Bagaimana Fosfoinositida 3-kinase Inhibitor Alpelisib Digunakan Untuk Sindrom Lowe/Penyakit Penyok?

Fosfoinositida 3-inhibitor kinase alpelisib mengembalikan organisasi aktin dan meningkatkan disfungsi tubulus proksimal in vitro dan pada model tikus dengan sindrom Lowe dan penyakit Dent

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6dan Jennifer L. Gallop^2,6

KATA KUNCI: sitoskeleton; endositosis; lemak; tubulus proksimal; sindrom Fanconi ginjal

Mutasi kehilangan fungsi pada gen OCRL, yang mengkode phosphatidylinositol [PI] 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] 5-phosphatase OCRL, menyebabkan kerusakan endositosis dan disfungsi tubulus proksimal diSindrom Lowe dan penyakit Dent2. Cacat ini disebabkan oleh peningkatan kadar PI(4,5)P2 dan polimerisasi aktin yang menyimpang, menghalangi perdagangan endosom. PI 3-fosfat [PI(3)P] baru-baru ini diidentifikasi sebagai koaktivator dengan PI(4,5)P2 di jalur aktin. Di sini, kami menguji hipotesis bahwafosfoinositida 3-kinase(PI3K) inhibitor dapat menyelamatkan defek endositik yang disebabkan oleh hilangnya OCRL, dengan menyeimbangkan kembali sinyal fosfoinositida ke mesin aktin. PI3K (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor copanlisib dan kelas IA p110a PI3K(fosfoinositida 3-kinase) penghambat alpelisibmengurangi polimerisasi aktin yang menyimpang dalam sel ginjal manusia yang kekurangan OCRL secara in vitro. Tingkat PI 3,4,5-trisfosfat, PI(4,5) P2, dan PI(3)P semuanya berkurang dengan pengobatan alpelisib, dan knockdown siRNA dari subunit katalitik PI3K p110a fenotip fenotipe aktin. Dalam model tikus OcrlY/- yang dimanusiakan, alpelisib mengurangi pewarnaan aktin endosom sambil memulihkan arsitektur serat stres dan kadar megalin pada membran plasma sel tubulus proksimal, yang dicerminkan oleh peningkatan penyerapan endositik dari protein dengan berat molekul rendah in vivo. Dengan demikian, temuan kami mendukung hubungan antara lipid fosfoinositida, polimerisasi aktin, dan perdagangan endositik di tubulus proksimal dan mewakili bukti konsep untuk penggunaan kembali alpelisib diSindrom Lowe/Penyakit Penyok2.

Pernyataan Terjemahan

Sindrom Lowe dan penyakit Dent2, disebabkan oleh mutasi pada fosfoinositida lipid 5-fosfatase OCRL, bermanifestasi dengan disfungsi tubulus proksimal dan proteinuria berat molekul rendah dengan hanya perawatan suportif yang tersedia. Temuan kami mengungkapkan bahwafosfoinositida 3-kinase penghambat alpelisib, yang saat ini disetujui untuk terapi kanker, mengurangi keseimbangan fosfoinositida yang menyimpang dan fenotipe aktin yang terkait dengan hilangnya OCRL, menyebabkan peningkatan substansial dari mesin endositik dan kapasitas penyerapan dalam sistem seluler dan model tikus manusiawi untuk sindrom Lowe / penyakit Dent 2. Mengingat profil keamanannya yang jelas, alpelisib adalah kandidat yang menjanjikan untuk penggunaan kembali obat diSindrom Lowe dan penyakit Dent.

Sel-sel epitel yang melapisi tubulus proksimal (PTs) ginjal memiliki jalur endolisosomal yang diperantarai reseptor efisien yang memulihkan dan memproses zat-zat penting yang disaring melalui glomerulus. Gangguan kongenital yang mempengaruhi endolisosom menyebabkan disfungsi PT (sindrom Fanconi ginjal) dengan hilangnya zat terlarut dan protein dengan berat molekul rendah (LMW), sering diperumit oleh komplikasi metabolisme dan pertumbuhan dan perkembangan penyakit ginjal kronis.¹Mutasi inaktivasi pada OCRL telah dikaitkan dengan penyakit Dent 2 (MIM #300555), gangguan yang ditandai dengan disfungsi PT, batu ginjal, dan gagal ginjal progresif, dan dengan sindrom oculocerebrorenal Lowe (MIM #309000), yang ditampilkan sebagai tambahan. disfungsi PT dan gagal ginjal, manifestasi sistemik seperti katarak kongenital, cacat kognitif, dan hipotonia.^2-4Perawatan saat ini untuk penyakit Dent 2 dan sindrom Lowe hanya bersifat suportif.

Gambar 1|PI3K (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor meredakan perakitan aktin yang menyimpang pada endosom dalam model sel ginjal manusia (HK2) yang kekurangan OCRL. (a) Langkah-langkah konversi lipid fosfoinositida yang relevan untuk penelitian ini menunjukkan konversi antara PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2, dan PI(3)P dengan enzim yang paling relevan dicetak tebal, paling relevan konversi dalam garis padat, dan lainnya dalam garis putus-putus. PI(4,5)P2 meningkat pada sindrom Lowe karena kurangnya 5-aktivitas fosfatase dari OCRL dan dibuat dari fosforilasi PI oleh fosfatidilinositol 4-kinase (PI4Ks) dan PI(4) P 5-kinase (PIP5K). PI(4,5)P2 difosforilasi oleh PI3Ks kelas I untuk menghasilkan PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 dapat didefosforilasi menjadi PI(4,5)P2 oleh PTEN atau menjadi PI(3,4)P2 oleh SH-2–mengandung inositol 50 polifosfat (SHIP) 1 dan 2, synaptojanin 1 dan 2, dan juga OCRL, meskipun ini (lanjutan)

Gambar 1|(lanjutan) dianggap kecil. PI(3,4)P2 didefosforilasi menjadi PI(3)P oleh inositol polifosfat-4-fosfatase tipe IA (INPP4A) dan B. PI(3)P juga dibuat di endosom melalui fosforilasi PI oleh kelas III PI3K (fosfoinositida 3-kinase), protein penyortiran vakuolar Vps34. ( b ) Western blots yang menggambarkan hilangnya ekspresi OCRL dalam garis sel KO HK2 OCRL CRISPR (KO) dibandingkan dengan sel kontrol HK2 tipe liar (WT) dengan tubulin sebagai kontrol pemuatan. ( c – e ) Mikrograf confocal Airyscan representatif dan kuantifikasi antigen endosom awal 1 (EEA1) / aktin tumpang tindih (dinyatakan sebagai persentase dari total vesikel EEA1þ yang terdeteksi) untuk sel HK2 WT atau OCRL KO yang diobati dengan dimetilsulfoksida (DMSO) (d) atau inhibitor yang ditunjukkan dan difiksasi menggunakan fiksasi formaldehida 4 persen. Dalam semua kasus, gambar mengilustrasikan irisan-z tunggal dari tumpukan sel confocal yang diproses Airyscan yang diberi imunolabel untuk EEA1 (kuning), phalloidin (aktin, magenta), dan 40,6-diamidino{ {14}}fenilindole (DAPI) (sian). Batang=5 mm. Dalam kuantifikasi, garis menunjukkan mean ± SEM dan setiap titik data adalah sel individual. Dalam semua percobaan, perawatan diterapkan 16 jam sebelum fiksasi. Dalam semua kuantifikasi, signifikansi statistik dinilai dengan analisis varians Kruskal-Wallis (KW) dengan uji perbandingan berganda Dunn. ( c ) Sel WT atau KO yang diobati dengan DMSO atau 100 nM copanlisib, menunjukkan penyelamatan tumpang tindih aktin-endosom. Uji KW: ***P < 0.0{{50}}1,="" beberapa="" perbandingan;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" copanlisib="" keduanya="" ***p="">< 0.001,="" wt="" copanlisib="" versus="" ko="" copanlisib="" p="0.44" (tidak="" signifikan="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67,="" dan="" 63="" sel="" masing-masing="" untuk="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso,="" dan="" ko="" copanlisib.="" (="" d="" )="" sel="" wt="" atau="" ko="" yang="" diobati="" dengan="" dmso="" atau="" 10="" mm="" alpelisib,="" menunjukkan="" penyelamatan="" tumpang="" tindih="" aktin-endosom.="" uji="" kw:="" ***p="">< 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" keduanya="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43, dan 41 sel masing-masing untuk WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO, dan KO alpelisib. ( e ) sel WT atau KO yang diobati dengan DMSO, 10 mM GSK2636771, atau 10 mM idelalisib, menunjukkan bahwa tidak ada senyawa yang mampu secara signifikan mengurangi tumpang tindih aktin-endosom. Uji KW: ***P < 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" dmso="" wt="" versus="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" gsk,="" *p="0.04," ko="" dmso="" versus="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131, dan 145 sel masing-masing untuk WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771, dan KO idelalisib. Untuk mengoptimalkan tampilan gambar ini, silakan lihat versi online artikel ini di www.kidney-international.org

Bagaimana phosphoinositide 3-inhibitor kinase alpelisib digunakan untuk sindrom Lowe/penyakit Dent?

