AKT yang Diaktifkan Prekondisi Mengontrol Toleransi Neuronal Terhadap Iskemia Melalui Jalur MDM2–p53Ⅱ

3. Diskusi

Hasil kami mengungkapkan bahwa aktivasi jalur pensinyalan PI3K / AKT yang dimediasi IPC memicu IT neuronal dengan mengendalikan kompleks MDM2-p53 di neuron kortikal primer. Kami pertama kali mengkonfirmasi efisiensi pengkondisian awal dalam hal perlindungan saraf [33,39-41] menggunakan model eksperimental IPC yang divalidasi.

Klik untuk efek samping cistanche tubulosa untuk Neuron

Kami menemukan bahwa IPC eksperimental yang diinduksi oleh kekurangan oksigen dan glukosa (OGD) singkat (20 menit) diikuti dengan reoksigenasi selama 2 jam menghasilkan perlindungan saraf, seperti yang ditunjukkan oleh pencegahan apoptosis neuronal dan aktivasi caspase-3 yang diinduksi oleh perpanjangan OGD (90 menit) diikuti dengan 4 jam reoksigenasi (OGD/R). Kami menunjukkan bahwa IPC mengurangi aktivasi caspase-3 pada neuron kortikal, yang berkorelasi dengan lebih sedikit apoptosis setelah serangan iskemik selanjutnya dan lebih parah.

Keseimbangan antara sinyal pro dan antiapoptosis sangat penting untuk memastikan kelangsungan hidup neuron setelah iskemia [3,33,38,42-44]. Meskipun relevansi kejadian tersebut telah ditunjukkan pada model stroke in vivo hemoragik dan iskemik [43,45], mekanisme yang mengatur jalur pensinyalan ini belum sepenuhnya dipahami dalam konteks toleransi iskemik. Peran AKT antiapoptosis dan jalur terkaitnya telah dipelajari secara ekstensif pada sel kanker [46,47] dan jaringan otak [38,48]; namun, sejauh ini, peran jalur pensinyalan AKT/MDM2-p53 dalam toleransi neuronal yang dimediasi IPC terhadap cedera iskemik tetap sulit dipahami.

Di sini, kami menemukan bahwa aktivasi jalur pensinyalan PI3K/AKT yang disebabkan oleh IPC mempromosikan fosforilasi MDM2 di Ser166, yang memicu translokasi nuklirnya dan stabilisasi protein, mencegah p53-apoptosis yang diinduksi melalui aktivasi caspase-3 setelah iskemia. Aktivasi AKT melalui fosforilasi mempromosikan kelangsungan hidup neuron [24,49] dan dapat berkontribusi pada induksi IT [25,50]. Hasil kami menunjukkan bahwa kelimpahan relatif protein AKT tidak berubah di bawah rangsangan iskemik atau prakondisi. Menariknya, kami menemukan bahwa fosforilasi awal AKT yang dimediasi PI3K di Ser473 mencegah stabilisasi p53 yang diinduksi iskemia pada neuron yang telah dikondisikan sebelumnya.

Efeknya bukan karena modifikasi level mRNA p53 [33,34,44] tetapi karena penurunan level protein p53 karena IPC sebelum OGD/R. Karena MDM2 adalah pengatur utama stabilisasi p53 dan juga merupakan target langsung AKT, hasil kami menunjukkan peran jalur pensinyalan AKT/MDM2-p53 dalam toleransi neuronal terhadap iskemia. MRNA MDM2 meningkat dengan cepat setelah OGD [34], tetapi aktivitas MDM2 terutama dikendalikan oleh modifikasi pasca-translasi, khususnya fosforilasi [51]. Dalam kesepakatan yang baik dengan ini, kami menemukan bahwa sekali diaktifkan oleh fosforilasi setelah IPC, AKT, pada gilirannya, memfosforilasi MDM2 pada residu Ser166, yang terletak di dekat sinyal lokalisasi nuklir [52], dan efek ini dipertahankan setelah cedera OGD/R.

