Korelasi Positif Antara Renal Tubular Flattening Dan Renal Tubular Injury/Fibrosis Interstisial Pada Model Penyakit Ginjal Murine

{0}}

ABSTRAK.Jumlah penderita penyakit kronis penyakit ginjal(CKD) terus berkembang secara global. Untuk mempelajari patogenesis dan mekanisme, banyak model hewan telah dikembangkan, termasuk model spontan, genetik, dan induksi. Meskipun setiap jenis CKD menunjukkan perubahan jaringan spesifik penyakit pada tahap awal, gangguan tubulus dan fibrosis interstisial secara histologis terjadi dalam perjalanan ke tahap akhir.gagal ginjal. Oleh karena itu, kuantifikasi gangguan tubular dan fibrosis interstisial dalam penelitian CKD menggunakan model hewan sangat penting untuk mengukur tingkat keparahan CKD dan, dengan demikian, kemanjuran agen terapeutik. Beberapa strategi telah digunakan untuk mengukur fibrosis interstisial. Di antara faktor penilaian,ginjalperataan tubular dapat dievaluasi secara kuantitatif dengan mudah dan murah. Namun, nilai diagnostikginjalevaluasi perataan tubular belum diselidiki sebelumnya. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menyelidiki korelasi antaraginjalpendataran tubulus dan fibrosis interstisial atauginjalpenanda cedera tubulus. Kami mengamati korelasi yang kuat antara derajat cedera tubulus/fibrosis interstisial danginjalperataan tubular dalam tiga jenis mousepenyakit ginjalmodel. Ini menguntungkan karena teknologi yang berkembang pesat seperti kecerdasan buatan dan pemrosesan gambar dapat dengan mudah diterapkan; karenanya, diagnosis yang lebih tepat, objektif, dan kuantitatif harus dimungkinkan di masa depan.

Kata kunci:fibrosis interstisial, penyakit ginjal, pendataran tubulus ginjal, cedera tubulus ginjal; gagal ginjal

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT GINJAL/GINJAL

Pasien dengan kronispenyakit ginjal(CKD) menunjukkan gejala proteinuria atau penurunan laju filtrasi glomerulus yang berkepanjangan (lebih dari tiga bulan). Penyakit ini termasuk dalam kelompok pasien dengan risiko tinggi stadium akhirgagal ginjal.Jumlah pasien dengan CKD terus meningkat secara global. Ketika CKD berkembang, itu mengarah ke stadium akhirgagal ginjal, yang membutuhkan perawatan dialitik yang membutuhkan biaya besar, yang menyebabkan peningkatan pengeluaran medis [14]. Oleh karena itu, pengembangan penanda baru untuk memantau timbulnya dan perkembangan CKD dan penetapan metode pengobatan baru sangat dibutuhkan. Penyebab umum CKD termasuk diabetes, tekanan darah tinggi, penyakit glomerulus, dan faktor risiko CKD lainnya. Meskipun setiap jenis CKD menunjukkan perubahan jaringan spesifik penyakit pada tahap awal, gangguan tubulus dan fibrosis interstisial secara histologis terjadi dalam perjalanan ke tahap akhir.gagal ginjal. ginjalfibrosis adalah perubahan jaringan yang terutama terkait dengan gangguan tubular terkait CKD dan fibrosis interstisial dan dianggap sebagai target pengobatan yang signifikan untuk mencegah perkembangan ke stadium akhirgagal ginjal[25]. Oleh karena itu, kuantifikasi gangguan tubular dan fibrosis interstisial dalam penelitian CKD menggunakan model hewan sangat penting untuk mengukur tingkat keparahan CKD dan, dengan demikian, kemanjuran agen terapeutik. Beberapa strategi telah digunakan untuk mengukur fibrosis interstisial, termasuk pewarnaan Sirius red atau pewarnaan trikrom Masson untuk mengukur daerah fibrilasi, skor gangguan tubular untuk analisis morfologiginjaltubulus, dan berbagai penanda cedera, seperti -SMA, neutrofil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), L-FABP, dan Kim-1 [6, 7, 9, 10, 16, 23]. Skor gangguan tubulus meliputi perataan, ekspansi, degenerasi, atrofi, dan hilangnya brush borderginjaltubulus [27]. Di antara faktor penilaian tersebut,ginjalperataan tubular (penurunan tinggi badan) dapat dievaluasi secara kuantitatif dengan mudah dan murah [1–3, 19, 20]. Namun, nilai diagnostik evaluasi perataan tubulus ginjal belum diselidiki sebelumnya. Oleh karena itu, kami menganalisis korelasi antara derajat fibrosis interstisial danginjalperataan tabung dipenyakit ginjal.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI GINJAL/GINjal

