Phloretin Menekan Peradangan Saraf Dengan Aktivasi Nrf2 yang Dimediasi Autophagy di Makrofag

Kontak:{0}}

Abstrak

Latar belakang: Makrofag memainkan peran ganda dalam gangguan neuroinflamasi seperti multiple sclerosis (MS). Mereka terlibat dalam onset dan perkembangan lesi tetapi juga dapat meningkatkan resolusiperadangandan perbaikan jaringan yang rusak. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki jika dan bagaimanafloretina, flavonoid berlimpah hadir dalam apel dan stroberi, menurunkan fenotipe inflamasi makrofag dan menekanperadangan saraf.

Metode: Perubahan transkripsi dalam makrofag yang diturunkan dari sumsum tulang tikus pada paparan phloretin dinilai dengan sekuensing RNA massal. Jalur yang mendasari terkait dengan peradangan, respons stres oksidatif, dan autophagy divalidasi oleh PCR kuantitatif, uji fluoresen dan absorbansi, tikus knockout faktor eritroid nuklir terkait 2-faktor 2 (Nrf2), western blot, dan imunofluoresensi. Model ensefalomielitis autoimun eksperimental (EAE) digunakan untuk mempelajari dampak phloretin pada peradangan saraf in vivo dan mengkonfirmasi mekanisme yang mendasarinya.

Hasil: Kami menunjukkan bahwa phloretin mengurangi fenotipe inflamasi makrofag dan secara nyata menekan peradangan saraf di EAE. Phloretin memediasi efeknya dengan mengaktifkan jalur pensinyalan Nr2. Aktivasi Nrf2 dikaitkan dengan aktivasi autophagy yang bergantung pada 5'AMP-activated protein kinase (AMPK) dan degradasi protein 1 (Keap1) terkait-ECH seperti kelch berikutnya.

Kesimpulan: Penelitian ini membuka perspektif masa depan untuk phloretin sebagai strategi terapi untuk gangguan neuroinflamasi seperti MS.

Pendaftaran percobaan: Tak dapat diterapkan.

Kata kunci: Phloretin, Makrofag, Peradangan Saraf, Multiple sclerosis, Autoimunitas

Klik di sini untuk mempelajari informasi lebih lanjut

Latar belakang

Lesi multiple sclerosis (MS) aktif ditandai dengan adanya banyakmakrofag[{}]. Studi awal menunjukkan bahwa makrofag mengadopsi fenotipe pro-inflamasi pada lesi MS, sehingga mempromosikanperadangan saraf, demielinasi, dan neurodegenerasi. Fungsi efektor yang memicu penyakit termasuk presentasi antigen yang diturunkan dari sistem saraf pusat (SSP) ke sel T autoreaktif dan produksi mediator inflamasi seperti sitokin pro-inflamasi, spesies oksigen reaktif (ROS), dan oksida nitrat (NO) [ 6,7]. Baru-baru ini, ditemukan bahwa makrofag juga memiliki fungsi yang bermanfaat pada lesi MS karena mereka dapat membentuk kembali fenotipe mereka menjadi fenotipe yang biasanya terkait dengan imunosupresi dan perbaikan SSP. Fenotipe protektif ini dicirikan oleh penurunan produksi mediator pro-inflamasi, produksi mediator anti-inflamasi dan faktor pertumbuhan, dan aktivasi jalur anti-oksidatif seperti jalur faktor nuklir eritroid 2-terkait faktor 2 (Nrf2) [8-14]. Karena status inflamasi makrofag telah dikaitkan dengan perkembangan MS dan perkembangan lesi aktif kronis, mendorong makrofag ke fenotipe yang menguntungkan dianggap sebagai strategi yang menjanjikan untuk membatasi perkembangan MS [15].

Komponen makanan mendorong fungsi makrofag dan peradangan saraf [16]. Secara khusus, keluarga flavonoid semakin diakui mengandung senyawa yang menjanjikan yang mempengaruhi jalur patogen dan memodulasi fenotipe sel imun seperti makrofag [17,18]. Flavonoid membentuk salah satu keluarga fitonutrien terbesar yang mengandung lebih dari 8000 senyawa fenolik dengan bioaktivitas yang beragam. Beberapa anggota keluarga flavonoid menunjukkan efek anti-inflamasi dan anti-oksidatif pada makrofag [19-21]. Flavonoid phloretin adalah anggota dihydrochalcones dan hadir dalam buah-buahan yang biasa dikonsumsi seperti apel dan stroberi. Phloretin dikenal untuk mengerahkan fitur imunomodulator dan banyak digunakan untuk perawatan kulit karena karakteristik anti-oksidatifnya [22-24]. Selain itu, phloretin adalah penghambat transporter glukosa (GLUT), fitur yang mempengaruhi fenotipe makrofag karena aktivasi makrofag didorong oleh GLUT [25, 26]. Secara keseluruhan, karakteristik ini menjadikan phloretin sebagai senyawa yang menjanjikan untuk memodulasi fenotipe makrofag dan peradangan saraf. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa phloretin mendorong makrofag menuju fenotipe yang kurang inflamasi dan mengurangi peradangan saraf dalam model ensefalomielitis autoimun eksperimental (EAE). Sekuensing RNA dan eksperimen fungsional mengidentifikasi jalur Nrf2 sebagai hub dan pendorong fenotipe makrofag pelindung ini yang diinduksi oleh phloretin. Aktivasi mesin autophagy yang bergantung pada AMPK dan degradasi Keapl yang dimediasi SQSTMl/p62-selanjutnya (selanjutnya disebut p62), sebuah adaptor yang memfasilitasi degradasi Nrf2 proteasomal, ditemukan mendasari aktivasi Nrf2 dalam makrofag. Temuan ini menunjukkan bahwa phloretin memiliki potensi untuk digunakan dalam strategi terapi untuk gangguan neuroinflamasi.