Hasil kami menunjukkan bahwa fosforilasi MDM2 di Ser166 cukup untuk mengerahkan efek pelindung saraf yang dimediasi IPC melalui destabilisasi p53. Jadi, di sini, kami mengidentifikasi aktivasi jalur AKT / MDM2-p53 yang tergantung waktu setelah cedera iskemik dan, memang, kami menunjukkan bahwa AKT yang diaktifkan IPC memicu translokasi nuklir MDM2 ektopik, serta stabilisasi protein endogen.

Selain itu, AKT tetap aktif di dalam nukleus, di mana PI3K juga dapat bermigrasi sebagai respons terhadap stres oksidatif dan kemudian menyebabkan fosforilasi AKT [53]. Penghambatan fosforilasi AKT atau AKT knockdown yang dimediasi PI3K mempromosikan retensi protein MDM2 dalam sitoplasma, dan mencegah fosforilasi Ser166 dari MDM2, serta perlindungan saraf yang dimediasi IPC terhadap apoptosis neuron yang diinduksi iskemia. Sebaliknya, kami menunjukkan bahwa AKT aktif berikatan dengan protein MDM2 nuklir.

Akibatnya, AKT aktif mempromosikan fosforilasi MDM2 dan stabilisasi nuklirnya, yang berkontribusi pada perlindungan saraf yang dimediasi IPC. Hasil kami mengungkapkan bahwa perlindungan saraf yang dipromosikan IPC bergantung pada aktivasi AKT yang dimediasi PI3K, yang memfosforilasi MDM2 di Ser166, mempromosikan akumulasi nuklir MDM2 setelah penghinaan iskemik.

Dengan demikian, penghambatan PI3K / AKT oleh wortmannin atau penipisan AKT oleh siRNA menghapus perlindungan saraf yang dipromosikan IPC, yang mengarah ke stabilisasi p53 dan apoptosis neuron berikutnya setelah iskemia. Oleh karena itu, hasil kami membantu mengklarifikasi peran penting dari aktivasi jalur AKT-MDM2 yang bergantung pada IPC dalam kelangsungan hidup neuron terhadap cedera iskemik.

Protein p53 terlibat dalam kontrol kematian/kelangsungan hidup saraf yang menentukan prognosis pada pasien stroke [34,42,54], serta pada pasien TIA [3]. Stabilisasi P53 mengkompromikan perlindungan saraf yang dimediasi prakondisi terhadap cedera iskemia/reperfusi [33]. Oleh karena itu, interaksi MDM2-p53 akan menjadi penting untuk kelangsungan hidup neuron dalam konteks ini [34] dan untuk toleransi yang dimediasi IPC terhadap cedera iskemik [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G dalam promotor MDM2 menentukan ekspresi MDM2 dan, pada gilirannya, memodulasi pemulihan pasien yang menderita stroke [34].

Selain itu, kami mengamati bahwa gen SNP Tp53 (rs1042522) memodulasi stabilisasi p53 mitokondria dan toleransi neuronal terhadap iskemia sambil memprediksi pemulihan fungsional pasien yang menderita TIA sebelum stroke [3]. Oleh karena itu, kontrol jalur apoptosis p53 akan sangat penting untuk memastikan efek neuroprotektif dari IPC.

Hasil ini memberikan pendekatan translasi untuk penelitian yang dapat diimplementasikan di masa depan untuk kepentingan pasien, dan mereka mengajukan jalur pensinyalan PI3K/AKT–MDM2–p53 sebagai target penting untuk strategi TI yang dipromosikan prakondisi pada stroke iskemik. Singkatnya, kami menunjukkan bahwa jalur pensinyalan PI3K / AKT yang ditingkatkan oleh IPC mempromosikan fosforilasi MDM2 di Ser166, yang mengarah ke translokasi nuklir MDM2 dan stabilisasinya, yang memicu IT neuronal dengan mempromosikan destabilisasi p53 dan inaktivasi selanjutnya dari kematian apoptosis yang diinduksi setelah penghinaan iskemik.

