisi pendanaan: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Investigasi: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologi: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Pengawasan: Benedetto Sacchetti.

Validasi: Benedetto Sacchetti.

Penulisan – draf asli: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Penulisan – review & penyuntingan: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referensi
1. Frankland PW, Bontempi B. Organisasi kenangan terkini dan jauh. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Neurobiologi konsolidasi, atau, seberapa stabil engramnya? Annu Rev Psikol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Pengawal LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Konsolidasi memori. Biol Perspektif Cold Spring Harb. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Pengawal LR. Konsolidasi memori dan lobus temporal medial: model jaringan sederhana. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Mengapa ada sistem pembelajaran yang saling melengkapi di hipokampus dan neokorteks: wawasan dari keberhasilan dan kegagalan model pembelajaran dan memori koneksionis. Psikol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com