Metode

Antibodi dan reagen kimia

Floretina(Sigma Aldrich) dilarutkan dalam 50 mM KOH ke dalam larutan stok 15 mM dan disimpan pada-20 derajat . Pengenceran lebih lanjut dibuat dalam media RPMI1640 (Gibco). Untuk perlakuan in vivo, phloretin dilarutkan dalam NaOH 1 N, kemudian pH diatur kembali menjadi 7,2 dengan HCL 1 N, dan larutan tersebut selanjutnya diencerkan dalam air fisiologis untuk mendapatkan konsentrasi 50 mg/kg. BML-275（1 M, Santa Cruz Biotechnology）ditambahkan 1 jam sebelum pengobatan phloretin untuk menghambat aktivasi AMPK. Bafilomycin A1（BAF, 0,1 M, InvivoGen） ditambahkan 2 jam sebelum pengumpulan untuk memblokir fusi autofagosom dan lisosom. Lipopolisakarida (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) digunakan untuk merangsang sel untuk fenotip inflamasi. Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) digunakan untuk menginduksi produksi ROS. Antibodi berikut digunakan untuk western blot: mouse anti- -aktin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), kelinci anti-AMPK (1:1000;5831S, Teknologi Sinyal Sel), kelinci anti-terfosforilasi AMPK(1:1000; 2535S, Teknologi Sinyal Sel), kelinci anti-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), kelinci anti-p62 (1:1000; 23214, Teknologi Sinyal Sel). Antibodi berikut digunakan untuk imunofluoresensi: anti-CD3 tikus (1:150; MCA500G, Bio-Rad), anti-F4/80 tikus (1:100; MCA497G, Bio-Rad), kelinci anti-LC3 (1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), kelinci anti-p62 (1:500;23214,Teknologi Pensinyalan Sel), kelinci anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), kelinci anti-TMEM119(1 :100, ab209064,Abcam).Antibodi sekunder yang sesuai dibeli dari Invitrogen.

tikus

Tikus tipe liar (WT) C57BL/6JOlaHsd dibeli dari Envigo. Hewan diberi makan makanan biasa dan ditempatkan di fasilitas hewan Institut Penelitian Biomedis Universitas Hasselt. Semua percobaan dilakukan sesuai dengan pedoman kelembagaan dan disetujui oleh komite etik untuk percobaan hewan dari Universitas Hasselt.

Budaya sel

Berasal dari sumsum tulangmakrofag(BMDM) diisolasi dari tikus WT dan Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd, dibeli dari Envigo dan disediakan oleh RIEN BRC menurut MTA masing-masing untuk Prof S. Kerdine-Römer [27,28]. BMDM diperoleh seperti yang dijelaskan sebelumnya [29]. Dalam sel sumsum tulang tibialis dan femoralis pendek dari 12-minggu WT dan Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd tikus dikultur dalam 10-cm cawan Petri pada konsentrasi 10×106 sel/ piring, dalam media RPMI1640 yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi (FCS, Gibco), 50U/ml penisilin (Invitro-gen), 50 U/ml streptomisin (Invitrogen), dan 15 persen L929-media terkondisi (LCM ). Setelah diferensiasi, BMDM dilepaskan pada 37 derajat dengan 10 mM EDTA di PBS (Gibco) dan dikultur (0,5 × 10 derajat sel/ml) di RPM1640 dilengkapi dengan 10 persen FCS, 50U/ml penisilin, 50U/ml streptomisin dan 5% LCM ( 37 derajat C,5 persen CO2). Kultur mikroglia diisolasi dari otak anak anjing P1-3 C57BL/6/OlaHsd pascakelahiran. Setelah batang otak, pleksus koroid, dan meningen dihilangkan, otak dipisahkan secara mekanis dan dicerna secara enzimatik selama 15 menit dengan 1x tripsin (Gibco) pada suhu 37 derajat. Setelah itu, suspensi sel diunggulkan dalam DMEM medium glukosa tinggi (Sigma) yang dilengkapi dengan 30 persen LCM, 10 persen FCS, penisilin 50U/ml, dan streptomisin 50U/ml dalam labu kultur T75. Dua sampai 3 hari kemudian, perubahan media lengkap dilakukan. Kultur glial campuran dikocok (230rpm,3h, 37 derajat) setelah 6-7 hari untuk mendapatkan kultur mikroglia murni.