BAHAN DAN METODE

Pernyataan etisSemua eksperimen hewan telah disetujui oleh Presiden Universitas Kitasato, setelah dipertimbangkan oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Kitasato (ID Persetujuan: No. 19-153,19-154, 19-155). Tikus jantan FVB/NJcl (FVB) dan BALB/cAJcl (BALB/c) diperoleh dari CLEA (Tokyo, Jepang). Semua tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu. Mereka diberi akses ke makanan dan air steril ad libitum sebelum dan selama percobaan.HewanModel Tns2nph: tikus mutan FVB-Tns2nph (FVB-nph) digunakan sebagai model CKD seperti yang dijelaskan dalam [22]. Model iskemia-reperfusi (IR): Model IR yang dibuat dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [18]. Mencit umur delapan minggu (FVB Jantan) dibius dengan inhalasi isofluran dan ginjal kirinya diambil, kemudian lapisan otot dan fasia ditutup dengan menggunakan jahitan absorbable. Setelah sepuluh hari pemulihan, tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal kombinasi obat anestesi seperti yang dijelaskan sebelumnya [11],ginjalarteri dan vena dipertahankan dalam keadaan iskemik dengan klem arteri (TKS-1-40, BEAR Medic, Ibaraki, Jepang) masing-masing selama 30 dan 60 menit, kemudian lapisan otot dan facia ditutup dengan menggunakan jahitan yang dapat diserap. Selain itu, tikus kontrol yang menjalani operasi palsu menjadi sasaran operasi terbuka tanpa klem. Setelah itu, semua tikus di-eutanasia dengan menghirup isofluran overdosis (Escain, Pfizer Japan Inc., Tokyo, Jepang) untuk dilakukan pengambilan sampel. Ituginjaldikeluarkan 24 jam setelah replikasi iskemia. Model nefropati yang diinduksi adriamycin (ADR): model nefropati: tikus BALB/c berusia delapan minggu diberikan baik ADR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Jepang) (10 mg/kg) atau larutan garam (kelompok kendaraan ) melalui vena ekor untuk mengevaluasi merekagangguan ginjalhistologis pada 14 hari setelah pemberian.

HistologiGinjal Tikus difiksasi dengan 4 persen paraformaldehyde (PFA) pada 4 derajat semalaman.Ginjalblok diiris pada 2 m (untuk pewarnaan Periodic Acid-Schiff (PAS)) dan 4 m (untuk pewarnaan Picro-Sirius Red). Untukginjalpengukuran tinggi tubular, sisi korteksGinjalbagian difoto secara acak dalam empat tampilan berbeda (×100). Dua peneliti independen secara membabi buta mengukurginjaltinggi tabung di semua tampilan untuk menghitung tinggi rata-rata setiap subjek. Untuk subjek dengan ketinggian tabung yang tidak rata, pengukuran dua sampai lima lokasi dipilih per tubulus untuk mendapatkan nilai rata-rata (Gbr. 1A). Sekitar 700 pengukuran tinggi tabung diperoleh per subjek menggunakan prosedur yang disebutkan di atas untuk menghitung nilai rata-rata untuk setiap subjek. Untuk pewarnaan Sirius Red, slide dideparafinisasi dan diwarnai 1 jam dengan Sirius red dalam asam pikrat berair jenuh dan dicuci dengan asam asetat 0,5 persen. Untuk menilai area fibrilasi menggunakan pewarnaan Sirius red, area target difoto secara acak dalam delapan tampilan (×100), dan area positif dihitung menggunakan ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) untuk menghitung tingkat huniannya sehubungan dengan luas total. Glomeruli diwarnai dengan Sirius merah dan pembuluh darah dikeluarkan dari perhitungan.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN INFEKSI GINJAL/GINJAL