Proteinuria LMW adalah fitur yang konsisten yang diamati pada sindrom Lowe/penyakit Dent 2, mengungkapkan bahwa OCRL mempengaruhi endositosis yang dimediasi reseptor.⁵OCRL mengkodekan fosfatidilinositol (PI) 4,5-bifosfat [PI(4,5)P2] 5- fosfatase OCRL,⁶yang mengontrol identitas lipid dalam jalur endolisosom dengan mendegradasi PI(4,5)P2 (Gambar 1a). Degradasi PI(4,5)P2 yang kurang melalui OCRL berimplikasi pada kegagalan uncoat vesikel berlapis klatrin dalam fibroblas, disertai dengan pembentukan struktur "komet" dari aktin berfilamen yang terpolimerisasi dari hasil organel mirip endosom awal yang menyimpang.^7-9Pada tipe sel lain, terutama sel PT ginjal, defisiensi OCRL menghasilkan struktur "keranjang" F-aktin yang mengelilingi organel endolisosomal yang menyimpang.¹⁰Kelebihan F-aktin memblokir perdagangan membran melalui jalur endositik dan endolisosom, dan disarankan untuk mengurangi daur ulang megalin reseptor multiligand ke membran apikal, memperparah cacat dalam jalur endolisosom.¹¹Sesuai dengan peran utama aktin F yang menyimpang, serapan endositik yang rusak yang disebabkan oleh mutasi OCRL dikurangi dengan menargetkan mesin aktin dengan latrunculin B, atau dengan menipiskan protein pengatur aktin serta dengan penipisan kecil yang dimediasi RNA (siRNA) yang mengganggu PI(4)P 5-kinase untuk menyesuaikan sintesis PI(4,5)P2^7,10(Gambar 1a).

Polimerisasi aktin semakin dipahami sebagai timbul tidak hanya dari PI(4,5)P2 tetapi juga dari lipid fosfoinositida lainnya. Misalnya, PI(3,4,5)P3 mengaktifkan GTPase Rac tipe Rho, dan PI(3)P bekerja bersama dengan PI(4,5)P2 untuk merangsang polimerisasi aktin di hilir GTPase tipe Rho lainnya, Cdc42.^12-14Interkonversi fosfoinositida ini digabungkan dengan pergerakan lipid melalui jalur endositik dan endosom. PI(4,5)P2 difosforilasi oleh fosfatidilinositol- 30 -kinase kelas I (PI3K) menjadi PI(3,4,5)P3 pada membran plasma dan secara progresif mengalami defosforilasi menjadi PI(3,4)P2 dan PI (3)P atau PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P diperkaya pada endosom, di mana sangat penting untuk fungsinya dan sebagian besar dibuat secara langsung oleh fosforilasi PI oleh kelas III PI3K(fosfoinositida 3-kinase), Vps34¹⁶(Gambar 1a). Dalam garis sel epitel berpigmen retina (RPE) yang kekurangan OCRL, komet aktin yang dihasilkan dikurangi dengan pengobatan dengan PI3K(fosfoinositida 3-kinase)inhibitor wortmannin dan Vps34-IN1, sesuai dengan studi biokimia yang menunjukkan koregulasi aktin melalui kebetulan PI(3)P dan PI(4,5)P2.¹⁴

Penyelamatan endositosis diamati ketika menargetkan mesin aktin pada pasien OCRL dan sel knockout (KO),^7,10bersama dengan regulasi hulu aktin oleh PI3K (fosfoinositida 3-kinase)aktivitas¹⁴dan sifat konversi PI yang sangat saling berhubungan, memberikan kemungkinan yang menarik bahwa PI3K kelas I (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor mungkin berguna dalam sindrom Lowe. Inhibitor tersebut, dikembangkan untuk terapi kanker, disetujui untuk penggunaan klinis¹⁷dan dengan demikian berpotensi menerima penggunaan kembali obat. Meskipun senyawa seperti copanlisib¹⁸memiliki spesifisitas yang luas dan efek samping, keberhasilan baru-baru ini telah ditunjukkan untuk inhibitor yang lebih spesifik. Idealalisib,¹⁹yang menargetkan PI3K(fosfoinositida 3-kinase)subunit p110d, disetujui untuk limfoma limfositik kronis, dan alpelisib, yang menargetkan p110a, disetujui untuk digunakan pada kanker payudara.^20,21Selain itu, alpelisib telah menunjukkan manfaat klinis pada anak-anak dengan sindrom PROS/CLOVES,²²sindrom pertumbuhan berlebih langka yang dihasilkan dari aktivasi PIK3A.

Di sini, kami menguji hipotesis bahwa kelas I PI3K(fosfoinositida 3-kinase)inhibitor dapat menyelamatkan cacat endositik karena hilangnya OCRL, menggunakan model seluler dan tikus yang sudah mapan.^10,11,23Kami menunjukkan bahwa penghambatan PI3K(fosfoinositida 3-kinase)aktivitas melalui copanlisib atau alpelisib, atau penipisan yang dimediasi siRNA dari subunit katalitik p110a target alpelisib mengurangi kelebihan polimerisasi aktin pada sel ginjal manusia (HK2) yang kekurangan OCRL. Berfokus pada alpelisib sebagai senyawa paling spesifik untuk penggunaan klinis, kami menunjukkan bahwa alpelisib mengurangi polimerisasi aktin dan meningkatkan penyerapan melalui jalur endolisosomal dalam sel PT dari Ocrl yang dimanusiakan^Y/-tikus secara invitro. Selanjutnya, pengobatan alpelisib in vivo meredakan proteinuria, mengurangi disfungsi PT, dan menyelamatkan tingkat seluler megalin di Ocrl yang dimanusiakan.^Y/-tikus. Hasil ini mendukung alpelisib sebagai kandidat untuk repurposing obat diSindrom Lowe dan penyakit Dent 2.

Gambar 2|Efek Alpelisib pada aktin responsif terhadap dosis dan direkap oleh siRNA dari PI3K(fosfoinositida 3-kinase)hal110a. (a) Mikrograf confocal Airyscan representatif (difiksasi menggunakan 4 persen formaldehida fifix dan diimunisasi untuk antigen endosom awal 1 [EEA1], kuning; aktin [phalloidin], magenta; dan 4{{40}},{{ 5}}diamidino-2-phenylindole [DAPI], cyan; bar=5 mm) dan kuantifikasi sel ginjal manusia tipe liar (WT) atau knockout (KO) (HK2) yang diobati dengan dimetilsulfoksida (DMSO) atau dosis alpelisib yang ditunjukkan selama 16 jam, menunjukkan penyelamatan responsif-dosis dari tumpang tindih aktin-endosomal. Dalam semua kasus, garis menunjukkan rata-rata ± SEM dan titik menunjukkan sel individu. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66, dan 67 sel untuk kontrol WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , dan KO 2.5, 5, 10, 15, 25, dan 50 mM alpelisib, masing-masing. Signifikansi statistik dinilai dengan uji Kruskal-Wallis (KW) dengan uji perbandingan berganda Dunn: keseluruhan ***P < 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" dmso="" wt="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 5,="" 15,="" 25,="" dan="" 50="" mm="" alpelisib="" semua="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" versus="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" dan="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (tidak signifikan [ns]). (b) Western blot untuk p110a dan kontrol pemuatan a-tubulin dari sel WT atau KO yang diperlakukan dengan scramble (Scram.) atau p110a siRNA. (c) Mikrograf confocal Airyscan representatif (difiksasi menggunakan fiksasi formaldehid 4 persen dan diberi imunolabel untuk EEA1, kuning; aktin [phalloidin], magenta; dan DAPI, cyan; batangan=5 mm) dan kuantifikasi sel WT atau KO yang dirawat dengan scramble (S) atau p110a siRNA, menunjukkan pengurangan tumpang tindih aktin EEA1-pada penipisan p110a. Uji KW dengan uji perbandingan berganda Dunn: ***P < 0,001,="" perbandingan="" berganda;="" perebutan="" wt="" versus="" perebutan="" ko,="" perebutan="" ko="" versus="" ko="" p110a="" sirna="" keduanya="" ***p="">< 0,001.="" n="79," 108,="" 93,="" dan="" 131="" sel,="" masing-masing.="" hk2,="" ginjal="" manusia;="" pi3k,="" fosfatidilinositol-30="" -kinase;="" sirna,="" rna="" kecil="" yang="" mengganggu.="" untuk="" mengoptimalkan="" tampilan="" gambar="" ini,="" silakan="" lihat="" versi="" online="" artikel="" ini="" di="">