pengurutan RNA

Sel diperlakukan sebelumnya dengan phloretin 50 M） selama 20 jam dan distimulasi LPS (100 ng/ml) selama 6 jam. Lisis sel dilakukan menggunakan reagen Qiazol Lysis (Qiagen). RNA diekstraksi dari sel menggunakan RNeasy mini kit (Qiagen). Sampel kemudian diproses oleh Genomics Core Leuven (Belgia). Persiapan perpustakaan dilakukan dengan kit QuantSeq Lexogen untuk menghasilkan perpustakaan yang kompatibel dengan Illumina. Perpustakaan diurutkan pada sistem pengurutan Illumina HiSeq4000. Penyelarasan sadar-sambatan dilakukan dengan STAR v2.6.1b[30]. Kuantifikasi pembacaan per gen dilakukan dengan HT-seq Count v2.7.14. Analisis ekspresi diferensial berbasis hitungan dilakukan dengan paket Biokonduktor DESeq2 berbasis R (The R Foundation for Statistical Computing, Wina, Austria). Daftar gen yang diekspresikan secara berbeda dipilih di ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

PCR transkripsi terbalik kuantitatif

Sel diperlakukan dengan phloretin（50 M selama 20 jam dan LPS distimulasi (100 ng/ml) selama 6 jam. Lisis dilakukan dengan menggunakan reagen Qiazol Lysis (Qiagen). RNA diekstraksi menggunakan RNeasy mini kit (Qiagen). Konsentrasi dan kualitas RNA ditentukan dengan spektrofotometer Nano-drop (Isogen Life Science). Sintesis cDNA dilakukan menggunakan Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) sesuai instruksi pabrik. qPCR dilakukan pada sistem PCR Real-Time StepOne-Plus" (Biosistem Terapan) menggunakan campuran hijau SYBR yang mengandung 1× SYBR hijau (Biosistem Terapan）, primer 0,3 M Teknologi DNA Terintegrasi), 12,5ng cDNA dan air bebas nuklease Metode Ct komparatif digunakan untuk mengukur ekspresi gen Data dinormalisasi ke gen referensi paling stabil cyclin A dan hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1. Urutan primer tersedia berdasarkan permintaan.

Penentuan spesies oksigen reaktif

Sel diperlakukan dengan phloretin (50 uM) selama 2 jam. Setelah itu, sel dirangsang dengan PMA (15 menit, 100 ng/ml) dan produksi ROS diukur menggunakan probe fluoresen 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate pada 10 M dalam PBS selama 30 menit. Fluoresensi diukur menggunakan fluoresensi FLUOstar optima microplate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman) (eksitasi: 495 nm, emisi: 529 nm).

Pengukuran oksida nitrat

Sel diperlakukan dengan phloretin 50 M） selama 2 jam. Setelah itu, sel dirangsang dengan LPS (24 jam, 100 ng/ml). NO dipantau secara tidak langsung menggunakan kit pengukuran nitrit reagen Griess (Abcam). Secara singkat, nitrat bereaksi dengan sulfanilamida dan N-(1-naftil)etilen-diamin dihidroklorida untuk menghasilkan pewarna azo merah muda. Absorbansi turunan azo ini kemudian diukur pada 540 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (iMark, Bio-Rad).

noda barat

Sel diperlakukan dengan phloretin（5{{10}} M） dan LPS（100 ng/ml) selama 1 jam atau 24 jam untuk menentukan aktivasi AMPK atau tingkat protein p62, LC3, dan Keapl. Sel dilisiskan menggunakan penyangga RIPA (150 mM NaCl, 1 persen Triton X-100, 0,5 persen natrium deoksikolat, 1 persen SDS, 50 mM Tris), dan dipisahkan melalui elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida. Gel dipindahkan ke membran PVDF (VWR) dan noda diblokir selama 1 jam dalam 5 persen albumin serum sapi dalam larutan saline tris-buffer yang mengandung 0,1 persen Tween-20(TBS-T). Membran diperiksa dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 "C, dicuci dengan TBS-T, dan diinkubasi dengan antibodi berlabel peroksidase lobak sekunder yang sesuai selama 1 jam pada suhu kamar (RT). Sinyal imunoreaktif dideteksi dengan peningkatan chemiluminescence (ECL Plus, Thermo Fisher)menggunakan Amersham Imager 680(GE Healthcare Life Sciences) Kepadatan pita ditentukan menggunakan ImageJ.