Pewarnaan imunokimiaBagian ginjal (5 m) dideparafinisasi dan dilakukan pengambilan antigen dalam buffer sitrat, pada 121 derajat selama 15 menit. setelah dicuci dengan Tris-buffered saline (TBS),Ginjalbagian disegel dengan 0.3 persen hidrogen peroksida/metanol selama 20 menit, dan kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 derajat dengan antibodi anti-NGAL (Abcam, Cambridge, UK). Bagian dicuci dengan TBS dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (Histofine SimpleStain MAX PO (Kelinci), Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Jepang) selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah dicuci dengan TBS, bagian diinkubasi dengan 3,3′-diaminobenzidine (DAB) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Jepang) dan hematoxylin pada suhu kamar. Untuk menilai kelainan tubular melalui pewarnaan imunokimia menggunakan antibodi anti-NGAL, sampel jaringan difoto secara acak dalam delapan tampilan (×100), dan area pewarnaan DAB dikuantifikasi menggunakan ImageJ untuk menghitung tingkat huniannya sehubungan dengan total area.

StatistikData disajikan sebagai mean ± standar deviasi. Uji-t siswa digunakan untuk menguji perbedaan yang signifikan antara dua kelompok, dan uji multikelompok Bonferroni digunakan untuk menguji beberapa kelompok. Nilai-P<0.05 was="" statistically="" significant.="" bonferroni's="" multigroup="" test="" was="" carried="" out="" using="" graphpad="" prism="" 5="" software="" (mdf,="" tokyo,="">

HASIL Seperti disebutkan di atas, kuantifikasi area fibrotik interstisial menggunakan pewarnaan Sirius red harus menjadi metode evaluasi standar untuk gangguan tubulus pada pasien denganpenyakit ginjalatau dipenyakit ginjalmodel. Jadi, untuk kuantifikasi gangguan tubular dan fibrosis interstisial menggunakan model murine CKD hewan, kami menggunakan tikus mutan FVB-Tns2nph (FVB-nph), yang merupakan model hewan CKD yang menunjukkan banyak gejala CKD manusia yang berkembang secara bertahap selama periode yang diperpanjang. , termasuk onset genetik glomerulosklerosis sejak lahir, fibrilasi tubulointerstitium,ginjalanemia, dangagal ginjal[17, 21, 22]. Tikus FVB-nph mereproduksi gejala khas yang diamati pada perkembangan CKD manusia. Dalam penelitian ini, kami memperkenalkan mutasi nph ke dalam garis FVB yang rentan terhadap nefropati. Kelompok FVB-nph menunjukkan lebih banyak pendataran tubulus daripada kelompok WT, berdasarkan memburuknya fibrilasi interstitium diginjaltubulus (Gbr. 1B-D). Analisis regresi linier menunjukkan korelasi berlawanan yang signifikan antara tinggi tubulus dan derajat fibrosis interstisial (R2=0.7086: P=0.0023) (Gbr. 1E).

Gambar 1. (A) Pengukuran tinggi sel epitel tubulus. Bar merah menunjukkan tinggi tubulus. (B) Gambar representatif pewarnaan Periodic Acid-Schiff (PAS) dan gambar pewarnaan Sirius Red dari 10-FVB-Tns2WT (FVB-WT) berumur seminggu (panel kiri) dan tikus mutan FVB-Tns2nph (FVB- nph) (panel kanan) bagian ginjal. Panel atas mewakili gambar diwarnai PAS, dan panel bawah mewakili gambar diwarnai Sirius Red. Bilah skala: 50 m. (C) Grafik membandingkan ketinggian tabung FVB-WT dan FVB-nph. (D) Grafik membandingkan luas Fibrosis vs luas total. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi; Nilai-P dihitung dengan uji-t Student. (E) Scatter plot dengan regresi linier menunjukkan analisis korelasi antara tinggi tubulus dengan derajat skor fibrosis. Garis regresi linier menunjukkan korelasi terbalik antara tinggi tubulus dan luas fibrosis. Koefisien korelasi nilai R dan P ditampilkan. Lingkaran hitam menunjukkan grup FVB-WT (n=5), dan kotak hitam menunjukkan grup FVB-nph (n=5). **P<0.01,><>