Gambar 3|Kadar phosphatidylinositol (PI) 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] meningkat dengan OCRL knockout (KO), dan PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , dan PI(3)P ditekan dengan pengobatan alpelisib. Dalam semua percobaan, perawatan yang ditunjukkan diterapkan 16 jam sebelum fiksasi. Dalam kuantifikasi, garis menunjukkan rata-rata ± SEM, dan setiap titik data dihasilkan dari sel individual. Dalam semua kuantifikasi, signifikansi statistik dinilai dengan analisis varians Kruskal-Wallis (KW) dengan uji perbandingan berganda Dunn. Bilah=20mm di semua gambar. (a) Mikrograf widefield representatif dari sel tipe liar (WT) atau KO ginjal manusia (HK2) yang diperlakukan dengan dimetilsulfoksida (DMSO) atau 10 mM alpelisib dan kemudian difiksasi dengan fifiks membran plasma dan diberi imunolabel untuk PI(3,4,5 )P3 (merah) dan 40,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (sian), dengan kuantifikasi rata-rata intensitas pelabelan PI seluler (3,4,5)P3, menunjukkan efektivitas alpelisib perlakuan pada sintesis PI(3,4,5)P3. N=96, 128, dan 109 sel masing-masing untuk WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO, dan KO alpelisib. KW (lanjutan)

Gambar 3|(lanjutan) tes: keseluruhan ***P < 0.001,="" beberapa="" perbandingan;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib,="" dan="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" semua="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" mikrograf="" confocal="" representatif="" dari="" sel="" wt="" atau="" ko="" hk2="" diperlakukan="" dengan="" dmso,="" 10="" mm-,="" atau="" 50-mm="" alpelisib="" selama="" 16="" jam="" dan="" kemudian="" difiksasi="" dengan="" perbaikan="" golgi="" dan="" diberi="" label="" menggunakan="" m="" ch="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" probe="" (magenta)="" dan="" dapi="" (cyan),="" dengan="" kuantifikasi="" jumlah="" pi(3)p-positif="" puncta="" yang="" terdeteksi="" dalam="" sel="" yang="" diobati="" dengan="" kisaran="" konsentrasi="" alpelisib="" ,="" seperti="" yang="" ditunjukkan,="" menunjukkan="" pi="" (3)="" p-positif="" punctae="" berkurang="" dengan="" cara="" yang="" responsif="" terhadap="" dosis.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240,="" dan="" 215="" sel="" untuk="" kontrol="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso,="" dan="" ko="" 2.5,="" 5,="" 10,="" 25,="" dan="" 50="" mm="" alpelisib,="" masing-masing.="" uji="" kw:="" keseluruhan="" ***p="">< 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" dmso="" wt="" versus="" ko="" dmso,="" dmso="" wt="" versus="" wt="" 10="" dan="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" semua="" ***p=""><0,001; ko="" dmso="" versus="" ko="" 2.5="" dan="" 5="" mm="" alpelisib="" keduanya="" p=""> 0.9999 (tidak signifikan [ns]); KO DMSO versus KO 10 mM alpelisib **P=0.0049; KO DMSO versus KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Mikrograf widefield representatif dari sel WT atau KO HK2 diperlakukan dengan DMSO atau 10 mM alpelisib dan kemudian difiksasi dengan fifiks membran plasma dan diberi imunolabel untuk PI(4,5)P2 (kuning) dan DAPI (sian), dengan kuantifikasi intensitas pelabelan PI(4,5)P2 seluler rata-rata, menunjukkan peningkatan membran plasma PI(4,5)P2 dalam sel KO, yang dikurangi dengan pengobatan alpelisib, khususnya dalam sel KO. N=126, 112, 85, dan 116 sel masing-masing untuk WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO, dan KO alpelisib. Uji KW: keseluruhan ***P < 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" dan="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" keduanya="" ***p="">< 0,001;="" dmso="" wt="" versus="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" mikrograf="" lapangan="" luas="" representatif="" dari="" sel="" wt="" atau="" ko="" hk2="" yang="" diobati="" dengan="" dmso="" atau="" 10="" mm="" alpelisib="" dan="" kemudian="" difiksasi="" dengan="" fifiks="" formaldehida="" 4="" persen="" dan="" diberi="" imunolabel="" untuk="" pi(4,5)p2="" (kuning)="" dan="" dapi="" (sian),="" dengan="" kuantifikasi="" dari="" jumlah="" pi(4,5)p2-puncta="" positif,="" menunjukkan="" peningkatan="" pi(4,5)p2="" puncta="" dalam="" sel="" ko,="" yang="" dikurangi="" dengan="" pengobatan="" alpelisib,="" khususnya="" dalam="" sel="" ko.="" n="75," 65,="" 52,="" dan="" 69="" sel="" masing-masing="" untuk="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso,="" dan="" ko="" alpelisib.="" uji="" kw:="" keseluruhan="" ***p="">< 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" dan="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" keduanya="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, unit sewenang-wenang. Untuk mengoptimalkan tampilan gambar ini, silakan lihat versi online artikel ini di www.kidney-international.org.

Bagaimana phosphoinositide 3-inhibitor kinase alpelisib digunakan untuk sindrom Lowe/penyakit Dent?

1. HASIL

1.1 Inhibitor PI3K Kelas I mengurangi agregasi aktin dalam sel OCRL-KO HK2

Kami menggunakan pengeditan gen CRISPR-Cas9 ke knockout (KO) OCRL di garis sel HK2 untuk memungkinkan pengujian kelas I PI3K (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor pada agregasi aktin karakteristik di kompartemen endolisosomal.^7,9,10,14Western blotting memverifikasi penurunan 98.0± 0.7 persen dalam ekspresi OCRL dalam lisat dari sel KO HK2 (Gambar 1b). OCRL KO merekapitulasi fenotipe keranjang aktin dalam sel HK2, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan tumpang tindih antara F-aktin dan antigen endosom awal 1 (EEA1), diukur pada mikroskop confocal Airyscan z-stacks (Gambar 1c–e). Peningkatan tumpang tindih yang diamati pada sel OCRL KO ini dibalik dengan pengobatan dengan copanlisib (C), PI3K (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor yang menargetkan p110a dan d dan pada tingkat lebih rendah isoform p110b dan g (Gambar 1c). Dengan western blotting ekstrak sel utuh HK2, kami menemukan bahwa PI3K(fosfoinositida 3-kinase)subunit pengatur p110 a, b, dan d semuanya diekspresikan dengan baik dalam sel tipe liar (WT) dan KO, dengan hanya tingkat jejak isoform p110g yang ada (Gambar Tambahan S1A).

Kami membedakan PI3K (fosfoinositida 3-kinase)spesifisitas penghambatan F-aktin menggunakan alpelisib (A), penghambat selektif p110a, dan GSK2636771 (G) dan idelalisib (I), penghambat selektif p110b dan p110d, masing-masing (Gambar Tambahan S1A). Meskipun pengobatan alpelisib memberikan pengurangan serupa dalam polimerisasi aktin endosom dibandingkan dengan copanlisib (Gambar 1d), GSK2636771 dan idealalisib memiliki sedikit efek pada akumulasi aktin (Gambar 1e). Kelas I PI3K (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor tidak memiliki peningkatan toksisitas pada OCRL KO relatif terhadap sel yang tidak dimodifikasi, berdasarkan uji MTT (Gambar Tambahan S1B).

1.2 Alpelisib dan p110a knockdown menyelamatkan fenotipe aktin dalam sel HK2

Untuk studi kami selanjutnya, kami fokus pada alpelisib karena merupakan PI3K yang paling selektif dan paling tidak beracun (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor dikembangkan sejauh ini, dan saat ini digunakan untuk mengobati overaktivasi mosaik PI3K kelas Ia pada anak-anak dengan sindrom PROS/CLOVES.²²Alpelisib mengurangi keranjang aktin dalam sel OCRL KO HK2 dengan cara yang responsif terhadap dosis (Gambar 2a). Efeknya diamati pada dosis 10 mM segera setelah 4 jam setelah pengobatan, tanpa toksisitas yang jelas (Tambahan Gambar S2). Untuk menguji apakah PI3K(fosfoinositida 3-kinase)penghambatan oleh alpelisib adalah sumber penurunan pewarnaan aktin, kami secara khusus mengurangi targetnya, subunit p110a, menggunakan siRNA (Gambar 2b). Dibandingkan dengan pengobatan dengan siRNA kontrol (urutan-diacak), siRNA terhadap p110a menghasilkan penipisan 78,3±4,8 persen dan 68,9±7,7 persen protein p110a dalam sel WT dan OCRL KO HK2, masing-masing, tercermin oleh pengurangan yang signifikan dalam keranjang aktin ( Gambar 2c).

