Glikosida Feniletanoid Menginduksi Apoptosis pada Sel Eca‑109 Melalui Jalur yang Bergantung pada Mitokondria

Perkenalan

Kanker kerongkongan adalah salah satu jenis kanker yang paling umum dengan angka kesakitan tertinggi ke-11 dan angka kematian tertinggi ke-6 secara global, dan menyebabkan ~439,{3}} kematian pada tahun 2015. Angka kejadian kanker kerongkongan sangat bervariasi antar wilayah, dengan wilayah timur Asia dan Afrika bagian timur dan selatan menunjukkan tingkat kejadian tertinggi dan Afrika bagian barat menunjukkan angka terendah pada tahun 2012. Di Tiongkok, perkiraan kasus dan kematian akibat kanker esofagus masing-masing adalah 477,000 dan 375,000 , pada tahun 2015. Meskipun angka morbiditas kanker esofagus telah menurun di negara-negara dengan indeks sosiodemografi menengah dan menengah atas antara tahun 2005 dan 2015, angka kematian tetap tinggi karena prognosis yang buruk. Kombinasi reseksi bedah dengan kemoterapi atau radioterapi telah digunakan untuk mengobati kanker esofagus, namun dilaporkan bahwa antara tahun 2003 dan 2014, tingkat kelangsungan hidup 5-tahun tetap ada<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studymenunjukkan hal ituGlikosida feniletanoid Cistanche tubulosa(CTPG) dapat menekan pertumbuhan sel melanoma B16-F10 in vitro dan in vivo (24). Namun, kelarutan CTPG dalam air yang buruk yang sebelumnya digunakan membatasi pengembangan obat. Oleh karena itu, CTPG yang larut dalam air (CTPG-W) digunakan dan efek antitumor pada sel kanker esofagus (Eca-109) diselidiki. Telah ditentukan bahwa CTPG-W dapat menghambat kelangsungan hidup sel Eca-109 secara bergantung pada dosis melalui induksi apoptosis melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bahan dan metode

Hewan.

Tikus C57BL/6 betina (6-8 minggu, ~25 g) dibeli dari Pusat Penelitian Hewan Laboratorium Beijing (Beijing, Cina) dan ditempatkan di tempat dengan suhu terkontrol (25˚C), siklus cahaya (12/ 12) Fasilitas Hewan Universitas Xinjiang (Urumqi, Cina). Semua hewan menerima air dan makanan bebas patogen.

Garis sel dan budaya.

Garis sel karsinoma esofagus manusia (Eca-109) diawetkan oleh Laboratorium Utama Sumber Daya Biologi dan Rekayasa Genetika Xinjiang (Sekolah Tinggi Sains dan Teknologi Kehidupan, Universitas Xinjiang, Urumqi, Tiongkok) dan dikultur di RPMI{{1} } medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) ditambah dengan 10% serum janin sapi yang dilemahkan dengan panas (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penisilin dan 100 µg/ml streptomisin pada suhu 37˚C dalam atmosfer lembab yang mengandung 5% CO2.

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) dibeli dari Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Tiongkok). Senyawa utama CTPG telah memenuhi syarat dan diukur dengan HPLC berdasarkan penelitian kami sebelumnya (24). Secara singkat, HPLC dilakukan pada Kolom ZORBAX SB‑C18 (250x4,6 mm; 5 µm) pada suhu 30˚C dan dielusi dengan larutan asam format 0,2% dan gradien metanol mulai dari 23%, sebanyak 1 ml ditambahkan setiap menit. selama 45 menit hingga mencapai 31%. Sebanyak 10 μl sampel disuntikkan dan dideteksi pada 330 nm. Standar echinacoside dibeli dari Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina), dan standar acteoside dibeli dari Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Jerman). Standar tersebut digunakan untuk menganalisis komponen CTPG-W.

uji MTT.