Hasil kami menyoroti manfaat potensial dari aktivasi awal AKT dalam toleransi neuron yang dimediasi IPC, yang mengatur jalur apoptosis MDM2-p53 di bawah cedera iskemik. Temuan ini menyoroti peluang untuk memahami mekanisme yang mengatur jalur pensinyalan AKT-MDM2-p53 saraf untuk mengembangkan strategi pelindung saraf baru untuk gangguan terkait IT.

4. Bahan dan Metode

4.1. Kultur Primer Neuron Kortikal

Kultur neuron dibuat dari korteks embrio tikus (14.5E) C57Bl/6J atau p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory). Neuron diunggulkan pada 1,8 × 105 sel/cm2 dalam media Neurobasal yang dilengkapi dengan 2 persen B27 dan 2 mM glutamin (Invitrogen, Madrid, Spanyol) dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam atmosfer yang mengandung 5 persen CO2-yang dilembabkan [ 55].

4.2. Model Perampasan Glukosa Oksigen dan Prekondisi

Setelah 9–1{{10}} hari in vitro (DIV), neuron terpapar kekurangan oksigen dan glukosa (OGD) dengan menginkubasi sel pada suhu 37 ◦C selama 90 menit dalam inkubator dilengkapi dengan airlock dan terus digas dengan 95 persen N2/5 persen CO2. Media inkubasi (larutan buffer Hanks tanpa glukosa: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2, dan 20 mM HEPES, pH 7,4) sebelumnya digas dengan N2 95 persen /5 persen CO2 selama 30 menit. Di bawah kondisi ini, konsentrasi oksigen dalam media inkubasi adalah 6,7 ± 0,5 µM yang diukur dengan elektroda oksigen tipe Clark [56,57].

Ketika diindikasikan, neuron terpapar pada prakondisi iskemik (IPC; OGD pendek selama 20 menit diikuti dengan reoksigenasi 2 jam) sebelum iskemia berkepanjangan berikutnya (OGD, 90 menit) dan reoksigenasi 4 jam (IPC plus OGD / R) (Gambar S1B ). Secara paralel, neuron diinkubasi dalam normoksia (Nx) pada suhu 37 ◦C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 95 persen udara/5 persen CO2 atau prakondisi iskemik (IPC). Ketika ditunjukkan, neuron diinkubasi 30 menit sebelum IPC dalam larutan buffer Hanks (pH 7,4), dengan tidak adanya atau adanya wortmannin (100 nmol/L), seperti yang dijelaskan sebelumnya [19].

4.3. Transfeksi Sel

Sel Neuron (8 DIV) atau HEK-293T ditransfusikan dengan vektor plasmid yang mengekspresikan Mdm2 yang diberi tag YFP dari promotor manusia MDM2. MDM2p/Mdm2-YFP adalah hadiah dari Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plasmid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Bila diperlukan, vektor kosong (pYFP) digunakan sebagai kontrol dalam kondisi yang sama. Transfeksi plasmid dilakukan menggunakan Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), sesuai dengan instruksi pabriknya. Sel ditransfeksi dengan 1,5 µg/µL vektor plasmid dan digunakan setelah 24 jam.

Knockdown AKT pada 6 neuron DIV dicapai dengan transfeksi dengan ribonukleotida beruntai ganda (siRNA) kecil yang mengganggu. Urutan yang ditargetkan adalah sebagai berikut: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (mouse, s62216, sesuai dengan nukleotida 1006–1025, nomor aksesi GenBank NM_009652) [59]. Sebagai kontrol negatif, kami menggunakan Silencer™ Select Negative Control No.1 siRNA (siControl). Semua siRNA dibeli dari Ambion®, Invitrogen®, dan Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Jerman). Menurut tingkat knockdown protein, efisiensi transfeksi siRNA diperkirakan 70-80 persen pada 3 hari pasca transfeksi. Untuk percobaan pembungkaman, neuron ditransfeksi dengan siRNA (10 nM) menggunakan Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), mengikuti instruksi pabriknya. Neuron selanjutnya diinkubasi dalam media Neurobasal selama 72 jam sebelum digunakan.