1.3 Penurunan kadar PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2, dan PI(3)P dalam sel HK2 yang diberi perlakuan alpelisib

Untuk memeriksa bagaimana lipid fosfoinositida dipengaruhi oleh OCRL KO dan pengobatan alpelisib, kami menodai sel HK2 dengan antibodi atau domain protein terhadap PI(3,4,5)P3, PI(3)P, dan PI(4,5)P2, menggunakan kondisi fiksasi yang dioptimalkan untuk membran plasma atau pewarnaan intraseluler.^24,25PI(3,4,5)P3 memiliki lokalisasi difus ke membran plasma, dan pengobatan alpelisib (10 mM) menginduksi penurunan pewarnaan yang kuat untuk PI(3,4,5)P3 pada sel WT dan OCRL KO, sebagai diharapkan dari mekanisme aksi dan spesifisitasnya untuk kelas IA PI3K(fosfoinositida 3-kinase)p110a (Gambar 3a). PI(3,4,5)P3 diperkirakan akan mengalami defosforilasi secara progresif karena membran diendositosis dan diperdagangkan ke dalam endosom.^14,26,27Dengan memperbaiki sel sedemikian rupa sehingga PI(3)P intraseluler dipertahankan,²⁵kami menemukan bahwa PI(3)P punctae juga berkurang dengan pengobatan alpelisib (dengan cara yang responsif terhadap dosis yang terlihat dari konsentrasi serendah 10 mm untuk pengobatan 16-jam) di kedua sel WT dan OCRL KO (Gambar 3b dan Gambar Tambahan S2C). Seperti yang diharapkan, KO OCRL dalam sel HK2 menginduksi peningkatan yang nyata dalam kadar PI (4,5) P2 baik pada membran plasma (Gambar 3c) dan intraseluler (Gambar 3d), dibandingkan dengan sel WT.^10,28Pengobatan dengan alpelisib secara nyata mengurangi elevasi PI(4,5)P2 yang dihasilkan oleh OCRL KO di kedua kompartemen, sedangkan itu tidak berpengaruh pada sel WT (Gambar 3c dan d). Alpelisib dilaporkan menghambat PI 4-kinase b dengan konsentrasi penghambatan 50 persen 0,5 mM,¹⁹yang merupakan kemungkinan sumber penurunan PI(4,5)P2. Secara kolektif, data kami menyarankan bahwa alpelisib menghambat perakitan aktin pada endosom OCRL KO melalui efek bispesifik pada level PI (4,5) P2 dan PI (3) P.

Gambar 4|Alpelisib mengurangi cacat aktin Oral di Ocrl . yang dimanusiakan berbudaya^Y/-PTC tikus (m PTC). (a) Mikrograf confocal proyeksi Z intensitas maksimum representatif dari OcrlY/þ atau Ocrl^Y/-m PTC yang diobati dengan dimetilsulfoksida (DMSO) atau 10 mM alpelisib selama 16 jam dan kemudian difiksasi dengan 4 persen formaldehida fifix dan diberi imunolabel untuk aktin (phalloidin) (putih) dan 40,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (biru), dengan kuantifikasi sejauh mana serat stres hadir di setiap kondisi, menunjukkan bahwa serat stres hilang di Ocrl^Y/-m PTC diselamatkan dengan pengobatan alpelisib. Garis menunjukkan mean±SEM, dan titik data menunjukkan setiap wilayah pencitraan: N=5 wilayah pencitraan per kondisi (masing-masing berisi sekitar 15-20 sel). Signifikansi dinilai dengan 1-cara analisis varians (ANOVA) biasa dengan uji perbandingan ganda Holm-Sidak, **P=0.001, beberapa perbandingan; Ocrl Y/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Okrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (tidak signifikan [ns]). Batang=20mm. (b) Rendering permukaan 3D representatif perbesaran tinggi dari Ocrl m PTCs yang diobati dengan DMSO atau 10 mM alpelisib selama 16 jam dan kemudian difiksasi dengan fifiks formaldehida 4 persen dan diberi imunolabel untuk antigen endosom awal 1 (EEA1) (ungu), aktin ( phalloidin, kuning), dan DAPI (biru), dan kuantifikasi yang menggambarkan penyelamatan tumpang tindih aktin-endosom oleh alpelisib. Tampilan perbesaran lebih rendah menunjukkan ikhtisar (lanjutan)

Gambar 4|(lanjutan) wilayah ini ditunjukkan pada Gambar Tambahan S4B dan Film Tambahan S1–S3. Garis menunjukkan mean±SEM. N=42, 47, dan 45 bidang yang dipilih secara acak untuk OcrlY/þ DMSO, Ocrl^Y/-DMSO, dan Ocrl^Y/-kondisi alpelisib, masing-masing, dalam setiap kasus dikumpulkan dari 4 ginjal tikus per kondisi. Signifikansi diuji dengan Kruskal-Wallis (KW) ANOVA dengan uji perbandingan berganda Dunn: keseluruhan ***P < 0.001,="" beberapa="" perbandingan;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO dan Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Batang=1 mm. (c) Mikrograf confocal representatif dari OcrlY/þ atau Ocrl^Y/-m PTC diperlakukan dengan DMSO atau 10-mM alpelisib dan kemudian difiksasi dengan fix Golgi dan diberi label menggunakan probe m Ch-2xFYVE PI(3)P (magenta) dan DAPI (cyan), dengan kuantifikasi jumlah PI(3)P-positif puncta yang terdeteksi dalam sel. N=188, 177, 246, dan 206 sel dari OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO, dan Ocrl^Y/-alpelisib, masing-masing; sel dikumpulkan dari 3 ginjal Oral per kelompok. Uji KW: keseluruhan ***P < 0.001,="" beberapa="" perbandingan;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib, dan Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, semua ***P < 0.001.="" batang="20" mm.="" (d)="" mikrograf="" confocal="" representatif="" dari="" ocrly/þ="" atau="">^Y/-m PTC yang diobati dengan DMSO atau 10 mM alpelisib selama 16 jam kemudian difiksasi dengan 4 persen formaldehida fifix dan diberi imunolabel untuk phosphatidylinositol (PI) 4,5-bifosfat [PI(4,5) P2] (kuning) dan DAPI (cyan), dengan kuantifikasi jumlah PI(4,5)P2-puncta positif, menunjukkan peningkatan PI(4,5)P2 puncta di Ocrl^Y/-sel, yang dikurangi dengan pengobatan alpelisib. N=477, 444, 423, dan 494 dari OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO, dan Ocrl^Y/-alpelisib, masing-masing; sel dikumpulkan dari 3 ginjal Oral per kelompok. Uji KW: keseluruhan ***P < 0.001,="" beberapa="" perbandingan;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib, dan Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, semua ***P < 0.001.="" batang="20" mm.="" untuk="" mengoptimalkan="" tampilan="" gambar="" ini,="" silakan="" lihat="" versi="" online="" artikel="" ini="" di="">

1.4 Alpelisib mengurangi fosfoinositida intraseluler dan mengurangi cacat sitoskeletal di Ocrl^Y/-m PTC

Kami selanjutnya menguji apakah alpelisib memiliki efek yang sama pada sel primer sel PT yang berasal dari model tikus yang kekurangan Ocrl yang dimanusiakan (Ocrl^Y/-), yang merekapitulasi polimerisasi aktin abnormal dan defek endositik yang diamati pada sel yang diturunkan dari pasien.^10,11PTC tikus (m PTC) dinyatakan mirip dengan kelas I PI3K (fosfoinositida 3-kinase) subunit pengatur ke sel HK2 di WT dan Ocrl^Y/-tikus dan menampilkan profil toksisitas yang serupa terhadap alpelisib ketika dinilai dengan uji MTT (Gambar Tambahan S3). Pencitraan dengan mikroskop confocal mengungkapkan gangguan mencolok dari arsitektur serat stres F-aktin normal di m PTC dari Ocrl^Y/-dibandingkan dengan tikus OcrlY / , kemungkinan karena relokasi protein pengatur aktin dari lokasi seluler normalnya ke endosom, karena rakitan besar aktin mengelilingi organel ini dan dianggap sebagai asal dari cacat perdagangan.^10,29Pengobatan Ocrl^Y/- m PTC dengan alpelisib (10 mM) memulihkan arsitektur serat tegangan (Gambar 4a).

Bagaimana phosphoinositide 3-inhibitor kinase alpelisib digunakan untuk sindrom Lowe/penyakit Dent?

Sebagai masalah utama dalamSindrom Lowe dan penyakit Dent2 berkurang perdagangan endosom dan degradasi megalin akibatnya, kami berusaha membedakan aktin endosom dari serat stres. Kami mengumpulkan tumpukan z confocal pemindaian laser di seluruh sel, merekonstruksi pola pewarnaan dalam rendering permukaan 3D, dan menggunakan bentuk/parameter ukuran untuk mengidentifikasi struktur aktin punctate dan sejauh mana mereka tumpang tindih dengan struktur endosom (Gambar Tambahan S4 dan Film S1 –S3). Analisis ini mengungkapkan bahwa pengobatan dengan alpelisib menurunkan polimerisasi F-aktin yang menyimpang pada endosom yang diwarnai dengan EEA1, berbeda dari arsitektur serat stres (Gambar 4b). m PTC yang diturunkan dari Ocrl^Y/-tikus menunjukkan perubahan signifikan dalam pewarnaan intraseluler untuk PI(3)P (menurun) dan PI(4,5)P2 (meningkat), dibandingkan dengan m PTC dari tikus WT OcrlY/þ (Gambar 4c dan d). Perawatan m PTC dari Ocrl^Y/- tikus dengan alpelisib menghasilkan penurunan yang signifikan dalam pewarnaan PI(3)P dan PI(4,5)P2 intraseluler (Gambar 4c dan d).