Imunofluoresensi

Cryosections sumsum tulang belakang dikeringkan dengan udara dan difiksasi dalam aseton dingin selama 10 menit pada derajat - 20. BMDM tikus dikultur pada slide penutup kaca dan difiksasi dalam metanol dingin selama 10 menit pada -20 derajat. Bagian dan BMDM diblokir selama 30 menit menggunakan blok protein Dako (Agi-lent). Setelah itu, diinkubasi semalaman pada suhu 4"C dengan antibodi primer, dicuci, dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai selama 1 jam di RT. Gambar jaringan sumsum tulang belakang diambil menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i (10× objektif) dan NIS Perangkat lunak Elements BR 3.10 (Nikon).Gambar BMDM yang diwarnai untuk p62, LC3 dan Keapl diambil menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 880 dan dikoreksi Airyscan (objektif 63×).P62-dan LC3- puncta positif ditentukan oleh gambar analisis puncta semi-otomatis J. Singkatnya, setelah gambar dibuat biner dan sel dipilih dengan tangan, puncta dianalisis per sel. Kolokalisasi P62 dan Keapl dilakukan menggunakan saluran kolokalisasi dalam perangkat lunak CellProfiler [31 ] Gambar yang ditampilkan dalam gambar ditingkatkan secara digital.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, pengaturan terapeutik). Tikus ditimbang dan dinilai setiap hari untuk tanda-tanda neurologis penyakit menurut panduan penilaian EAE tikus pabrikan:0:tidak ada gejala klinis,0.5:ujung ekor lemas, 1:ekor lemas , 1.5: ekor lemas dan kaki belakang terhambat 2: ekor lemas dan kaki belakang lemas, 2.5: ekor lemas dan kaki belakang terseret,3: ekor lemas dan kaki belakang lumpuh total, 3.5: ekor lemas dan kaki belakang lumpuh total kaki dan tikus tidak dapat meluruskan dirinya sendiri saat diletakkan miring,4: kelumpuhan pada diafragma, 5: mati oleh EAE.

Analisis statistik

GraphPad Prism digunakan untuk menganalisis data secara statistik, yang direpresentasikan sebagai mean±sem D'Agostino dan uji normalitas omnibus Pear-son digunakan untuk menguji distribusi normal. Uji-t Student tidak berpasangan dua sisi (dengan koreksi Welch jika perlu) digunakan untuk data yang terdistribusi normal. Analisis Mann-Whitney digunakan untuk data yang tidak lulus uji normalitas<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Hasil

Perubahan transkripsi yang terkait dengan pengobatan floretin pada makrofag

Untuk menetapkan potensi efek anti-inflamasi dan mengidentifikasi mekanisme yang mendasari pengobatan phloretin pada makrofag, kami melakukan pengurutan RNA massal (Gambar tambahan 1). Analisis jalur makrofag teraktivasi yang diobati dengan phloretin menunjukkan bahwa gen yang diekspresikan secara berbeda terwakili secara berlebihan dalam jalur kanonik yang terkait denganperadangan, seperti iNOS(z-score:-2.449), reseptor seperti pulsa(z-score:-2.236), sinyal interferon (z-score:- 2), dan jalur respons fase akut (skor-z:- 1.633)(Gbr.1A, B). Mirip dengan analisis jalur kanonik, analisis hulu dari data RNA-seq memperkirakan bahwa phloretin mengurangi aktivasi regulator transkripsi pro-inflamasi utama seperti IRF7 (skor-z:2.229), IRF1(skor-z:-2. 025) dan STAT1(skor-z:-2.022)(Gbr. 1D). Di samping menurunkan regulasi jalur pro-inflamasi makrofag, analisis RNA-seq dari makrofag yang diobati dengan phloretin menunjukkan bahwa, di antara jalur lainnya, phloretin secara potensial mengaktifkan jalur Nrf2 (skor-z: 1,897), dibuktikan dengan peningkatan regulasi terkait Nrf2- gen seperti mafG dan proxy (Gbr. 1A, C). Terlebih lagi, Nrf2 (NFE2L2) diidentifikasi sebagai regulator transkripsi hulu yang paling aktif (skor z: 2,801), dan regulasi level ROS diidentifikasi sebagai salah satu fungsi biologis yang paling diregulasi dalam BMDM yang dirawat dengan phloretin (skor z: 2,008 )(Gbr. 1D, E). Secara kolektif, temuan menunjukkan bahwa phloretin mengaktifkan Nrf2 dan menekan fenotipe inflamasi makrofag.

Jalur Nrf2 mengontrol fenotipe makrofag yang diobati dengan phloretin

Selanjutnya, kami memvalidasi efek anti-inflamasi phloretin dan menentukan apakah itu memodulasi fenotipe inflamasi makrofag dengan bekerja pada Nrf2. Penurunan kadar ROS diamati pada BMDM WT yang diobati dengan phloretin yang distimulasi dengan PMA (Gbr. 2A). Selain itu, penurunan produksi NO dan tingkat mRNA gen pro-inflamasi NOS2, I-6, COX2 dan I-12 diamati pada BMDM WT yang diobati dengan phloretin yang distimulasi dengan LPS (Gbr. 2B, C). kaitannya dengan peran penting Nrf2 dalam menginduksi fenotipe yang kurang inflamasi, data kami menunjukkan bahwa phloretin mengaktifkan Nrf2-gen respons HO1 dan NQO1 di WT tetapi tidak Nrf2 KO BMDM yang distimulasi dengan LPS (Gbr. 2D). Selanjutnya, pengobatan phloretin mengurangi produksi ROS di WT tetapi tidak di Nrf2 KO BMDMs (Gbr. 2E). Selain mengendalikan respons anti-oksidatif, Nrf2 dilaporkan menekan fenotipe inflamasi makrofag [12]. Untuk mendukung yang terakhir, phloretin tidak dapat mengurangi ekspresi gen pro-inflamasi NOS2, IL-6, COX2 , dan IL-12 dalam BMDM yang kekurangan Nrf2-yang diaktifkan (Gbr. 2F). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa Nrf2 mendorong pergeseran fenotipe inflamasi yang dimediasi phloretin dari makrofag.