4.4. Deteksi Sitometri Alur Kematian Sel Apoptosis

Neuron secara hati-hati dipisahkan dari pelat menggunakan garam tetrasodium EDTA 1 mM dalam PBS (pH 7,4) dan diwarnai dengan annexin V/APC dan 7-AAD, dilakukan persis seperti yang dijelaskan sebelumnya [55].

4.5. Pengujian Aktivitas Caspase-3

Aktivitas Caspase-3 dinilai dalam lisat sel [33] dan sesuai dengan instruksi pabrik menggunakan Kit Pengujian Fluorimetri CASP3F dari SIGMA dan membaca emisi pada panjang gelombang 405 nm. Metode ini didasarkan pada pelepasan bagian fluoresen 7-amino4-methyl coumarin (AMC). Konsentrasi AMC dihitung menggunakan standar AMC.

4.6. Uji Immunoblots dan Co-Immunoprecipitation

Neuron dilisiskan dalam buffer yang mengandung 1 persen SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4, dan 1 persen Triton X-100 (NP40: 1 persen NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM, dan 10 persen gliserol) dilengkapi dengan penghambat fosfatase (1 mM Na3VO4 dan 50 mM NaF) dan penghambat protease (100 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 50 µg/mL anti-papain, 50 µg/mL pepstatin, 50 µg/mL amastatin, 50 µg/mL leupeptin, 50 µg/mL bestatin, dan 50 µg/mL penghambat trypsin kedelai), disimpan dalam es selama 30 menit dan direbus selama 5 menit. Aliquot ekstrak lysed menjadi sasaran gel poliakrilamida SDS (MiniProtean®, Bio-Rad) dan dibasahi dengan antibodi semalaman pada suhu 4 ◦C. Antibodi yang digunakan adalah anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-cleaved caspase-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; juga mendeteksi YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Jerman), dan antiGAPDH (Ambion, Cambridge, UK) semalam pada suhu 4 ◦C. Setelah inkubasi dengan horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Pierce, Thermo Scientific) atau goat anti-mouse IgG (Bio-Rad), membran segera diinkubasi dengan chemiluminescence SuperSignal West Dura (Pierce) yang ditingkatkan selama 5 menit sebelum terpapar ke Kodak Film XAR-5 selama 1 hingga 5 menit dan autoradiogram dipindai. Intensitas pita dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak ImageJ 1.48v, seperti yang dijelaskan sebelumnya [60].

Untuk uji ko-imunopresipitasi, neuron dilisiskan dalam buffer dingin yang mengandung 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 persen NP-40) ​​yang dilengkapi dengan inhibitor fosfatase yang dijelaskan di atas. Setelah membersihkan puing-puing dengan sentrifugasi, lisat neuron (100 mg) diinkubasi dengan 1 mg antibodi selama 24 jam pada 4 ◦C diikuti dengan penambahan 10 mL protein A-agarose (GE Healthcare Life Sciences) selama 2 jam pada 4 ◦C. Immunoprecipitates dicuci secara ekstensif dengan buffer lisis dan diselesaikan dengan SDS-PAGE dan immunoblotted dengan antibodi yang ditunjukkan [61]. Kelimpahan protein relatif ditunjukkan pada Gambar S1. Bercak penuh dan pindaian gel disertakan dalam Gambar S3.

4.7. Imunositokimia dan Analisis Gambar

Neuron ditanam pada kaca penutup dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4 persen (b / v, dalam PBS) selama 30 menit dan diimunisasi dengan kelinci anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), mouse anti-MDM2 (2A10, ab-16895), mouse anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], mouse anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA), dan anti-GFP (1:1000; ab290; juga divalidasi untuk mendeteksi YFP). Immunolabeling terdeteksi menggunakan antibodi sekunder anti-kelinci IgG-Cy3 atau anti-mouse IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Inti diwarnai dengan 40,6-diamidino-2 phenylindole (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Coverlips dicuci, dipasang dalam reagen antifade cahaya SlowFade (Invitrogen) pada slide kaca, dan diperiksa menggunakan mikroskop (Nikon Inverted mikroskop Eclipse Ti-E, (NY, USA) yang dilengkapi dengan tujuan 40x, iluminator serat terpusat Nikon Intensilight C-HGFI, dan kamera digital perangkat charge-coupled hitam-putih Hamamatsu ORCAER atau mikroskop confocal laser pemindaian ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Jepang) dengan tiga laser 405, 491, dan 561 nm, dilengkapi dengan tujuan perendaman minyak 40×, 63×, dan 100× PL Apo untuk pencitraan beresolusi tinggi dan perangkat kamera digital Evolve Photometrics.