Proliferasi sel diukur dengan uji MTT. Sel Eca{{0}} diinokulasi ke dalam 96-pelat sumur dengan kepadatan 5x103 sel dalam 100 µl RPMI{{5 }} medium/sumur dan dikultur pada suhu 37˚C selama 24 jam, kemudian diolah dengan konsentrasi berbeda (0, 200, 400, 600, dan 800 µg/ml) CTPG-W atau 0,4% dimetil sulfoksida (DMSO) selama 24, 48 dan 72 jam. DMSO digunakan sebagai kontrol pelarut (800 µg/ml CTPG-W mengandung 0,4% DMSO). Cisplatin (20 µg/ml) digunakan sebagai kontrol positif. Selanjutnya, supernatan dibuang setelah sentrifugasi pada 225 xg selama 5 menit pada suhu kamar dan 100 μl larutan MTT (0,5 mg/ml dalam media RPMI-1640 tanpa FBS) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi pada suhu 37˚C selama 3 H. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dalam 200 µl DMSO. Nilai kepadatan optik (OD) diukur pada panjang gelombang 490 nm oleh pembaca pelat mikro 96-sumur (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Viabilitas sel relatif dihitung berdasarkan rumus: Viabilitas sel (%)=(OD diberi perlakuan/OD tidak diberi perlakuan)x100%. Morfologi sel Eca‑109 diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (pembesaran, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Jepang).

Untuk proliferasi splenosit, tikus C57BL/6 di-eutanasia dengan dislokasi serviks, dan limpa diisolasi. Suspensi sel tunggal dibuat dan splenosit diunggulkan ke dalam 96-pelat sumur dengan kepadatan 1x105 sel/sumur dalam 100 μl RPMI-1640 medium, dan kemudian diolah dengan konsentrasi berbeda (0, 200, 400, 600, dan 800 µg/ml) CTPG-W selama 24, 48 dan 72 jam pada suhu 37˚C dengan 5% CO2. Proliferasi splenosit diukur dengan uji MTT, sesuai dengan protokol yang disebutkan di atas. Indeks stimulasi=ODdiobati/ODtidak diobati.

Pengukuran apoptosis dan siklus sel. Sel Eca{0}} dikultur dalam cawan berukuran 60 mm dengan kepadatan 2,5x105 sel/cawan selama 24 jam dan diberi perlakuan dengan konsentrasi berbeda ({{31} }, 200, 400, 600, dan 800 µg/ml) CTPG-W atau 0,4% DMSO selama 24 jam pada 37˚C dengan 5% CO2. Sel dikumpulkan dan diwarnai dengan kit Deteksi Apoptosis Annexin V‑fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina), sesuai dengan protokol pabrikan. Sampel dikumpulkan dengan flow cytometry (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) dan dianalisis dengan FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Untuk menganalisis pengaruh CTPG-W pada siklus sel, sel 2,5x105 Eca-109 diunggulkan dalam cawan kultur 60 mm dan diberi perlakuan dengan CTPG-W (0, 100, 200, dan 400 µg/ml) atau 0,4 % DMSO selama 24 jam pada suhu 37˚C dengan 5% CO2. Semua sel dipanen dan dicuci dua kali dengan PBS dingin (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), kemudian difiksasi dalam 70% etanol dingin pada suhu 4˚C selama 30 menit. Setelah dicuci dua kali dengan PBS dingin, sel diresuspensi dalam 300 μl buffer pewarnaan PI/RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) selama 10 menit pada suhu kamar. Distribusi siklus sel dianalisis dengan perangkat lunak ModFit LT 3.0 dengan flow cytometry (BD FACSCalibur).

CISTANCHE TUBULOSA ALAMIAnti KelelahanMelindungi Hati PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analisis potensi membran mitokondria (Δψm) dan spesies oksigen reaktif (ROS).Untuk menganalisis Δψm, sel Eca{{0}} diberi perlakuan dengan CTPG-W (0, 400, 600, dan 800 µg/ml) atau DMSO 0,4% untuk 24 jam pada suhu 37˚C dengan 5% CO2, dan diwarnai dengan alat uji potensial membran mitokondria dengan JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), sesuai dengan protokol pabrikan, selama 20 menit pada suhu 37˚ C. Setelah dicuci dua kali dengan buffer pencuci JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), sampel diresuspensi dengan 300 μl buffer pencuci JC‑1 dan dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur). Fluoresensi pewarna JC‑1 dalam sel Eca‑109 juga diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (pembesaran, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Untuk analisis ROS, sel Eca-109 diobati dengan CTPG-W (0, 400, 600, dan 800 µg/ml) selama 2, 4, 6, 12 dan 24 jam, dan diwarnai dengan Reactive Oxygen Species Assay kit (Beyotime Institute of Biotechnology), sesuai dengan protokol pabrikan, selama 20 menit pada suhu 37˚C. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS dingin, sampel dikumpulkan dengan flow cytometry (BD FACSCalibur) dan dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo 7.6.