Phloretin mempromosikan aktivasi AMPK

Phloretin adalah inhibitor GLUT yang terdefinisi dengan baik dan studi terbaru menyoroti pentingnya ambilan glukosa yang dimediasi GLUT untuk aktivasi makrofag [26,32]. Oleh karena itu, kami menentukan apakah phloretin dapat mengaktifkan sensor energi AMPK, yang diaktifkan pada tingkat energi/glukosa yang rendah. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan phloretin mengarah pada fosforilasi dan aktivasi AMPK (Gbr. 3A, B). Selain itu, penambahan inhibitor AMPK BML-275 sebagian besar mencegah aktivasi AMPK pada BMDM yang diobati dengan phloretin (Gbr. 3A, B). Terlebih lagi, temuan kami menunjukkan bahwa aktivasi AMPK sangat penting bagi phloretin untuk menekan produksi ROS, seperti yang ditunjukkan oleh tingkat ROS yang lebih tinggi pada BMDM yang diobati dengan inhibitor phloretin dan AMPK dibandingkan dengan BMDM yang diobati dengan phloretin saja (Gbr.3C). Secara total, data kami menunjukkan bahwa aktivasi AMPK yang diinduksi phloretin sangat penting untuk mendorong makrofag menuju fenotipe yang kurang inflamasi.

Phloretin merangsang autophagy dengan cara yang bergantung pada AMPK

Karena aktivasi AMPK terkait dengan aktivasi proses katabolik sebagai respons terhadap kekurangan nutrisi [33], kami selanjutnya menyelidiki apakah phloretin dapat mengaktifkan autophagy. Autophagy adalah proses katabolik yang diinduksi pada kelaparan dan respons stres lainnya, yang mendorong degradasi lisosom dari kargo intraseluler yang diasingkan dalam vesikel yang disebut autophagosomes. Analisis RNA-seq memperkirakan autophagy sebagai salah satu proses biologis hilir yang menunjukkan peningkatan aktivitas dalam BMDM yang diobati dengan phloretin (skor-z: 0.779) (Gbr. 4A). Selain itu, analisis imunositokimia BMDM yang diobati dengan phloretin dan inhibitor autophagy bafilomycin Al menunjukkan peningkatan akumulasi penanda autophagy MAP1LC3/LC3 (rantai ringan protein 1 terkait mikrotubulus 3) dan p62 dibandingkan dengan BMDM yang diobati dengan bafilomycin A1-(Gbr. .4B-D), menunjukkan peningkatan fluks autophagic pada pengobatan phloretin [34]. Setelah induksi autophagy, LC3 diubah dari bentuk LC3I menjadi bentuk LC3I lipid, yang berkorelasi dengan jumlah autophagosom. Sejalan dengan ini, kadar protein LC3II dan p62 yang lebih tinggi ditentukan dalam BMDM yang distimulasi phloretin oleh western blot (Gbr. 4E, F). Menariknya, peningkatan p62 dan LC3II oleh phloretin ini dicegah dengan mengobati BMDM dengan inhibitor AMPK BML-275(Gbr.4E-F). Secara kolektif, data kami menunjukkan bahwa phloretin merangsang autophagy dengan cara yang bergantung pada AMPK.

Phloretin mengaktifkan jalur Nrf2 melalui degradasi Keap1 yang dimediasi autophagy