Semua pengaturan mikroskop diatur untuk mengumpulkan gambar fluoresen di bawah saturasi dan dijaga konstan untuk semua gambar yang diambil dalam percobaan. Gambar dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ 1.48v (National Institutes of Health). Persentase p (Ser473) AKT plus dan p53 plus neuron dan kuantifikasi intensitas fluoresensi protein maksimal p (Ser473) AKT dan p53 ditunjukkan pada Gambar S2A. Dalam MDM2-neuron yang ditransfusikan GFP, distribusi nukleositoplasma dari MDM2-GFP dihitung sebagai rasio fluoresensi rata-rata nuklir dengan fluoresensi rata-rata sitoplasma dari MDM2 endogen, diukur dalam 24 neuron (enam neuron per kondisi dalam empat budaya saraf yang berbeda) (Gambar S2B) [62].

Untuk mengukur intensitas fluoresensi nuklir maksimal pewarnaan MDM2 endogen dan pSer473AKT, 40 neuron (10 neuron per kondisi dalam empat kultur berbeda) diukur (Gambar S2C), seperti yang dijelaskan sebelumnya [44]. Dalam profil intensitas cross-sectional representatif yang ditunjukkan pada Gambar 5B, persentase p (Ser473) AKT dan MDM2 yang ditunjukkan di bawah setiap kondisi dikuantifikasi sebagai fluoresensi rata-rata nuklir. Dalam semua kasus, inti diidentifikasi dengan pewarnaan DAPI. Intensitas fluoresensi nuklir MDM2 maksimal dalam neuron yang diobati dengan wortmannin atau siAkt ditunjukkan pada Gambar S2D.

4.8. Analisis statistik

Hasil eksperimen dievaluasi dengan analisis varians satu arah, diikuti dengan uji post hoc Bonferroni, yang digunakan untuk membandingkan nilai antara beberapa kelompok. Hasilnya dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM. Student's t-test digunakan untuk perbandingan antara dua kelompok nilai. Dalam semua kasus, p < 0.05 dianggap signifikan (* p < 0,05 versus Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Bagaimana Cistanche melindungi neuron?

Ada beberapa bukti yang menunjukkan bahwa Cistanche dapat melindungi neuron dengan mengurangi apoptosis (kematian sel terprogram) dan meningkatkan kelangsungan hidup neuron. Apoptosis adalah proses alami yang terjadi di dalam tubuh untuk membuang sel-sel yang rusak atau tidak diinginkan, tetapi bisa berbahaya jika terjadi secara berlebihan atau tidak tepat. Cistanche telah ditemukan untuk menghambat apoptosis dalam penelitian laboratorium, dan efek ini dapat membantu melindungi neuron dari kerusakan.

Selain itu, Cistanche mengandung beberapa senyawa bioaktif yang telah terbukti memiliki efek neuroprotektif. Misalnya, mengandung echinacoside, yang telah terbukti melindungi neuron dari stres oksidatif dan peradangan. Ini juga mengandung acteoside, yang telah ditemukan memiliki sifat anti-inflamasi dan antioksidan.