Gambar 1. Kontrol CTPG-W yang memenuhi syarat. Komponen CTPG-W dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif dengan kromatografi cair kinerja tinggi dan dibandingkan dengan standar echinacoside dan acteoside. CTPG-W, glikosida feniletanoid yang larut dalam airC. tubulosa.

Aktivitas pemulungan radikal 2,2‑difenil‑1‑pikrilhidrazil (DPPH). Aktivitas pembersihan radikal bebas CTPG-W ditentukan dengan uji radikal bebas DPPH sesuai dengan protokol yang dipublikasikan dengan sedikit modifikasi, karena metanol disubstitusi dengan etanol untuk melarutkan DPPH (25,26). Untuk pengukuran kondisi tunak, 150 µl DPPH (100 mmol/l) dalam etanol dicampur dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 dan 600 µg/ml) dalam 50 µl PBS, dan diinkubasi dalam gelap selama 30 menit pada suhu kamar. Absorbansi pada 517 nm terdeteksi dengan ada dan tidaknya CTPG-W. Sebanyak 50 μl Vitamin C digunakan sebagai kontrol positif. Aktivitas pemulungan radikal DPPH dihitung menggunakan rumus: Pemulungan (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, dimana Ablank adalah serapan kontrol (tanpa DPPH), Contoh adalah serapan sampel dan A0 adalah serapan PBS dengan DPPH.

Analisis Western blot. Sel Eca{{0}} diobati dengan CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) atau 0,4% DMSO selama 24 jam pada suhu 37˚C dengan 5% CO2. Pencucian berikutnya dua kali dengan PBS, sel 

Gambar 2. Pengaruh CTPG-W terhadap pertumbuhan sel Eca-109 dan splenosit. (A) Sel Eca-109 diobati dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda selama 24, 48, dan 72 jam, dan kemudian viabilitas sel dideteksi dengan uji MTT. (B) Perubahan morfologi sel Eca-109 setelah pengobatan CTPG-W pada 24 jam. (C) Splenosit tikus C57BL/6 diobati dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda selama 24, 48, dan 72 jam, dan kemudian proliferasi dianalisis dengan uji MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

dilisiskan dalam buffer Lisis Uji Radioimunopresipitasi (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Cina) selama 20 menit di atas es. Setelah sentrifugasi pada 10,000 xg selama 10 menit pada suhu 4˚C, supernatan dikumpulkan, dan konsentrasi protein dideteksi dengan kit asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) sesuai dengan protokol pabrikan. Analisis Western blot dilakukan sesuai dengan uraian kami sebelumnya (24). Antibodi terhadap caspase-7 (cat. no. D120077), caspase-8 (cat. no. D155240), caspase-9 (cat. no. D220078), limfoma sel B{ {13}} (Bcl-2) terkait X (Bax) (cat. no. D220073) dan Bcl-2 (cat. no. D260117), dan IgG-horseradish peroxidase (HRP) anti-tikus ) (cat. no. D111050) dan IgG-HRP anti-kelinci (cat. no. D110058) dibeli dari BBI Life Sciences (Shanghai, Cina). Antibodi terhadap caspase-3 (cat. no. E-AB-10050) dan caspase aktif-3 (cat. no. E-AB-22115) dibeli dari Elabscience ( Wuhan, Tiongkok). Antibodi lain terhadap caspase-7 (cat. no. 9492), poli (ADP-ribosa) polimerase (PARP) (cat. no. 9542), sitokrom c (cat. no. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminal kinase (JNK) (cat. no. 9252S) dan -actin (cat. no. 58169) diperoleh dari Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Semua antibodi primer dan sekunder diencerkan dengan perbandingan 1:1,000. Antibodi primer diinkubasi pada suhu 4˚C semalaman dan antibodi sekunder diinkubasi pada suhu 37˚C selama 1 jam.

Gambar 3. Apoptosis sel Eca-109 yang diinduksi oleh CTPG-W. Sel diperlakukan dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda selama 24 jam. (A) Sel Eca‑109 yang mengalami apoptosis dan nekrotik dianalisis dengan flow cytometry. Panel atas menggambarkan masing-masing plot titik dan panel bawah menggambarkan ringkasan data. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Protein target dideteksi menggunakan alat uji chemiluminescence yang disempurnakan (Beyotime Institute of Biotechnology), sesuai dengan protokol pabrikan.