Data kami menunjukkan bahwa phloretin mengaktifkan Nrf2 dan merangsang autophagy dalam makrofag. Menariknya, reseptor autophagy p62 dapat bersaing dengan Nrf2 untuk mengikat Keapl, adaptor yang memfasilitasi ubiquitinasi dan degradasi Nrf2 dalam kondisi normal. Disosiasi p62-dimediasi dari Keap1/Nrf2 ini akan mencegah degradasi Nrf2 dan akhirnya menyebabkan aktivasi Nrf2 [35]. Untuk alasan ini, kami menentukan apakah phloretin mempromosikan interaksi p62/Keapl, sehingga mengaktifkan jalur Nrf2. Di sini, kami menunjukkan bahwa phloretin mengaktifkan jalur Nrf2 melalui degradasi Keapl yang dimediasi p62-dalam makrofag. Dengan menggunakan mikroskop con-focal Airyscan resolusi tinggi yang dikombinasikan dengan analisis kolokalisasi, kami menunjukkan bahwa phloretin merangsang interaksi p62 dan Keapl, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan nilai parameter kolokalisasi (koefisien Pearson) dalam BMDM yang diobati dengan phloretin (Gbr. 5A). , B). Selain itu, temuan kami menunjukkan bahwa kadar protein Keapl yang lebih rendah hadir dalam BMDM yang diobati dengan phloretin, mengkonfirmasikan degradasi Keapl (Gbr. 5C). Untuk mengonfirmasi bahwa degradasi bergantung pada autophagy, kami menambahkan inhibitor autophagy bafilomycin A1 ke yang diobati dengan phloretin BMDM. Menariknya, pengurangan Keapl ini dibalikkan dengan pengobatan bafilomycin Al (Gbr. 5C). Hasil ini dikonfirmasi oleh western blot, menunjukkan penurunan kadar protein Keapl pada BMDM yang diobati dengan phloretin yang dicegah oleh bafilomycin A1 (Gbr. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretin mengurangi keparahan penyakit (Gbr. 6B). Pengurangan keparahan penyakit pada hewan yang diobati dengan phloretin disejajarkan dengan penurunan ekspresi gen inflamasi MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 dan CXCL2 di sumsum tulang belakang (Gbr.6C). Selain itu, jumlah sel F4/80t yang berkurang ditemukan di sumsum tulang belakang hewan yang diobati dengan phloretin (Gbr.6E, F). Karena makrofag F4/80*mikroglia dan F4/80* berkontribusi terhadap peradangan saraf, analisis yang lebih mendalam menggambarkan bahwa phloretin secara nyata mengurangi jumlah F480 plus TMEMl19-

makrofag pada tikus EAE (Gambar 2 DF tambahan) sementara tren yang tidak signifikan diamati menuju reduksi pada F480 plus TMEMl19 plus mikroglia. Konsisten dengan temuan ini, phloretin menekan produksi mediator inflamasi di mikroglia tetapi penekanan ini kurang jelas dibandingkan dengan makrofag (Gambar 2 AC tambahan). Temuan ini menunjukkan bahwa perbaikan EAE oleh phloretin terutama didorong oleh makrofag. Selain mengurangi ekspresi gen inflamasi, phloretin meningkatkan ekspresi faktor antiinflamasi dan neurotropik, yaitu IL-4, CNTF, dan IGF-1 di sumsum tulang belakang hewan EAE (Gbr. 6D ). Temuan ini sangat menyarankan bahwa phloretin mengurangi keparahan penyakit EAE dengan mendorong makrofag menuju fenotipe penyelesaian penyakit. Sejalan dengan temuan in vitro kami sebelumnya, kami juga mendeteksi peningkatan sinyal Nrf2 di CNS hewan EAE yang diobati dengan phloretin seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ekspresi mRNA Nrf2 dan target hilirnya NQO1 dan GPX1 (Gbr. 6G). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa phloretin menekan peradangan saraf baik dalam pengaturan profilaksis dan terapeutik. Lebih lanjut, temuan kami menunjukkan bahwa phloretin dapat mengurangi peradangan saraf dengan menekan fitur inflamasi makrofag melalui aktivasi Nrf2.

Diskusi

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa phloretin mendorong makrofag menuju fenotipe yang kurang inflamasi dengan cara yang bergantung pada Nrf2-. Aktivasi autophagy yang bergantung pada AMPK dan degradasi Keapl berikutnya ditemukan mendasari aktivasi Nrf2 oleh phloretin. Selanjutnya, kami mengkonfirmasi efek anti-inflamasi phloretin dalam model EAE di mana ia mengurangi keparahan penyakit dan mengurangi ketergantungan makrofagperadangan saraf.

Kami menunjukkan bahwa phloretin menekan fenotipe inflamasi makrofag. Hal ini sejalan dengan temuan Wei-Tien Chang et al. yang menunjukkan bahwa phloretin memiliki fitur anti-inflamasi dalam garis sel makrofag [36]. Kami menunjukkan bahwa induksi pergeseran fenotipe ini tergantung pada Nrf2. Nrf2 adalah pengatur utama respons antioksidan dan aktivasinya diketahui mendorong makrofag menuju fenotipe anti-inflamasi [1l, 12, 37]. Selain itu, beberapa penelitian mendefinisikan bahwa aktivasi Nrf2 melemahkan peradangan saraf dan degenerasi saraf pada gangguan SSP [{{10) }}]. Namun, meskipun temuan kami menunjukkan bahwa Nrf2 mendasari pergeseran fenotipe makrofag yang diobati dengan phloretin, data sekuensing RNA menggambarkan bahwa, di antara aktivasi Nrf2, jalur lain diregulasi. Secara khusus, upregulasi jalur PPAR menarik karena fitur anti-inflamasi dan cross-talk dengan Nrf2 [41-45]. Selain itu, karena phloretin adalah inhibitor GLUT yang terdefinisi dengan baik dan beralih ke glikolisis adalah peristiwa metabolisme penting untuk aktivasi makrofag, perubahan fenotipe mungkin juga sebagian diinduksi oleh efek metabolisme langsung phloretin pada transporter glukosa ini [46,47]. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan relevansi PPAR dalam aktivasi Nrf2 yang diinduksi phloretin dan sejauh mana imunomodulasi yang diinduksi phloretin dipengaruhi oleh perubahan metabolisme langsung. Secara keseluruhan, temuan kami dengan jelas menunjukkan bahwa aktivasi Nrf2 memainkan peran penting dalam sakelar fenotipe yang dimediasi phloretin.