Referensi

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Pengaruh keterlambatan pengobatan, usia, dan keparahan stroke pada efek trombolisis intravena dengan alteplase untuk stroke iskemik akut: Sebuah meta-analisis data pasien individu dari uji coba secara acak. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [Referensi Silang]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Serangan iskemik transien sebelumnya mungkin memiliki efek neuroprotektif pada pasien dengan stroke iskemik. Lengkungan. Kedokteran Sains. 2017, 5, 1057–1061. [Referensi Silang] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. Toleransi Iskemik Neuronal Dikondisikan oleh Polimorfisme Tp53 Arg72Pro. Terjemahan Pukulan Res. 2019, 10, 204–215. [Referensi Silang] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Sebaliknya, penelitian J. Stroke di persimpangan jalan: Menanyakan arah pada otak. Nat. Ilmu saraf. 2011, 14, 1363–1368. [Referensi Silang] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. Gamma reseptor yang diaktifkan proliferator peroksisom berpartisipasi dalam perolehan toleransi iskemik otak yang diinduksi oleh prakondisi iskemik melalui transporter glutamat glial 1 in vivo dan in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [Referensi Silang]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Memfokuskan Kembali Otak: Pendekatan Baru dalam Perlindungan Saraf terhadap Cedera Iskemik. Neurokimia. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Pengaruh prakondisi iskemik pada respons genomik terhadap iskemia serebral: Kesamaan dengan strategi pelindung saraf dalam keadaan hibernasi dan toleran hipoksia. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [Referensi Silang]

8. Gidday, JM Prakondisi otak dan toleransi iskemik. Nat. Pendeta Neurosci. 2006, 7, 437–448. [Referensi Silang] [PubMed]

9. Stetler, RA; Leak, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Preconditioning memberikan perlindungan saraf dalam model penyakit SSP: Paradigma dan signifikansi klinis. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [Referensi Silang] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarker untuk Prasyarat Iskemik: Menemukan Responden. Sdr. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [Referensi Silang]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Kedua, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulasi dari Cerebral Store-operated Calcium Entry-regulatory Factor (SARAF) dan Peripheral Orai1 Mengikuti Focal Cerebral Ischemia dan Preconditioning pada Tikus. Ilmu saraf 2020, 441, 8–21. [Referensi Silang]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Mekanisme Seluler Baru untuk Perlindungan Saraf pada Prekondisi Iskemik: Pandangan dari Organel Dalam. Depan. Neurol. 2015, 6, 115. [Referensi Silang]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Toleransi iskemik yang diinduksi prakondisi: Sebuah jendela menuju perlengkapan endogen untuk serebroproteksi. Exp. Terjemahan Obat Stroke. 2010, 2, 2. [Referensi Silang]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Tenang, CG; Sims, K.; Sopan, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Mekanisme Apoptosis setelah Iskemia Serebral. Pukulan 2009, 40, 788–794. [Referensi Silang]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide-3-Jalur Sinyal Kelangsungan Hidup Kinase/Akt Terlibat dalam Kelangsungan Hidup Neuronal Setelah Stroke. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [Referensi Silang]

16. Uzdensky, AB Regulasi apoptosis pada penumbra setelah stroke iskemik: Ekspresi protein pro dan antiapoptosis. Apoptosis 2019, 24, 687–702. [Referensi Silang] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt adalah target molekuler untuk terapi transduksi sinyal pada cedera iskemik otak. J. Pharmacol. Sains. 2003, 92, 317–327. [Referensi Silang] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Peran Akt (protein kinase B) dan protein kinase C pada cedera iskemia-reperfusi. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [Referensi Silang] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP Penghambatan PTEN oleh peroksinitrit mengaktifkan jalur pensinyalan neuroprotektif fosfoinositida-3-kinase/Akt. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [Referensi Silang]

20. Manning, BD; Toker, A. Pensinyalan AKT/PKB: Navigasi Jaringan. Sel 2017, 169, 381–405. [Referensi Silang] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Peran Khusus Bentuk Akt iso dalam Apoptosis dan Regulasi Pertumbuhan Akson dalam Neuron. PLoS SATU 2012, 7, e32715. [Referensi Silang]