Analisis statistik. Signifikansi statistik dihitung dengan analisis varian satu arah dengan uji post hoc Tukey dan hasilnya dianalisis menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 5.0 (Perangkat Lunak GraphPad, La Jolla, CA, USA) di antara kelompok perlakuan dan kontrol. Semua data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EKSTRAK CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI GINJAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Hasil

CTPG‑W menekan pertumbuhan sel Eca‑109.

Komponen CTPG-W dikualifikasi dan diukur dengan HPLC (Gbr. 1), yang dibandingkan dengan standar echinacoside dan acteoside. Berdasarkan waktu retensi puncak dan luas puncak, CTPG-W mengandung 39,16% echinacoside dan 2,44% acteoside. Pertama, efek CTPG-W terhadap viabilitas sel Eca-109 ditentukan dengan uji MTT. CTPG-W dilarutkan dalam DMSO pada 200 mg/ml dan diencerkan dengan media RPMI-1640 yang mengandung 10% FBS yang dilemahkan dengan panas hingga konsentrasi yang ditunjukkan. Sel Eca-109 diobati dengan CTPG-W dan viabilitas sel dianalisis dengan uji MTT pada titik waktu yang ditentukan. Pengobatan CTPG‑W secara signifikan mengurangi viabilitas sel Eca-109 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Gambar 4. Pengaruh CTPG-W terhadap distribusi siklus sel pada sel Eca-109. Konsentrasi CTPG-W yang berbeda digunakan untuk merawat sel Eca-109 selama 24 jam dan distribusi siklus sel dianalisis dengan flow cytometry. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG‑W menginduksi apoptosis pada sel Eca‑109. Untuk menyelidiki apakah CTPG-W menekan pertumbuhan sel Eca-109 melalui induksi apoptosis atau nekrosis, sel diobati dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda. Setelah 24 jam, apoptosis dan nekrosis sel Eca-109 terdeteksi dengan pewarnaan Annexin V/PI. Seperti yang digambarkan pada Gambar 3A, sel-sel Annexin V- /PI+ digerbang sebagai sel nekrotik, dan sel-sel Annexin V+ /PI+ dan Annexin V+ /PI- digerbang sebagai sel-sel apoptosis. CTPG-W terutama menginduksi apoptosis sel Eca-109 dengan cara yang bergantung pada dosis, meskipun sel Eca-109 yang nekrotik juga meningkat secara signifikan pada pengobatan 600 dan 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W menginduksi penghentian siklus sel pada fase S di sel Eca‑109. Gangguan siklus sel kanker akan menekan pertumbuhan sel dan mendorong apoptosis (27). Distribusi siklus sel dalam sel Eca-109 terdeteksi dengan pewarnaan PI setelah pengobatan CTPG-W selama 24 jam. Diamati bahwa sel-sel dalam fase S meningkat dan sel-sel dalam fase G0/G1 menunjukkan penurunan yang signifikan secara keseluruhan setelah pengobatan CTPG‑W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W menurunkan Δψm dan menginduksi pelepasan sitokrom c. Apoptosis dapat dipicu oleh jalur yang bergantung pada mitokondria (28,29). Anggota keluarga protein BCL-2 yang pro dan anti-apoptosis berperan penting dalam regulasi integritas membran mitokondria (30,31). Setelah pengobatan CTPG-W selama 24 jam, Δψm dinilai menggunakan pewarnaan JC‑1. Agregat JC‑1 (fluoresensi merah terdeteksi pada FL‑2) akan hancur menjadi monomer (fluoresensi hijau terdeteksi pada FL-1) ketika Δψm berkurang (32). 5A, frekuensi sel FL-1+ FL-2-/+ meningkat secara signifikan tergantung pada dosis, yang menunjukkan bahwa Δψm sel Eca‑109 menurun. Perubahan fluoresensi pada sel Eca‑109 juga diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (Gambar 5B). Dengan meningkatnya konsentrasi CTPG‑W, fluoresensi merah menurun dan fluoresensi hijau meningkat, yang konsisten dengan data dari flow cytometry. Hal ini juga diamati bahwa tingkat sitokrom c dalam sitosol meningkat secara signifikan (Gambar 5C), yang merupakan hasil dari pengurangan Δψm. Hal ini memperkuat kesimpulan yang diambil dari peningkatan jumlah sel FL-1+ FL-2-/+ yang Δψmnya menurun akibat pengobatan CTPG-W. Telah dilaporkan bahwa JNK dapat mengatur aktivasi keluarga protein BCL-2 yang menyebabkan pelepasan sitokrom c (33-35). Ditentukan juga bahwa tingkat JNK terutama diregulasi setelah pengobatan CTPG-W (Gambar 5C). Hasilnya menunjukkan bahwa CTPG-W dapat menginduksi apoptosis sel Eca-109 melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.