Temuan kami menunjukkan bahwa aktivasi Nrf2 oleh phloretin dimediasi oleh aktivasi AMPK. AMPK memainkan peran penting dalam memulihkan homeostasis energi seluler dalam kasus tekanan yang menguras ATP yang mengakibatkan peningkatan rasio ADP: ATP, sehingga mengaktifkan jalur katabolik alternatif yang menghasilkan ATP, sementara mematikan jalur anabolik yang mengkonsumsi ATP [48]. Sejalan dengan itu, phloretin adalah inhibitor GLUT mapan dan menurunkan kadar glukosa seluler [49-51]. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa aktivasi AMPK dalam makrofag menginduksi fenotipe imunosupresif, yang menguatkan hasil kami yang menunjukkan bahwa aktivasi AMPK sangat penting bagi phloretin untuk menurunkan peradangan [52,53]. Data kami juga konsisten dengan penelitian sebelumnya dimana phloretin telah ditunjukkan untuk mengaktifkan AMPK pada jenis sel lain termasuk adiposit dan sel endotel [50, 54-56]. Phloretin dapat mengaktifkan AMPK secara tidak langsung dengan meningkatkan AMP dan menurunkan kadar ATP, karena AMP dan ATP secara alosterik merangsang atau menghambat aktivasi AMPK, masing-masing [48, 57]. Namun demikian, CaMKK, yang merupakan kinase upstream AMPK, dapat mendorong aktivasi AMPK sebagai respons terhadap peningkatan kadar Ca2 plus seluler tanpa perubahan level AMP/ATP [58]. Selain itu, mengingat jaringan interaksi yang luas antara AMPK dan jalur hulu dan hilir, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme yang mendasari aktivasi AMPK yang diinduksi phloretin.

Data kami menunjukkan bahwa aktivasi AMPK yang dimediasi phloretin merangsang autophagy dalam makrofag. Seperti disebutkan di atas, aktivasi AMPK adalah proses perlindungan diri yang bertujuan untuk mengembalikan keseimbangan energi sel [48]. Meskipun tidak ada penelitian yang pernah menunjukkan bahwa phloretin mampu merangsang fenotipe makrofag dengan mempromosikan autophagy, beberapa penelitian tetap menunjukkan efek phloretin pada jalur autophagy dalam sel kanker dan hepatosit [59-61]. Selain itu, berbagai penelitian menunjukkan bahwa proses katabolik hilir aktivasi AMPK dapat mengaktifkan autophagy [60, 62,63]. Menariknya, dalam menanggapi kelaparan glukosa, autophagy yang dimediasi AMPK diinduksi oleh fosforilasi dari inisiator autophagy import-ant unc-51 seperti autophagy activating kinase [64,65]. Sehubungan dengan ini, kami berspekulasi bahwa AMPK merangsang autophagy untuk mengembalikan ATP dari komponen seluler sebagai respons terhadap penipisan glukosa yang diinduksi phloretin. Namun, kelaparan glukosa juga dapat mengaktifkan autophagy secara independen AMPK [66-68]. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah aktivasi autophagy oleh phloretin juga terjadi sebagian secara independen dari AMPK.