22. Santi, SA; Lee, H. Isoform Akt hadir di lokasi subselular yang berbeda. Saya. J. Physiol. Fisik. 2010, 298, C580–C591. [Referensi Silang]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Awal pengkondisian iskemik membutuhkan aktivasi eNOS yang dimediasi oleh Akt dan PKA melalui fosforilasi serine1176. Kardiovaskular. Res. 2012, 97, 33–43. [Referensi Silang] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Sisir, M.; Liu, C.-L.; Martone, SAYA; Siesjo, BK; Hu, B.-R. Peristiwa yang Mempromosikan Kelangsungan Hidup dan Kematian setelah Iskemia Serebral Transien: Fosforilasi Akt, Pelepasan Sitokrom C, dan Aktivasi Protease Seperti Caspase. Sdr. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [Referensi Silang] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Prasyarat dalam perlindungan saraf: Dari hipoksia hingga iskemia. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [Referensi Silang] [PubMed]

26. Mayo, LD; Jalur Donner, DB A phosphatidylinositol 3-kinase/Akt mendorong translokasi Mdm2 dari sitoplasma ke nukleus. Proses Natl. Acad. Sains. AS 2001, 98, 11598–11603. [Referensi Silang]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforilasi HDM2 oleh Akt. Onkogen 2002, 21, 1955–1962. [Referensi Silang]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu menginduksi ubiquitination p53 melalui fosforilasi MDM2 yang dimediasi Akt. Nat. Bio Sel. 2001, 3, 973–982. [Referensi Silang]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Kompleks Livingston, DM p300/MDM2 Berpartisipasi dalam MDM2-Degradasi p53 yang Dimediasi. Mol. Sel 1998, 2, 405–415. [Referensi Silang]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Peraturan Diferensial Kelangsungan Hidup Kardiomiosit dan Hipertrofi oleh MDM2, E3 Ubiquitin Ligase. J.Biol. kimia 2006, 281, 3679–3689. [Referensi Silang]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Prekondisi iskemik melindungi dengan mengaktifkan kinase prosurvival pada reperfusi. Saya. J. Physiol. Sir. Fisik. 2005, 288, H971–H976. [Referensi Silang] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 down-regulation: Mekanisme molekuler baru yang terlibat dalam prakondisi iskemik. FEB Lett. 2003, 555, 302–306. [Referensi Silang]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. Jalur MDM2-p53 terlibat dalam toleransi neuron yang diinduksi prakondisi terhadap iskemia. Sains. Rep.2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G dalam Promotor MDM2 Menentukan Hasil Fungsional Setelah Stroke. Pukulan 2018, 49, 2437–2444. [Referensi Silang]

35. Feng, J.; Taman, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Identifikasi Ser Ser-473 Motif Hidrofobik PKB/Akt sebagai Protein Kinase yang bergantung pada DNA. J.Biol. kimia 2004, 279, 41189–41196. [Referensi Silang]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, Eksitotoksisitas YT dan stroke: Mengidentifikasi target baru untuk pelindung saraf. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [Referensi Silang] [PubMed]

37. Konstantino, LC; Pengikat, LB; Vandresen-Filho, S.; Biola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Peran Jalur Phosphatidylinositol-3 Kinase dalam Prekondisi NMDA: Mekanisme Berbeda untuk Kejang dan Degenerasi Neuronal Hippocampal yang Diinduksi oleh Asam Quinolinic. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [Referensi Silang]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Isoforms Secara Berbeda Melindungi dari Cedera Neuronal yang Diinduksi Stroke dengan Mengatur Aktivitas mTOR. Sdr. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [Referensi Silang]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Preconditioning dosis NMDA mempromosikan perlindungan saraf dengan meningkatkan rangsangan saraf. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [Referensi Silang]

40. Grabb, MC; Choi, Toleransi Iskemik DW dalam Kultur Sel Murine Cortical: Peran Kritis untuk Reseptor NMDA. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [Referensi Silang]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Peran Diferensial Subtipe Reseptor NMDA dalam Kematian Sel Neuronal Iskemik dan Toleransi Iskemik. Pukulan 2008, 39, 3042–3048. [Referensi Silang]