1.5 Alpelisib meningkatkan penyerapan endositik di Ocrl^Y/-m PTC

Kami selanjutnya menilai apakah efek alpelisib pada defek sitoskeletal dan vesikular yang diamati pada m PTC menghasilkan perubahan dalam kapasitas serapan endositik. Untuk membedakan efek alpelisib pada pengikatan dan/atau internalisasi ligan, m PTC pertama-tama diinkubasi dengan albumin serum sapi berlabel (BSA), untuk menginduksi pengikatan probe dengan reseptor endositik, dan kemudian diinkubasi dengan media pertumbuhan, untuk ikuti internalisasi albumin (Gambar 5a). Ocrl^Y/-sel menunjukkan pengikatan membran plasma yang lebih rendah dari Alexa 488-albumin serum sapi bersama dengan gangguan internalisasi albumin dibandingkan dengan sel OcrlY/þ. Pengobatan dengan alpelisib menyelamatkan pengikatan dan penyerapan albumin di Ocrl^Y/-sel, dengan 50 persen penyelamatan keseluruhan serapan endositik (Gambar 5b dan c). Data ini didukung oleh pengukuran total albumin uptake (Angka Tambahan S5a dan b). Kami mencatat bahwa rasio albumin serum Alexa 488-yang diinternalisasi/terikat tetap serupa antara kondisi yang berbeda (Gambar 5d), menyiratkan bahwa penyerapan albumin yang berkurang terutama disebabkan oleh gangguan pengikatan daripada proses internalisasi yang rusak.

1.6 Alpelisib meningkatkan disfungsi PT dan endositosis yang dimediasi reseptor di Ocrl^Y/- tikus

Kami menguji potensi efek terapi alpelisib pada disfungsi PT in vivo. Tikus oral diberikan dengan kendaraan atau alpelisib (50 mg / kg berat badan per hari) dengan gavage oral selama 6 minggu (Gambar 6a). Regimen ini dipilih sesuai dengan penelitian in vivo sebelumnya yang menunjukkan kemanjuran dan keamanan.^22,30Sejalan dengan pemberian alpelisib yang diketahui menyebabkan resistensi insulin dan hiperglikemia,²²pengobatan alpelisib menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam glikosuria di kedua Ocrl Y/þ dan Oral^Y/-tikus, yang dapat dianggap sebagai biomarker untuk dosis obat (Tabel Tambahan S1). Setelah 6 minggu pengobatan alpelisib, Ocrl^Y/-tikus menunjukkan penurunan yang signifikan dalam ekskresi urin dari protein LMW CC16 (-34 persen) dan albumin (-38 persen), dibandingkan dengan kontrol yang diobati dengan kendaraan (Gambar 6b ​​dan c), sedangkan volume urin dan parameter lainnya tidak terpengaruh (Tabel Tambahan S1). Tikus yang diobati dengan Alpelisib dari kedua genotipe menunjukkan penurunan yang serupa dalam tingkat pertumbuhan relatif terhadap tikus kontrol, seperti yang dijelaskan sebelumnya.²²Namun demikian, baik tikus kendaraan maupun tikus yang diobati mengalami kenaikan berat badan, menunjukkan bahwa obat tersebut tidak terlalu mempengaruhi perkembangan pascakelahiran (Gambar 6d dan Tabel Tambahan S1).

Untuk menguji apakah efek alpelisib pada proteinuria LMW mencerminkan pemulihan endositosis yang dimediasi reseptor dalam sel PT, kami mengikuti penyerapan in vivo dari Cy5-berlabel b-laktoglobulin dalam ginjal tikus. Ocrl . yang dirawat dengan Alpelisib^Y/-tikus menunjukkan penyelamatan signifikan dari serapan b-laktoglobulin berlabel Cy5-, dekat dengan tingkat internalisasi yang diamati pada tikus OcrlY / yang dirawat dengan kendaraan (Gambar 6e). Ini dicerminkan oleh penyelamatan yang signifikan dalam ekspresi megalin reseptor endositik dalam sel PT, seperti yang diamati oleh imunolabeling dan western blotting dari lisat ginjal Ocrl yang diobati dengan alpelisib.^Y/-tikus; perhatikan bahwa tidak ada perubahan ekspresi penanda PT AQP1 (Gambar 6f dan g dan Gambar Tambahan S5C dan D). Data ini menunjukkan bahwa PI3K(fosfoinositida 3-kinase)penghambat alpelisibmenginduksi peningkatan substansial dari mesin endositik PT dan mengurangi proteinuria LMW dalam model tikus manusiawi untuk sindrom Lowe.

Gambar 5|Alpelisib meningkatkan penyerapan endositik dari Ocrl . yang dimanusiakan^Y/-PTC tikus (m PTC). (a) Skema yang menggambarkan eksperimen pengejaran denyut yang digunakan untuk menguji pengikatan dan internalisasi Alexa 488-albumin serum sapi (BSA) ke dalam m PTC. Sel terpapar Alexa 488-BSA (0.2 mg/ml) selama 1 jam pada 4 derajat untuk memungkinkan BSA mengikat reseptor permukaan sel (denyut) dan kemudian dihangatkan hingga 37 derajat dalam media sel selama 20 menit sebelum fiksasi untuk memungkinkan internalisasi ligan (pengejaran). (b) Mikrograf confocal representatif dari OcrlY/þ atau Ocrl^Y/-m PTC yang dirawat dengan dimetilsulfoksida (DMSO) atau 10 mM alpelisib selama 16 jam dan mengalami eksperimen pengejaran pulsa 488-BSA (hijau), sebelum difiksasi dan diberi label untuk 40,6-diamidino{ {6}}fenilindole (DAPI) (biru). Fase pulsa percobaan ditampilkan di panel atas untuk setiap kondisi, dengan pengejaran di bawah. Batang=20 mm. (c) Kuantifikasi permukaan sel Alexa 488-BSA (i) dan Alexa 488-BSA (ii) yang terinternalisasi, dievaluasi sebagai intensitas fluoresensi FL rata-rata per sel. Alpelisib menyelamatkan pengikatan dan internalisasi BSA yang diselamatkan yang diamati di Ocrl^Y/-sel. N=209, 228, 186, dan 196 sel untuk OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO, dan Ocrl^Y/-kondisi alpelisib, masing-masing dalam (i) dan N=203, 183, 199, dan 233 sel untuk OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO, dan Ocrl^Y/-kondisi alpelisib, masing-masing dalam (ii), dalam setiap kasus dikumpulkan dari 2 ginjal tikus per kondisi; setiap titik data mewakili intensitas fluoresensi FL rata-rata dalam sel individu. Signifikansi diuji dengan Kruskal-Wallis (KW) analysis of variance (ANOVA) dengan uji perbandingan berganda Dunn: untuk (i) permukaan sel BSA, keseluruhan ***P < 0.001,="" beberapa="" perbandingan:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO dan Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (tidak="" signifikan="" [ns]);="" untuk="" (ii)="" bsa="" yang="" diinternalisasi,="" keseluruhan="" ***p="">< 0,001,="" beberapa="" perbandingan:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO dan Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" kuantifikasi="" rasio="" antara="" permukaan="" sel="" alexa="" 488-="" bsa="" dan="" intensitas="" fluoresensi="" alexa="" 488-bsa="" fl="" yang="" diinternalisasi,="" menunjukkan="" tidak="" ada="" perbedaan="" rasio="" yang="" signifikan="" antara="" setiap="" kondisi.="" setiap="" titik="" mewakili="" rata-rata="" rasio="" dalam="" bidang="" yang="" berisi="" sekitar="" 15-20="" sel="" (n="13," 13,="" 10,="" dan="" 11="" bidang="" yang="" dipilih="" secara="" acak="" untuk="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO, dan Ocrl^Y/-kondisi alpelisib, masing-masing, dalam setiap kasus dikumpulkan dari 2 ginjal tikus per kondisi). Signifikansi diuji oleh KW ANOVA dengan uji perbandingan ganda Dunn: keseluruhan P=0.46 (ns), perbandingan ganda: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO dan Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Untuk mengoptimalkan tampilan gambar ini, silakan lihat versi online artikel ini di www.kidney-international.org.