Studi terbaru menunjukkan pentingnya autophagy untuk mendorong fenotipe makrofag fungsional. Dalam konteks ini, disregulasi autophagy dalam makrofag terutama dikaitkan dengan timbulnya aterosklerosis dan penyakit neurologis [69-72]. Di sini, kami menyediakan hubungan antara pengobatan phloretin, induksi autophagy, dan aktivasi Nrf2 dengan menunjukkan bahwa phloretin mempromosikan aktivasi Nrf2 melalui degradasi Keap1 yang dimediasi p62-. Sampai saat ini, peningkatan p62 puncta dianggap sebagai tanda penurunan autophagy karena p62 terdegradasi dalam autophagosomes setelah aktivasi autophagy [34]. Sehubungan dengan ini, akumulasi p62 telah dikaitkan dengan disfungsi autophagy pada lesi aterosklerotik [73]. Namun, gagasan ini telah ditentang dalam beberapa tahun terakhir dan sekarang dianggap bahwa p62 diperlukan untuk pembentukan autofagosom dan bahwa peningkatan kadar p62 secara paralel dengan peningkatan LC3Il puncta dapat menjadi tanda induksi autophagy [74]. Oleh karena itu, bersama dengan kapasitas phloretin untuk mengaktifkan AMPK dan perannya yang diketahui dalam aktivasi autophagy, hasil kami menunjukkan bahwa akumulasi P62 dan LC3 pada pengobatan bafilomycin A1 dalam makrofag yang distimulasi phloretin disebabkan oleh peningkatan fluks autophagic dan bukan karena gangguan autofagi. Menariknya, Lee Y et al. baru-baru ini menunjukkan bahwa, selain mengaktifkan Nrf2, pengikatan p62 ke Keapl juga terlibat dalam pembentukan autophagosome, menunjukkan bahwa aktivasi autophagy yang dimediasi phloretin secara langsung terkait dengan peningkatan aktivitas p62 di satu sisi, tetapi juga lebih banyak interaksi Keapl-p62 di sisi lain [ 75]. Keapl adalah adaptor ligase ubiquitin berbasis Cullin-3-yang membentuk homodimer dengan Nrf2 pada kondisi homeostatik, sehingga mendorong ubiquitinasi Nrf2 dan degradasi proteasomal [76]. Gangguan kompleks Keapl-Nrf2 menyebabkan stabilisasi Nrf2 dan translokasi ke nukleus [77, 78]. Telah didokumentasikan dengan baik bahwa gangguan kompleks ini terjadi baik melalui modifikasi residu sistein Keapl oleh molekul elektrofilik, interaksi langsung molekul kecil dengan Keapl, atau degradasi Keapl yang dimediasi p62-[35]. Ying Y et al. menyarankan interaksi langsung phloretin dan Keapl berdasarkan eksperimen in silico, yang kemudian mengarah pada aktivasi jalur Nrf2 dalam garis sel kardiomiosit [79]. Di sini, kami membuat mekanisme terkait autophagy tambahan dimana phloretin mengaktifkan Nrf2.

Dengan menggunakan model EAE, kami menetapkan bahwa phloretin meredakan peradangan saraf in vivo. Data kami sangat menyarankan bahwa phloretin memperbaiki EAE dengan menekan respons inflamasi yang dimediasi oleh makrofag dan mengaktifkan jalur Nrf2. Dalam model penyakit lain, phloretin juga dilaporkan menggunakan fitur neuroprotektif dan modulator imun. Secara khusus, phloretin ditemukan untuk mengaktifkan jalur Nrf2 di otak pada iskemia serebral dan mengurangi akumulasi beta amiloid pada model penyakit Alzheimer tikus [80-84]. Phloretin mungkin juga mempengaruhi sel imun lain in vivo, karena senyawa ini telah ditemukan untuk menghambat aktivasi sel T dan sel dendritik secara in vitro [85, 86]. Mengingat bahwa peradangan saraf dalam model EAE tidak sepenuhnya bergantung pada makrofag, akan menarik untuk menentukan sejauh mana pengurangan peradangan saraf dimediasi oleh sel-sel kekebalan lainnya. Sehubungan dengan ini, meskipun data kami menunjukkan bahwa perbaikan EAE terutama didorong oleh makrofag dan kurang bergantung pada modulasi mikroglia, percobaan lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan sejauh mana phloretin mempengaruhi mikroglia pada penyakit peradangan saraf. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan bahwa phloretin mengurangi peradangan saraf dengan mempengaruhi fenotipe makrofag, menunjukkan potensi terapeutik phloretin untuk gangguan neuroinflamasi.

Kesimpulan

Studi kami menunjukkan bahwa phloretin adalah agen imunomodulator kuat yang memodulasi sifat inflamasi makrofag pada gangguan neuroinflamasi. Aktivasi jalur Nrf2, yang dimediasi oleh aktivasi autophagy yang bergantung pada AMPK dan degradasi Keapl berikutnya, ditetapkan untuk mendorong pergeseran fenotipe ini. Oleh karena itu, phloretin adalah agen alami yang menjanjikan yang dapat digunakan untuk menurunkan beban inflamasi penyakit neuroinflamasi seperti MS.

Referensi

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, dkk. Dihydromyricetin memperbaiki pembentukan sel busa melalui penghabisan kolesterol yang bergantung pada LXRalpha-ABCA1/ABCG1-dalam makrofag. Farmakoter Bioma. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, dkk. Antosianin menginduksi penghabisan kolesterol dari makrofag peritoneum tikus: peran reseptor yang diaktifkan proliferator peroksisom {gamma}-reseptor X hati {alpha}- jalur ABCA1. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Quercetin meningkatkan ekspresi ABCA1 dan penghabisan kolesterol melalui jalur yang bergantung pada ap38-dalam makrofag. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fisiologi fagosit berbusa pada multiple sclerosis. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/dtk40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Subset makrofag dan mikroglia pada multiple sclerosis. Acta Neuropatol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Multiple sclerosis: mekanisme dan imunoterapi. saraf. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, dkk. Stearoyl-CoA desaturase-1 merusak sifat reparatif makrofag dan mikroglia di otak. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Makrofag fagosit myelin memodulasi proliferasi sel T autoreaktif. J. peradangan saraf. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Kamis VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, dkk. Lipid turunan mielin memodulasi aktivitas makrofag dengan aktivasi reseptor X hati. PLoS Satu. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, dkk. Myelin mengubah fenotipe inflamasi makrofag dengan mengaktifkan PPARs. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.