42. Gomez-Sanchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Kembalikan, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Polimorfisme Tp53 Arg72Pro manusia menjelaskan prognosis fungsional yang berbeda pada stroke. J.Exp. Kedokteran 2011, 208, 429–437. [Referensi Silang]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic Astrocyte-Derived Neurotrophic Factor (MANF) Melindungi Terhadap Apoptosis Neuronal melalui Aktivasi Jalur Pensinyalan Akt/MDM2/p53 dalam Model Tikus Perdarahan Intraserebral. Depan. Mol. Ilmu saraf. 2018, 11, 176. [Referensi Silang] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuklir WRAP53 mempromosikan kelangsungan hidup saraf dan pemulihan fungsional setelah stroke. Sains. Lanjut 2020, 6, eabc5702. [Referensi Silang]

45. Burmistrov, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; et al. Menargetkan PFKFB3 mengurangi cedera iskemia-reperfusi serebral pada tikus Sains. Rep. 2019, 9, 1–13. [Referensi Silang]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, PERGI; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallate menginduksi apoptosis dan penghentian siklus sel G2 melalui jalur Akt/MDM2/p53 dalam sel kanker ovarium A2780/CP70 yang tahan cisplatin. Int. J.Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [Referensi Silang] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Kamu, X. LXR-623-menginduksi RNA non-coding panjang LINC01125 menekan proliferasi sel kanker payudara melalui jalur pensinyalan PTEN/AKT/p53. Kematian Sel Dis. 2019, 10, 248. [Referensi Silang] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin melemahkan defisit alat gerak dan kognitif serta cedera saraf hippocampal melalui jalur pensinyalan PI3K/Akt1/GSK-3 dalam model iskemia serebral in vivo. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [Referensi Silang] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjo, P.; Siesjö, BK Perubahan Akt1 (PKB ) dan p70S6K pada Transient Focal Iskemia. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [Referensi Silang] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1,, dan NCX3. Dua efektor baru dari prakondisi tertunda pada iskemia otak. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [Referensi Silang]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Regulasi Stabilitas MDM2 setelah Kerusakan DNA. J. Sel. Fisik. 2015, 230, 2318–2327. [Referensi Silang]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Identifikasi dan karakterisasi beberapa protein mdm-2 dan kompleks protein mdm-2-p53. Onkogen 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53.Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Pensinyalan Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt yang Ditingkatkan Memiliki Target Pleiotropik di Neuron Hippocampal yang Terkena Stres Oksidatif yang diinduksi Besi. J.Biol. kimia 2013, 288, 19773–19784. [Referensi Silang] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, perdagangan p53 C. mitokondria-nuklir mengontrol kerentanan saraf pada stroke. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [Referensi Silang] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 mengoordinasikan neurogenesis dan ukuran kortikal selama pengembangan. Nat. Komunal. 2013, 4, 2879. [Referensi Silang] [PubMed]

56. Constantino, LC Peran Reseptor NMDA dalam Pengembangan Resistensi Otak melalui Pre- dan Postconditioning. Penuaan Dis. 2014, 5, 430–441. [Referensi Silang]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Kekurangan oksigen dan glukosa menginduksi disfungsi mitokondria dan stres oksidatif pada neuron tetapi tidak pada astrosit dalam kultur primer. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [Referensi Silang]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dinamika loop umpan balik p53-Mdm2 di sel individual. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [Referensi Silang]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Kamirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP mendorong inisiasi, perkembangan, dan metastasis tumor payudara pada tikus dan merupakan target terapi yang potensial. J.Clin. Selidiki. 2011, 121, 4655–4669. [Referensi Silang]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 memfosforilasi Cdh1 dan memodulasi stabilitas cyclin B1 dalam eksitotoksisitas. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [Referensi Silang]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Regulasi Interaksi Sintase Bcl-xL-ATP oleh Mitokondria Cyclin B1-Cyclin-Dependent Kinase-1 Menentukan Kelangsungan Hidup Neuronal. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [Referensi Silang] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Jalur Rock2 mengontrol integritas dan memori dendritik. Proses Natl. Acad. Sains. AS 2017, 114, 4513–4518. [Referensi Silang] [PubMed]