Gambar 6|Alpelisib meningkatkan fungsi tubulus proksimal (PT) tikus OcrlY/L, memulihkan serapan ligan dan ekspresi megalin. (a) Pengaturan eksperimental. Tikus oral dirawat selama 6 minggu dengan dosis oral harian karboksimetilselulosa 1 persen (kendaraan) atau alpelisib (50 mg/kg berat badan). Pada hari terakhir perlakuan, mencit diinjeksi dengan Cy5-b-lactoglobulin (N=6 Ocrl^Y/-, atau 8 Okrl^Y/-tikus per kelompok). (b–d) Nilai D yang ditunjukkan menunjukkan perubahan rata-rata dari BL ke D42 untuk kondisi ± SEM. (b) Protein sel Clara 16 (CC16), (c) keluaran urin albumin (keduanya dalam waktu 15 jam), dan (d) massa tubuh diukur pada tikus OcrlY/- yang diobati dengan kendaraan atau alpelisib pada titik waktu yang ditunjukkan. Setiap titik mewakili 1 mouse. Signifikansi dinilai dengan 2-uji-t Student berpasangan berekor; dalam (b) CC16 (lanjutan)

Gambar 6|(lanjutan) perubahan output relatif terhadap baseline; kendaraan, P=0.9802 (tidak signifikan [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; dalam (c) perubahan keluaran albumin relatif terhadap baseline; kendaraan, P=0.0502 (ns), alpelisib, ***P 0,0006; dalam (d) perubahan massa tubuh relatif terhadap baseline; kendaraan, ***P < 0,0001,="" alpelisib,="" **p="0.0083." (e)="" mikrograf="" confocal="" representatif="" yang="" menunjukkan="" cy5-berlabel="" b-lactoglobulin="" (magenta)="" 15="" menit="" setelah="" injeksi="" vena="" ekor="" dan="" diberi="" label="" untuk="" 40,6-diamidino-2-phenylindole="" (dapi)="" (cyan),="" ditambah="" kuantifikasi="" sinyal="" fluoresen="" fl="" yang="" sesuai="" dari="" ginjal="" tikus="" ocrl="" (n="412," 500,="" dan="" 588="" tubulus,="" masing-masing,="" untuk="" kendaraan="" ocrly/þþ,="">^Y/-kendaraan, dan Ocrl^Y/-alpelisib) untuk 3 ekor mencit per kelompok perlakuan. Penyerapan b-laktoglobulin diselamatkan dengan pengobatan alpelisib. Batang 20 mm. Dalam kuantifikasi, setiap titik mewakili intensitas fluoresensi FL yang dinormalisasi oleh area tubulus; data yang diplot menunjukkan mean ± SEM. Signifikansi dinilai dengan uji Kruskal-Wallis (KW) diikuti dengan uji perbandingan berganda Dunn; ***P < 0,001,="" beberapa="" perbandingan;="" ocrly/þþ="" kendaraan="" versus="">^Y/-kendaraan dan Ocrl^Y/-kendaraan versus Ocrl^Y/-alpelisib, keduanya ***P < 0.001.="" (="" f="" )="" western="" blotting="" dan="" analisis="" densitometri="" kadar="" megalin="" di="" seluruh="" lisat="" ginjal="" dari="" tikus="" oral.="" a-tubulin="" digunakan="" sebagai="" kontrol="" pemuatan.="" pengurangan="" ekspresi="" megalin="" di="">^Y/-diselamatkan oleh alpelisib. Dalam kuantifikasi analisis densitometri, setiap titik mewakili 1 tikus (N=4 kendaraan OcrlY/þþ dan Ocrl^Y/-kendaraan dan N=3 Ocrl^Y/-tikus alpelisib); garis menunjukkan mean±SEM. Signifikansi dinilai dengan 2-uji-t Student tidak berpasangan berekor: kendaraan OcrlY/þþ versus Ocrl^Y/-kendaraan; **P 0.0057, Ocrl^Y/-kendaraan versus Ocrl^Y/- alpelisib, *P=0.0246. (g) Mikrograf confocal representatif dengan inset pembesaran tinggi dan kuantifikasi intensitas megalin (kuning) di AQP1þ PTs (magenta) dari ginjal Oral juga diberi label untuk DAPI (cyan) yang menggambarkan penyelamatan level megalin setelah pengobatan alpelisib. Batang=20 mm. Dalam kuantifikasi, setiap titik mewakili intensitas fluoresensi FL yang dinormalisasi oleh area tubulus; data yang diplot menunjukkan mean±SEM; N=142, 191, dan 266 tubulus, masing-masing, untuk kendaraan OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-kendaraan, dan Ocrl^Y/-alpelisib untuk 3 ekor mencit per kelompok perlakuan. Signifikansi dinilai dengan analisis varians KW diikuti dengan uji perbandingan berganda Dunn; keseluruhan ***P < 0.001,="" beberapa="" perbandingan;="" ocrly/þþ="" kendaraan="" versus="">^Y/-kendaraan dan Ocrl^Y/-kendaraan versus Ocrl^Y/-alpelisib, keduanya ***P < 0.001.="" untuk="" mengoptimalkan="" tampilan="" gambar="" ini,="" silakan="" lihat="" versi="" online="" artikel="" ini="" di="">

Bagaimana phosphoinositide 3-inhibitor kinase alpelisib digunakan untuk sindrom Lowe/penyakit Dent?

2. DISKUSI

Saat ini tidak ada pengobatan untuk meringankan endositosis yang rusak yang menyebabkan disfungsi PT diSindrom Lowe dan penyakit Dent2. Temuan kami mengungkapkan bahwa alpelisib mengurangi fenotipe aktin yang menyimpang dengan mengurangi kadar PI(4,5)P2 dan PI(3)P, menyebabkan peningkatan substansial dari mesin endositik dan kapasitas penyerapan dalam sistem seluler dan model tikus manusiawi untuk Sindrom Lowe/Penyakit Dent 2. Hasil ini mendukung hubungan antara lipid fosfoinositida, polimerisasi aktin, dan perdagangan endositik, dengan relevansi langsung untuk sel epitel yang sangat aktif yang terlibat dalam proses homeostatik penting (Gambar 7). Mengingat kurangnya terapi yang efektif dan keamanan yang nyata dari kelas PI3K ini (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor, alpelisib adalah kandidat yang menjanjikan untuk repurposing obat dalamSindrom Lowe dan penyakit Dent.

Proteinuria LMW adalah fitur yang paling konsisten ditemui pada pasien denganSindrom Lowe dan penyakit Dent2 karena menonaktifkan mutasi pada OCRL.⁴Protein LMW ini dapat dengan mudah dideteksi dan dikuantifikasi, menawarkan biomarker setia dari endositosis yang diperantarai reseptor yang rusak di sel PT.1 Proteinuria LMW sangat relevan, karena terdeteksi lebih konsisten dan sering lebih awal daripada zat terlarut lainnya (misalnya, glukosa, fosfat, asam amino) menjadi bagian dari "sindrom Fanconi ginjal" klasik—setidaknya pada kelainan kongenital jalur endolisosom.¹Di sini, kami menunjukkan bahwa alpelisib menyelamatkan kapasitas serapan endositik apikal sel PT in vitro dan in vivo, karena tingkat reseptor megalin yang dipulihkan pada membran plasma. Efek ini dicerminkan oleh pengurangan yang signifikan dalam kehilangan protein LMW (CC16 dan albumin) urin di Ocrl^Y/-mencit yang diberi alpelisib selama 6 minggu. Efek alpelisib ini telah diamati pada m PTC, yang menjaga diferensiasi apikalnya dan sangat cocok untuk menyelidiki endositosis yang dimediasi reseptor dalam fisiologi dan penyakit.⁹ Secara khusus, kami memperoleh m PTC dari model tikus manusiawi yang mengekspresikan INPP5B manusia di Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-latar belakang, yang memungkinkan kami untuk menyelidiki konsekuensi spesifik dari hilangnya aktivitas OCRL.^11,23

Penyelamatan endositosis oleh alpelisib dijelaskan oleh efeknya pada mesin aktin, dibuktikan dengan jelas dalam sel OCRL KO HK2 dan m PTC. Pengamatan kami dengan demikian mengkonfirmasi dan memperluas penelitian sebelumnya yang menunjukkan hubungan antara kontrol keseimbangan fosfoinositida dan F-aktin di jalur endosom awal pada pasien OCRL dan sel KO.^7,10Hilangnya fungsional aktivitas OCRL merusak degradasi PI (4,5) P2, yang, pada gilirannya, menyebabkan kegagalan untuk membuka vesikel berlapis clathrin yang mengakibatkan organel endosom yang menyimpang dalam berbagai jenis sel termasuk sel PT.^7-10Kami baru-baru ini menunjukkan bahwa kelebihan F-aktin menurunkan daur ulang megalin reseptor multiligand ke membran apikal sel PT, menyebabkan endositosis yang rusak dan proteinuria LMW.¹¹