Gambar 5. Pengurangan Δψm dan peningkatan regulasi sitokrom c dan JNK. Sel Eca-109 diobati dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda selama 24 jam. (A) Δψm dideteksi dengan pewarnaan JC‑1 dan sampel dianalisis dengan flow cytometry. Plot titik individual menggambarkan perubahan fluoresensi JC‑1. Frekuensi sel FL-1+ FL-2-/+ digambarkan di panel bawah. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Gambar 6. Kadar ROS dalam sel Eca-109 setelah pengobatan CTPG-W dan aktivitas antioksidan CTPG-W. (A) Sel Eca-109 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG‑W yang berbeda dan tingkat ROS dianalisis dengan flow cytometry pada titik waktu yang ditentukan. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Efek CTPG‑W pada pembentukan ROS intraseluler.ROS dapat mengurangi Δψm untuk menginduksi apoptosis (36). Untuk menyelidiki apakah CTPG-W dapat meningkatkan produksi ROS, sel Eca-109 diobati dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda. Sel dikumpulkan pada titik waktu yang ditentukan dan diwarnai dengan DCFH-DA. Produksi ROS intraseluler dalam sel Eca-109 ditentukan oleh flow cytometry. Seperti digambarkan pada Gambar 6A, 800 µg/ml CTPG-W secara signifikan meningkatkan produksi ROS dari 2-6 jam, dan menurun dari 12-24 jam. Selain itu, 400 µg/ml CTPG‑W meningkatkan produksi ROS secara signifikan dari 12-24 jam. Selain itu, 200 µg/ml CTPG-W tidak mengubah produksi ROS secara signifikan. Perubahan dinamis dalam produksi ROS mungkin terkait dengan apoptosis sel Eca-109. Juga ditentukan bahwa CTPG-W memiliki aktivitas pembersihan radikal bebas (Gambar 6B), yang mungkin terkait dengan penurunan produksi ROS dalam sel Eca-109 yang diobati dengan 800 µg/ml CTPG-W setelah 12 jam.

Gambar 7. Kadar caspases terpecah dan PARP terpecah setelah pengobatan CTPG-W. Protein diisolasi dari sel Eca-109 yang diobati dengan CTPG-W selama 24 jam dan kadar caspases terpecah dan PARP terpecah terdeteksi dengan analisis western blot. DMSO, dimetil sulfoksida; CTPG-W, glikosida feniletanoid yang larut dalam airC. tubulosa; PARP, poli (ADP-ribosa) polimerase.

CTPG‑W meningkatkan regulasi aktivitas caspase‑3, caspase‑7, caspase‑9, dan PARP. Pelepasan sitokrom c akibat reduksi Δψm dapat mengaktifkan protease caspase untuk menginduksi apoptosis (29,30,37). Setelah pengobatan CTPG-W selama 24 jam, aktivasi caspase-3, 7, 8, 9, dan PARP terdeteksi oleh analisis western blot. Dibandingkan dengan kontrol, level cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 dan cleaved-PARP, namun bukan level cleved-caspase{{20 }}, diregulasi dengan pengobatan CTPG dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 7). Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG-W mengurangi Δψm dan mendorong pelepasan sitokrom c untuk mengaktifkan caspases yang menginduksi apoptosis sel Eca-109.

