Nikotin Paternal Meningkatkan Memori Ketakutan, Mengurangi Administrasi Nikotin, Dan Mengubah Fungsi Genetik dan Saraf Hippocampal pada Keturunan
Mar 21, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1
1Department of Biobehavioral Health, Penn State University, University Park, Pennsylvania
2Departemen Farmakologi, Sekolah Kedokteran Vanderbilt, Nashville, Tennessee
3Perguruan Tinggi Farmasi, Universitas Kentucky, Lexington, Kentucky
4Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, Irvine, California
5Bioinformatika, Biokimia dan Biologi Molekuler, Penn State University, University Park, PA
6Departemen Psikologi, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania
Abstrak
Penggunaan nikotin tetap tinggi pada produk tembakau dan rokok elektrik yang dikonsumsi di seluruh dunia. Namun, semakin banyak bukti pewarisan epigenetik transgenerasional menunjukkan bahwa penggunaan nikotin dapat mengubah perilaku dan neurobiologi pada generasi berikutnya. Kami menguji efek paparan nikotin ayah kronis pada tikus C57BL6 / J pada pengkondisian rasa takut pada keturunan F1 dan F2, serta kepunahan rasa takut yang dikondisikan dan pemulihan spontan, pemberian nikotin sendiri, fungsi kolinergik hipokampus, ekspresi RNA, dan metilasi DNA di F1 keturunan. Paparan nikotin dari ayah dikaitkan dengan peningkatan kontekstual dan pengkondisian rasa takut dan pemulihan spontan dari ingatan ketakutan yang padam. Lebih lanjut, penguatan nikotin berkurang pada tikus yang dikandung nikotin, sebagaimana dinilai dalam paradigma pemberian sendiri. Fenotipe perilaku ini digabungkan dengan respons yang berubah terhadap nikotin, pengikatan reseptor asetilkolin nikotinat hippocampal yang diregulasi, pengurangan arus kolinergik hippocampal yang dibangkitkan, dan perubahan metilasi dan ekspresi gen hippocampal yang terkait dengan perkembangan saraf dan plastisitas. Analisis ekspresi gen menunjukkan efek multigenerasi pada jaringan gen yang lebih luas yang berpotensi terlibat dalam neuroplastisitas dan gangguan mental. Perubahan dalam pengkondisian rasa takut juga menunjukkan fenotipe yang analog dengan gangguan kecemasan yang mirip dengan stres pasca-trauma.
KATA KUNCI: kolinergik, hipokampus, pembelajaran, multigenerasi, nikotin, transgenerasi
1. PERKENALAN
Bukti yang terkumpul menunjukkan bahwa dampak paparan penyalahgunaan obat melampaui individu untuk mempengaruhi fenotipe fisiologis dan perilaku pada keturunan yang tidak terpapar.1-3 Karakterisasi efek nikotin lintas generasi sangat penting mengingat prevalensi penggunaan produk tembakau4 dan peningkatan dramatis penggunaan rokok elektrik.5 Melalui efeknya pada sistem kolinergik otak, paparan nikotin menghasilkan perubahan nyata dalam fungsi otak yang mungkin mendasari kecanduan nikotin dan berkontribusi pada peningkatan risiko gangguan kejiwaan, termasuk depresi6 dan kecemasan.7 Modifikasi epigenetik hilir aktivasi kolinergik dapat memungkinkan efek persisten pada fungsi seluler dan sirkuit.8,9 Sampai saat ini, diyakini bahwa modifikasi epigenetik ini terhapus setelah pembentukan germline dan dengan demikian diasingkan dari generasi berikutnya. Namun, modifikasi epigenetik, termasuk metilasi DNA, modifikasi histone posttranslational, dan RNA noncoding, yang diperoleh dalam satu generasi dapat diwariskan pada generasi berikutnya.10,11 Modifikasi epigenetik ini dapat memediasi efek multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin orang tua pada perilaku keturunan dan neurobiologi .
Studi hewan pengerat dari beberapa laboratorium independen telah mulai mengidentifikasi konsekuensi multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin orang tua. Karya ini sejauh ini telah mengidentifikasi efek paparan nikotin orang tua pada fenotipe seperti depresi dan kecemasan, 1 fleksibilitas kognitif, 2 perilaku seperti attention deficit hyperactivity (ADHD), 3 dan ekspresi gen.1, 2 Konsekuensi multigenerasi dan transgenerasional dari paparan nikotin dapat mempengaruhi endofenotipe yang terlibat dalam kecanduan nikotin dan kesehatan mental. Misalnya, kami telah menunjukkan bahwa paparan nikotin memodulasi pengkondisian ketakutan kontekstual, model pembelajaran ketakutan yang bergantung pada hipokampus yang terkait dengan kerentanan terhadap gangguan kesehatan mental seperti gangguan stres pascatrauma (PTSD) dan kecanduan.12-14 Nikotin efek pada pembelajaran ketakutan kontekstual dimodulasi oleh hippocampus.15,16 Kami telah menemukan bahwa paparan nikotin akut meningkatkan pembelajaran ketakutan yang bergantung pada hipokampus,15,17 merusak kepunahan ketakutan kontekstual,18,19 dan menambah pemulihan spontan ketakutan kontekstual setelah kepunahan.18 Namun, efek multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin ayah pada fenotipe ini belum dipelajari. Selain itu, tidak ada penelitian sebelumnya yang mengkarakterisasi efek multi-generasi nikotin pada fungsi kolinergik. Warisan multigenerasi mengacu pada fenotipe yang muncul dalam generasi segera setelah individu yang terpapar, sedangkan pewarisan transgenerasi terdiri dari pewarisan informasi epigenetik yang dimediasi garis germinal antar generasi tanpa adanya pengaruh lingkungan langsung yang mengarah pada variasi fenotip. dan efek transgenerasi dari paparan nikotin ayah pada pembelajaran ketakutan kontekstual dan isyarat pada generasi F1 dan F2 serta pada pemberian sendiri nikotin, pengikatan reseptor asetilkolin nikotinik hipokampus (nAChR), fungsi kolinergik hipokampus, ekspresi gen hipokampus, dan metilasi DNA hipokampus pada generasi F1. Kami berhipotesis bahwa paparan nikotin ayah akan berdampak pada pengkondisian rasa takut, ekspresi gen hipokampus, dan fungsi pada keturunan dan cucu.