Data kami menunjukkan bahwa mekanisme kerja alpelisib pada aktin endosom muncul dari efek bispesifik penghambatan alpelisib: pertama pada produksi PI(3,4,5)P3 dan konversinya menjadi PI(3)P, dan kedua pada produksi PI(4,5)P2. Penurunan kadar PI(4,5)P2 secara langsung melawan defisiensi OCRL dan sesuai dengan penelitian sebelumnya yang mengurangi kelebihan aktin dan meningkatkan penghabisan endositik dengan penurunan kadar fosfatidilinositol 4-fosfat 5-kinase , enzim yang menghasilkan PI(4,5)P2.¹⁰Alpelisib memiliki 0.5 mM 50 persen konsentrasi penghambatan pada PI(4,5)P2 yang menghasilkan kinase PI4Kb, yang mungkin bertanggung jawab, atau dapat dihasilkan dari efek yang lebih umum pada keseimbangan fosfoinositida yang dihasilkan dari kombinasi OCRL pengobatan KO dan alpelisib. Kami telah mengidentifikasi bahwa kelas IA PI3K(fosfoinositida 3-kinase)penghambatan oleh alpelisib relevan dengan penghambatan aktin karena penipisan p110a yang dimediasi siRNA menghambat akumulasi aktin yang serupa dengan pengobatan alpelisib dan copanlisib (yang tidak dilaporkan menghambat PI4Ks). Dalam sel RPE kami sebelumnya telah mengamati bahwa siRNA dari INPP4A, yang mengubah PI(3,4)P2 menjadi PI(3)P, menghambat perakitan aktin dalam sel OCRL KO, menyediakan jalur dari penghambatan PI(3,4,5) Produksi P3 terhadap penurunan PI(3)P endosomal. Kami menunjukkan bahwa beberapa PI(3)P tetap, mungkin kumpulan yang diproduksi pada endosom awal oleh PI3K kelas III, Vps34 karena kami menemukan bahwa perdagangan endosom ditingkatkan daripada ditekan oleh pengobatan alpelisib. Koregulasi kompleks metabolisme PI dan relevansinya untuk inaktivasi OCRL juga telah disorot dalam penelitian terbaru di mana fungsi nonkatalitik dari phosphoinositide 3- phosphatase PTEN mengaktifkan PI (4,5) degradasi P2 melalui PLCXD, mengurangi fenotipe seluler dan penyerapan ligan dalam model ikan zebra.³¹

Pengurangan fenotipe aktin dengan penurunan kadar PI(4,5)P2 dan PI(3)P dengan pengobatan alpelisib sesuai dengan aksi sinergis PI(4,5)P2 dan PI(3)P dalam merekrut SNX9 untuk mengaktifkan mesin aktin di endosom Ocrl,¹⁴menunjukkan kecocokan spesifisitas alpelisib yang sangat efektif untuk memanipulasi regulasi molekuler aktivasi aktin pada endosom. Pada gilirannya, seperti yang ditunjukkan sebelumnya, pengurangan perakitan aktin endosom, pada gilirannya, mengarah pada peningkatan endositosis PT dalam sel yang kekurangan OCRL.¹⁰Karakterisasi lebih lanjut akan diperlukan untuk lebih memahami apakah regulasi aktin melalui metabolisme fosfoinositida adalah sumber sebenarnya dari efek terapeutik yang kami amati dengan alpelisib di Ocrl^Y/-model tikus. Karena kelas I PI3K(fosfoinositida 3-kinase)mengatur jalur yang mengontrol pertumbuhan sel, proliferasi, kelangsungan hidup, metabolisme, dan autophagy,³²kami tidak dapat mengecualikan bahwa penyelamatan endositik disebabkan oleh efek pada PI(3,4,5)P3 secara langsung dan efek gabungan pada jalur lain yang dimodulasi oleh PI3K kelas I. Lebih banyak pekerjaan juga diperlukan untuk menguji apakah PI3K(fosfoinositida 3-kinase)inhibitor juga dapat meringankan neurologis dan manifestasi klinis lainnya dari pasien yang menyimpan mutasi OCRL.⁴

Pengalaman alpelisib baru-baru ini pada pasien anak dengan sindrom PROS/CLOVES menunjukkan bahwa obat tersebut berpotensi untuk ditoleransi dengan baik. Alpelisib diambil secara oral, selektif menargetkan isoform PI3K(fosfoinositida 3-kinase)kelas I, dan menunjukkan profil toksisitas minor dibandingkan dengan inhibitor pan-PI3K. Karena alpelisib tidak sepenuhnya memblokir PI3K(fosfoinositida 3-kinase)aktivitas, sehingga mempertahankan fungsi jalur pensinyalan, mungkin sangat cocok untuk penggunaan jangka panjang. Yang menarik, hiperglikemia yang timbul dari penggunaan alpelisib dapat dikelola dengan perubahan pola makan.²²Karena disfungsi PT adalah manifestasi pertama dari penyakit ginjal yang diamati pada bayi muda dengan penyakit Dent 2 dan sindrom Lowe, pengobatan dini disfungsi PT tersebut, yang mengarah pada perbaikan profil metabolisme dan pertumbuhan, oleh karena itu dapat memperlambat perkembangan penyakit ginjal kronis dan karenanya memiliki dampak yang signifikan pada umur dan kualitas hidup.³³Meskipun manifestasi penyakit dari mutasi OCRL sangat luas, penelitian terbaru berdasarkan kohort besar pasien genotipe dengan sindrom Lowe penyakit Dent 2 tidak membuktikan efek yang signifikan dari jenis mutasi atau lokasi mutasi pada kelangsungan hidup ginjal.³⁴Secara kolektif, data kami menyoroti potensi penggunaan kembali alpelisib untuk mengobati disfungsi PT pada sindrom Lowe / penyakit Dent 2, sehingga memberikan dasar untuk penyebaran yang cepat dan hemat biaya dalam uji klinis manusia.

3. METODE

3.1 Rincian lengkap dapat ditemukan di Metode Tambahan.

Sel HK2 diperlakukan dengan copanlisib, alpelisib, GSK2636771, atau idelalisib pada konsentrasi yang ditunjukkan selama 16 jam kecuali dinyatakan lain. Protein diekstraksi menggunakan metode standar dari sel atau jaringan ginjal dan western blotting dilakukan dengan menggunakan antibodi yang diterbitkan atau tersedia secara komersial. knockdown siRNA dilakukan menggunakan 2 transfeksi 72 dan 24 jam sebelum analisis. Kami menggunakan OcrlY/þ yang sesuai dengan usia dan gender; Inpp5b^{- /-}; dan Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- teman-teman tikus yang menyimpan ekspresi BAC-INPP5B. Kultur primer m PTC dihasilkan dari ginjal yang diambil dari tikus Ocrl berumur 8 minggu dan kapasitas endositik PTC m Oral dinilai dengan mengukur serapan albumin. Perlakuan Alpelisib adalah 10 mM selama 16 jam kecuali dinyatakan lain. Penyerapan albumin dalam m PTC dinilai menggunakan protokol "pengejaran denyut" untuk menilai pengikatan apikal dan serapan yang dihasilkan. m PTC diwarnai semalaman dengan antibodi primer yang sesuai dan selama 45 menit dengan antibodi sekunder terkonjugasi FL fluorofor yang sesuai dan/atau Alexa-488 Phalloidin. Pewarnaan PI(3)P pada m PTC dilakukan menggunakan probe domain FYVE. Analisis gambar dilakukan dengan CellProfifiler, menggunakan saluran khusus untuk mengukur tumpang tindih aktin/EEA1 dan jumlah puncta, dan dengan ImageJ untuk mengukur intensitas imunofluoresensi dan tepi yang terdeteksi untuk menghitung skor serat stres. Data kuantitatif dinyatakan sebagai rata-rata ± kesalahan standar rata-rata. Untuk percobaan in vivo, mencit umur 6 minggu diberi perlakuan kendaraan atau alpelisib 50 mg/kg BB. Urine dikumpulkan setiap 14 hari dan hewan dikorbankan setelah 42 hari pengobatan, dengan darah dan ginjal diambil. Kapasitas endositik PT mencit Oral diperiksa dengan mengukur serapan b-laktoglobulin.

4. PENGUNGKAPAN

JLG mendapat dana dari AstraZeneca untuk beasiswa di labnya. SPJ berada di dewan penasihat dan memiliki kepemilikan ekuitas Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics, dan Adrestia Therapeutics, dan merupakan Science Partner untuk Ahren Innovation Capital. Semua penulis lain menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.

5. UCAPAN TERIMA KASIH

Pekerjaan ini didukung oleh European Research Council Grant 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Development Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) kepada JLG, dan Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z kepada SPJ, dan kami berterima kasih kepada Gurdon Institute yang mendanai dari Wellcome Trust (092096) dan CRUK (C6946/A14492). Kami berterima kasih kepada Cystinosis Research Foundation (Irvine, CA), Swiss National Science Foundation (project grant 310030_189044), program prioritas penelitian klinis (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zurich) dari UZH, Swiss

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) untuk dukungan, dan NIDDK/NIH dan Lowe Syndrome Trust/UK untuk mendukung perkembangan tikus Oral. Kami mengucapkan terima kasih kepada Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation dan UCSF, San Francisco, CA) dan Maria Antonietta De Matteis (Institut Genetika dan Kedokteran Telethon, Universitas Federico II Naples, Naples, Italia) karena menyediakan para pendiri koloni tikus Oral;

dan Eric Olinger (UZH, Zurich) untuk diskusi yang bermanfaat. Kami berterima kasih kepada Nadine Näegele dan Daniela Nieri yang telah memberikan bantuan teknis selama pengumpulan dan analisis urin; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris) untuk berbagi dengan kami protokol terperinci untuk persiapan Alpelisib untuk perawatan in vivo; dan Renata Kozyraki dan Pierre Verroust untuk menyediakan reagen. Kami juga berterima kasih kepada Pusat Mikroskopi dan Analisis Gambar Universitas Zurich (Zurich, Swiss) dan fasilitas fisiologi hewan pengerat integratif (ZIRP) Zurich untuk menyediakan peralatan untuk akuisisi pencitraan dan dukungan teknis selama percobaan in vivo.