Cedera tubulus ginjal dan tinggi tubulus diukur menggunakancedera ginjal(AKI) model-yaitu, model IR [5, 12, 18]. Meskipun fibrosis interstisial tidak boleh diamati pada sebagian besar kasus AKI, termasukginjalgangguan iskemik, ekspresi NGAL meningkat pada sel tubulus ginjal [7]. Selain itu, NGAL diketahui terlibat dalam perkembangan AKI menjadi CKD dan telah diusulkan sebagai faktor vital pada keduanya. Oleh karena itu, kami menunjukkan bahwa ekspresi NGAL berkorelasi denganginjaltinggi tabung menggunakan model IR. Telah dilaporkan bahwa waktu iskemia sering ditetapkan pada 20 sampai 60 menit dan cedera tubulus memburuk dengan meningkatnya waktu iskemia [4, 5, 12, 18]. Dalam penelitian ini, tikus menjadi sasaran iskemia selama 30 menit sebagai cedera tubular yang lemah dan 60 menit sebagai cedera tubular yang kuat. Peningkatan ekspresi NGAL dan perataan tubular diamati pada kelompok 30 dan 60 menit. Peningkatan ekspresi NGAL dan pendataran tubulus lebih jelas pada kelompok 60 menit karena mengalami lebih banyak cedera (Gbr. 2A-C). Penurunan tinggi tubulus dan peningkatan ekspresi NGAL ditunjukkan berdasarkan peningkatan durasi keadaan iskemik (Gbr. 2A-C). Analisis regresi linier dari hasil juga menunjukkan korelasi negatif antaraginjaltinggi tabung dan ekspresi NGAL (R2=0.6266, P=0.011) (Gbr. 2D).

Model nefropati ADR sering digunakan dalampenyakit ginjalpenelitian karena menghasilkan cedera glomerulus dan gangguan tubulus minor dengan tingkat reproduktifitas tinggi menggunakan dosis tunggal ADR [13]. Model tikus nefropati ADR digunakan dalam penelitian ini untuk mengevaluasiginjalcedera tubulus dan ketinggian. Model hewan pengerat dari nefropati yang diinduksi ADR sering digunakan untuk menjelaskan mekanisme glomerulosklerosis fokal (FSGS) dan CKD. Dosis tunggal ADR dapat menyebabkan hilangnya podosit, proteinuria persisten, dan FSGS. Di antara strain tikus yang berbeda, BALB/c sensitif terhadap ADR, sedangkan C57BL/6 (B6) resisten. Jadi, kami menggunakan BALB/c dalam percobaan ADR ini. Pada nefropati ADR,ginjalfibrosis interstisial, yang merupakan temuan khas CKD, adalah

Gambar 2. (A) Gambar representatif pewarnaan Periodic Acid- Schiff (PAS) dan gambar pewarnaan imunokimia dengan antibodi anti-neutrofil gelatinase terkait lipocalin (NGAL) palsu (panel kiri), 30 menit (panel tengah), dan 60 menit (panel kanan) bagian ginjal. Panel atas mewakili gambar yang diwarnai PAS dan panel bawah mewakili gambar yang diwarnai imunokimia dengan antibodi anti-NGAL. Bilah skala: 50 m. (B) Grafik membandingkan ketinggian tabung palsu, 30 menit, dan 60 menit. (C) Grafik membandingkan area NGAL-positif vs. total area palsu, 30 menit dan 60 menit. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi; Nilai-P dihitung dengan uji multigrup Bonferroni. (D) Scatter plot dengan regresi linier menunjukkan analisis korelasi antara tinggi tubulus dan area positif NGAL. Garis regresi linier menunjukkan korelasi terbalik antara tinggi tubulus dan area positif NGAL. Koefisien korelasi nilai R dan P ditampilkan. Lingkaran hitam menunjukkan grup palsu (n=3), kotak hitam menunjukkan grup 30 menit (n=3), dan segitiga hitam menunjukkan grup 60 menit (n=3). *P<0.05,><>

menonjol pada 4 minggu setelah pemberian ADR, sedangkan kondisi peralihan antara AKI dan CKD diamati kurang dari 4 minggu [24]. Dalam penelitian ini, kami menilai perataan tubulus pada tikus 2 minggu setelah pengobatan ADR, suatu kondisi menengah. tingkatginjalcedera tubulus dievaluasi dengan mengukur ekspresi NGAL, yang meningkat pada sel-sel tubulus ginjal yang rusak [6]. Tinggi tubulus ginjal diukur, dan pewarnaan imunokimia menggunakan antibodi anti-NGAL dilakukan pada jaringan ginjal kelompok ADR dan kendaraan. Tidak ada citra positif pewarnaan Sirius red yang terdeteksi (data tidak ditampilkan). Perataan tubulus ditingkatkan dengan pemberian ADR, dan peningkatan nyata dalam ekspresi NGAL ditunjukkan (Gbr. 3A-C). Selain itu, analisis regresi linier dari ketinggian tubular dan tingkat ekspresi NGAL menunjukkan korelasi yang berlawanan (R2=0.522, P=0.043) (Gbr. 3D).