Diskusi

CHM tradisional dapat menginduksi apoptosis sel kanker esofagus melalui jalur yang berbeda, termasuk reseptor kematian ekstrinsik, dan jalur stres retikulum endoplasma mitokondria dan endoplasma intrinsik (29). Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa CTPG, sebagai komponen utama C. tubulosa, menghambat pertumbuhan sel melanoma B16-F10 melalui induksi apoptosis melalui jalur yang bergantung pada mitokondria (24). Dalam penelitian ini, efek antitumor CTPG-W pada sel Eca-109 diselidiki dan ditentukan bahwa CTPG-W menekan pertumbuhan sel Eca-109, menginduksi apoptosis, dan penghentian siklus sel, mengurangi Δψm, meningkatkan pelepasan sitokrom c dan mengaktifkan caspases. CTPG dan CTPG-W dapat menginduksi apoptosis dan penghentian siklus sel pada sel kanker. Namun, mekanisme akuratnya berbeda karena perbedaan komponen CTPG (26,64% echinacoside, 10,19% acteoside, dan 1,71% isoacteoside) dan CTPG-W (39,16% echinacoside dan 2,44% acteoside). CTPG menangkap sel B16-F10 pada fase G0/G1, namun CTPG-W menangkap sel Eca-109 pada fase S (24). Produksi ROS ditingkatkan tergantung dosis oleh CTPG, namun hal ini menunjukkan perubahan tergantung waktu dengan CTPG‑W dosis tinggi, yang meningkat secara signifikan pada awal pengobatan CTPG-W (2-6 jam) dan menurun secara signifikan setelah 12 jam, dibandingkan dengan kontrol. Alasan yang mungkin adalah komponen utama CTPG-W adalah echinacoside. Beberapa penelitian melaporkan bahwa echinacoside dapat menghambat produksi ROS dan apoptosis yang diinduksi ROS untuk memberikan efek neuroprotektif dan anti-penuaan (38-40). Demikian pula, aktivitas pembersihan radikal bebas diamati dalam penelitian ini. Oleh karena itu, ada spekulasi bahwa beberapa komponen, termasuk verbascoside, iso-verbascoside, dan salidroside dalam CTPG-W dosis tinggi mungkin segera menginduksi pembentukan ROS yang menyebabkan apoptosis sel Eca-109 (41,42), dan kemudian ROS diambil oleh echinakosida. Alasan lain yang mungkin untuk perbedaan produksi ROS oleh CTPG dan CTPG-W adalah perbedaan garis sel yang digunakan dalam penelitian ini dan penelitian sebelumnya (24). Dong dkk (43) melaporkan bahwa echinacoside dapat menginduksi apoptosis sel kanker kolorektal SW480 manusia melalui pembentukan kerusakan DNA oksidatif tanpa peningkatan kadar ROS.

Pengobatan CTPG-W mengurangi Δψm dan menyebabkan pelepasan sitokrom c, yang mendorong pembelahan caspase-9 (28). Secara konsisten, tingkat cleved-caspase-9 diregulasi dengan pengobatan CTPG-W. Selanjutnya, caspase-9 yang aktif dapat mengaktifkan caspase-3 untuk menginduksi apoptosis (44). Tingkat cleved-caspase-3 juga diregulasi dengan pengobatan CTPG-W. Namun, caspase-8 tidak diaktifkan oleh CTPG-W, menunjukkan bahwa jalur reseptor kematian ekstrinsik tidak terlibat dalam apoptosis yang disebabkan oleh CTPG-W. Pengamatan ini menunjukkan bahwa CTPG-W menginduksi apoptosis sel Eca-109 melalui aktivasi jalur yang bergantung pada mitokondria.

PARP berperan penting dalam stabilitas genom dan dapat dibelah oleh caspase aktif, khususnya caspase-3 dan -7 (45). Telah ditentukan bahwa pengobatan CTPG-W mengaktifkan caspase-3 dan -7, yang dapat membelah PARP untuk menghambat perbaikan DNA dan menyebabkan apoptosis.

CTPG-W juga bergantung pada dosis dan waktu menekan pertumbuhan sel BEL-7404 karsinoma hepatoseluler manusia (data tidak dipublikasikan). Meskipun CTPG-W menghambat pertumbuhan sel Eca-109 dan BEL-7404, CTPG-W mendorong proliferasi splenosit, yang mungkin disebabkan oleh kandungan polisakarida (~50%) di CTPG-W (46 ). Demikian pula, beberapa penelitian telah melaporkan bahwa polisakarida dapat mendorong proliferasi splenosit (46-49). Pada model tikus, ditentukan bahwa CTPG‑W secara signifikan meningkatkan indeks limpa, dibandingkan dengan kelompok kontrol, namun tidak mempengaruhi berat badan dan indeks organ lainnya termasuk jantung, hati, ginjal, dan paru-paru (data tidak dipublikasikan), menunjukkan bahwa CTPG-W tidak memiliki efek sitotoksik pada sel normal.

Secara kolektif, data menunjukkan bahwa CTPG-W menghambat pertumbuhan sel Eca-109 dengan menginduksi apoptosis melalui jalur yang bergantung pada mitokondria

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%