Bagaimana phosphoinositide 3-inhibitor kinase alpelisib digunakan untuk sindrom Lowe/penyakit Dent?

6. BAHAN TAMBAHAN

File Tambahan (PDF)

Metode dan Referensi Tambahan.

Tabel S1. Berat badan, urin, dan parameter darah dari waktu ke waktu pada tikus Oral yang diobati dengan alpelisib atau kendaraan.

Gambar S1. ekspresi isoform p110 dan uji sitotoksisitas respons dosis obat dalam sel HK2.

Gambar 2. PI3Kpenghambat alpelisibmengembalikan tumpang tindih aktin-endosom dan mengurangi tingkat PI(3)P dengan cara yang responsif terhadap dosis 4 jam setelah perawatan obat dalam sel HK2.

Gambar S3. ekspresi isoform p110 dan toksisitas alpelisib dalam mPTC Ocrl.

Gambar S4. Alur kerja analisis tumpang tindih EEA1/aktin dalam mPTC Ocrl.

Gambar S5. Alpelisib mengembalikan penyerapan albumin di Ocrl^Y/-mPTC. Ekspresi aqp1 tidak terpengaruh. File Tambahan (Film)

Film S1. Render Imaris 3D dari EEA1/aktin tumpang tindih dalam OcrlY/þ mPTC yang diobati dengan DMSO. Render permukaan 3D representatif dari tumpukan confocal OcrlY/þ mPTCs yang diobati dengan DMSO selama 16 jam kemudian difiksasi dengan fifix formaldehida 4 persen dan diberi imunolabel untuk EEA1 (ungu), aktin (phalloidin; kuning), dan DAPI (biru), menggambarkan sedikit asosiasi aktin/endosomal. Batang=5 mm.

Film S2. Render Imaris 3D dari EEA1/aktin tumpang tindih di Ocrl^Y/-mPTC yang diobati dengan DMSO. Render permukaan 3D representatif dari tumpukan confocal OcrlY/– mPTCs yang diobati dengan DMSO selama 16 jam kemudian difiksasi dengan fifix formaldehida 4 persen dan diberi imunolabel untuk EEA1 (ungu), aktin (phalloidin; kuning), dan DAPI (biru), menggambarkan belang-belang aktin yang berasosiasi di dekat struktur endosom. Batang=5mm.

Film S3. Render Imaris 3D dari EEA1/aktin tumpang tindih di Ocrl^Y/- mPTC diobati dengan alpelisib. Render permukaan 3D representatif dari tumpukan confocal OcrlY/– mPTC yang diobati dengan 10 mM alpelisib selama 16 jam kemudian difiksasi dengan 4 persen fifiks formaldehida dan diberi imunolabel untuk EEA1 (ungu), aktin (phalloidin; kuning), dan DAPI (biru) , menggambarkan penyelamatan struktur belang-belang aktin di sekitar endosom. Batang=5 mm.

REFERENSI

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Belajar fisiologi dari kelainan ginjal bawaan. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Sindrom Loi M. Lowe. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Sindrom Lowe. Dalam: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, dkk., eds. GeneReviews® [internet]. Seattle (WA): Universitas Washington, Seattle; 1993-2020. Tersedia di: HTTPS://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Diterbitkan 24 Juli 2001; Diperbarui 18 April 2019. Diakses 8 Agustus 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. OCRL 5-fosfatase dalamSindrom Lowe dan penyakit Dent2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Pengangkut klorida dan endositosis yang dimediasi reseptor di tubulus proksimal ginjal. J. Fisiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Kekurangan protein pada sindrom Lowe adalah phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 5- phosphatase. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M, dkk. Peran OCRL dalam dinamika dan uncoating pit berlapis clathrin diungkapkan oleh penelitian sel sindrom Lowe. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Fungsi seluler dan fisiologis protein sindrom Lowe OCRL1. Lalu lintas. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, dkk. Fusi autophagosome-lisosom memicu respons lisosom yang dimediasi oleh TLR9 dan dikendalikan oleh OCRL. Biol Sel Nat. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, dkk. OCRL mengontrol perdagangan melalui endosom awal melalui regulasi aktin endosom yang bergantung pada PtdIns4,5P(2). EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A, dkk. Kekurangan OCRL merusak fungsi endolisosomal dalam model tikus manusiawi untukSindrom Lowe dan penyakit Dent. Hum Mol Gen. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, dkk. P-Rex1, a PtdIns(3,4,5)P3- dan faktor pertukaran guanin-nukleotida yang diatur Gbetagamma untuk Rac. Sel. 2002;108:809–821.

13. Gallop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinositida dan kelengkungan membran mengubah mode polimerisasi aktin melalui perekrutan selektif Toca-1 dan Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Surat Perintah A, Holst MR, dkk. Kontrol polimerisasi aktin melalui kebetulan fosfoinositida dan kelengkungan membran yang tinggi. J Sel Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T, dkk. PTEN mengatur pensinyalan PI(3,4)P2 hilir kelas I PI3K(fosfoinositida 3-kinase). Sel Mol. 2017;68:566–580,e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, dkk. Lokalisasi phosphatidylinositol 3-fosfat dalam sel ragi dan mamalia. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, dkk. PI3K (fosfoinositida 3-kinase)jalur penyakit pada manusia. Sel. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Banteng CO, dkk. BAY 80-6946 adalah PI3K intravena yang sangat selektif (fosfoinositida 3-kinase)inhibitor dengan aktivitas p110alpha dan p110delta yang kuat dalam garis sel tumor dan model xenograft. Kanker Mol Ada. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, dkk. Karakterisasi novel dan PI3K spesifik (fosfoinositida 3-kinase)alpha inhibitor NVP-BYL719 dan pengembangan strategi stratifikasi pasien untuk uji klinis. Kanker Mol Ada. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, dkk. Penemuan NVP-BYL719 inhibitor alfa phosphatidylinositol-3 kuat dan selektif dipilih untuk evaluasi klinis. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovsky G, dkk. Alpelisib untuk kanker payudara stadium lanjut yang bermutasi PIK3CA, reseptor hormon positif. N Engl J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH, dkk. Terapi yang ditargetkan pada pasien dengan sindrom pertumbuhan berlebih terkait PIK3CA. Alam. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, dkk. Model tikus untuk sindrom Lowe/Penyakit Penyok 2 tubulopati ginjal. J Am Soc Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J, dkk. Antibodi monoklonal untuk memvisualisasikan PtdIns(3,4,5)P(3) dalam sel. J Histokimia Sitokimia. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Teknik imunositokimia mengungkapkan beberapa, kumpulan seluler yang berbeda dari PtdIns4P dan PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, dkk. Dinamika konversi fosfoinositida dalam lalu lintas endositik yang dimediasi clathrin. Alam. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Y Miskin, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosfoinositida 3-kinase)isoform dalam pensinyalan sel dan perdagangan vesikel. Nat Rev Mol Sel Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P, dkk. Fibroblas bermutasi OCRL dari pasien dengan penyakit Dent-2 menunjukkan variabilitas fenotip independen INPP5B relatif terhadap sel sindrom Lowe. Hum Mol Gen. 2015;24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. Defisiensi PIP2 5-fosfatase pada sindrom Lowe mempengaruhi polimerisasi aktin. Am J Hum Genet. 2002;71:1420– 1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, dkk. PI3K khusus tumor (fosfoinositida 3-kinase)penghambatan melalui pengiriman bertarget nanopartikel pada karsinoma sel skuamosa kepala dan leher. Komunitas Nat. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, dkk. PTEN mengurangi PtdIns (4,5) P2 endosom dengan cara yang tidak bergantung pada fosfatase melalui jalur PLC. J Sel Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. Koordinasi antara RAB GTPase dan regulasi dan fungsi fosfoinositida. Nat Rev Mol Sel Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, dkk. Penyakit ginjal warisan langka: tantangan, peluang, dan perspektif. Lanset. 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, dkk. Hasil ginjal jangka panjang pada anak-anak dengan mutasi OCRL: analisis retrospektif dari kohort internasional yang besar. Transplantasi Nephrol Dial. 2018;33:85–94.

Dari: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Hak Cipta 2020, International Society of Nephrology. Diterbitkan oleh Elsevier Inc. Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institut, Universitas Cambridge, Jalan Lapangan Tenis, Cambridge CB2 1QN, Inggris. Email: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; atau Olivier Devuyst, Institut Fisiologi, Universitas Zurich, Zurich, Swiss. Email: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Para penulis ini berkontribusi sama untuk pekerjaan ini.⁶Para penulis ini ikut mengarahkan penelitian ini. Diterima 8 Agustus 2019; direvisi 1 Mei 2020; diterima 15 Mei 2020; diterbitkan online 9 September 2020