DISKUSI

Korelasi kuat antara pendataran tubulus ginjal dan fibrosing interstisial pada model CKD berat dan antara pendataran tubulus dan gangguan tubulus pada model ADR dan IR, ditunjukkan dalam penelitian ini. Ada berbagai mekanisme di mana lesi glomerulus menyebar ke fibrosis interstisial melalui gangguan tubulus. Sebuah penelitian melaporkan bahwaginjalkerusakan tubulus (perataan) menginduksi fibrosing interstisial, produksi matriks ekstraseluler (ECM), dan infiltrasi sel inflamasi. Korelasi yang kuat antaraginjalperataan tubulus dan fibrilasi interstisial tubulus ginjal yang diamati dalam penelitian ini mungkin berhubungan dengan hubungan kausal yang dilaporkan sebelumnya; yaitu,ginjalkerusakan tubulus menginduksi fibrosing, produksi ECM, dan infiltrasi sel. Studi lain juga menunjukkan korelasi antara peningkatan ekspresi NGAL dan atrofi tubulus ginjal (item skor cedera gangguan ginjal lainnya), dengan hasil yang serupa dengan skor perataan tubulus ginjal yang diperoleh dalam penelitian ini [26]. Dalam penelitian ini, hanya laki-laki

Gambar 3. (A) Gambar representatif pewarnaan Periodic Acid-Schiff (PAS) dan pewarnaan imunokimia dengan antibodi anti-neutrofil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) kendaraan (panel kiri) dan adriamycin (ADR) (panel kanan) bagian ginjal. Panel atas mewakili gambar yang diwarnai PAS dan panel bawah mewakili gambar yang diwarnai imunokimia dengan antibodi anti-NGAL. Bilah skala: 50 m. (B) Grafik membandingkan ketinggian tabung kendaraan dan ADR. (C) Grafik membandingkan area NGAL-positif vs. total area. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi; Nilai-P dihitung dengan uji multigrup Bonferroni. (D) Scatter plot dengan regresi linier menunjukkan analisis korelasi antara tinggi tubulus dan area positif NGAL. Garis regresi linier menunjukkan korelasi terbalik antara tinggi tubulus dan area positif NGAL. Koefisien korelasi nilai R dan P ditampilkan. Lingkaran hitam menunjukkan grup kendaraan (n=3), dan kotak hitam menunjukkan grup ADR (n=5). *P<0.05,><>

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN NYERI GINJAL / GINJAL

tikus digunakan, tetapi pendataran tubulus pada nefropati dapat diamati pada kedua jenis kelamin. Namun, tikus betina telah dilaporkan resisten terhadap IR dan model nefropati lainnya, sehingga penggunaan tikus jantan atau betina harus dipertimbangkan tergantung pada model nefropati yang digunakan [8]. Itu juga sulit untuk menilai pendataran tubulus di medula, karena tubulus di medula pada saat non-cedera memiliki sel-sel tubulus tipis, meskipun tinggi tubulus di korteks dinilai. Oleh karena itu, metode sederhana untuk menilai cedera tubulus di medula harus dikembangkan di masa depan (data tidak ditampilkan). Para ahli seperti ahli patologi atau klinisi umumnya melakukan evaluasi tingkat atrofi, ekspansi, atau mutasi tubulus ginjal untuk menilai histologi tubulus ginjal; namun, pengukuran tinggi tubulus ginjal untuk menilai tingkat perataan dapat dilakukan dengan lebih mudah dibandingkan dengan metode lain. Ini juga menguntungkan karena teknologi yang berkembang pesat seperti kecerdasan buatan dan pemrosesan gambar dapat dengan mudah diterapkan; karenanya, diagnosis yang lebih tepat, objektif, dan kuantitatif harus dimungkinkan di masa depan. Untuk memastikan apakah pendataran tubulus ginjal dapat menjadi fenomena yang diamati secara universal sebagai indeks keganasan CKD pada spesies yang berbeda, penyelidikan lebih lanjut menggunakan model CKD dari hewan pengerat lain, hewan pendamping seperti anjing dan kucing, atau sampel yang dikumpulkan dari manusia harus dilakukan.