efek ekstrak cistanche
2 METODE DAN BAHAN
2.1 Mata Pelajaran
Subjek penelitian adalah mencit C57BL/6J jantan dan betina (usia 8-20 minggu, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Dengan pengecualian kandang untuk pengembangbiakan harem, semua hewan ditempatkan dalam kelompok dengan siklus terang/gelap 12 jam dan akses ad libitum ke makanan dan air. Selama pemberian sendiri, subjek dibatasi makanan hingga 85 persen hingga 90 persen dari berat badan mereka yang diberi makan gratis, dan air diberikan secara ad libitum. Semua pengujian perilaku terjadi antara pukul 09:00 AM dan 6:00 PM. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan Panduan NIH untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dan disetujui oleh komite IACUC Penn State University, Temple University, atau University of California Irvine.
2.2 Paparan nikotin dari ayah
Laki-laki (8 minggu) menerima 0,9 persen garam steril atau garam nikotin hidrogen tartrat (12,6 mg/kg/hari, berat dasar bebas—Fisher Scientific, Waltham, MA atau MP Biomedical, Santa Ana, CA) yang dilarutkan dalam 0,9 persen saline steril, diberikan secara subkutan melalui pompa mini osmotik (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) selama 28 hari. Dosis ini menghasilkan kadar nikotin dan kotinin plasma yang sebanding dengan yang terlihat pada perokok manusia sedang
2.3 Generasi tikus F1 dan F2
Waktu paruh nikotin pada tikus adalah sekitar 6 menit.22 Telah ditunjukkan sebelumnya bahwa dampak penghentian nikotin menghilang 4 hari setelah pelepasan nikotin.23-25 Oleh karena itu, penundaan 4 hari antara pengobatan nikotin dan pemuliaan dilaksanakan untuk memastikan eliminasi sistemik nikotin sebelum pemuliaan. Tikus jantan ditempatkan ke dalam kandang dengan dua betina naif C57BL/6 J (usia 8-20 minggu) selama 2 minggu untuk menghasilkan keturunan F1. Tikus F2 dihasilkan dengan mengawinkan tikus F1 jantan naif dengan betina naif.
2.4 Pengkondisian ketakutan
Prosedur pengkondisian ketakutan dan pemusnahan telah dijelaskan secara rinci sebelumnya.19 Secara singkat, tikus dilatih dan diuji di ruang peredam bising (18,8 × 20 × 18,3 cm, kebisingan latar 65 dB; MED Associates, St. Albans, VT). Tikus F1 dan F2 dikondisikan ketakutan dengan dua rangsangan terkondisi (CS, 30 s, 85-dB white noise) – stimulus tanpa syarat (US, 2 s, 0,57-mA foot shocks) pasangan yang dipisahkan oleh 120 detik. Untuk menguji efek akut nikotin pada pengkondisian rasa takut pada tikus F1 dan F2, keturunannya menerima nikotin akut (0,09 mg/kg, berat basa bebas NIC, ip; garam nikotin hidrogen tartrat, Fisher Scientific) atau saline (SAL) 2 hingga 4 menit sebelumnya untuk sesi pelatihan dan pengujian. Dua puluh empat jam setelah pelatihan, tikus dikembalikan ke konteks pelatihan selama 5 menit untuk menilai pembekuan kontekstual. Setelah pengujian kontekstual, tikus ditempatkan di ruang yang berbeda untuk menilai pembelajaran ketakutan isyarat. Eksperimen dibutakan terhadap kondisi yang menilai pembekuan, yang didefinisikan sebagai tidak adanya gerakan sukarela selain dari respirasi, melalui metode pengambilan sampel waktu yang tidak bias.19 Untuk menguji efek langit-langit potensial selama pengujian isyarat, kelompok tikus F1 terpisah menerima pelatihan identik dengan hanya satu CS-US berpasangan, dan kepunahan ketakutan kontekstual dan pemulihan spontan juga diperiksa. Kepunahan rasa takut terjadi selama lima sesi berturut-turut dimulai sehari setelah pengujian ketakutan kontekstual dan isyarat. Setelah sesi kepunahan terakhir, tikus dibiarkan tidak terganggu di kandang rumah mereka selama 7 hari dan kemudian diuji ulang dalam konteks pelatihan untuk pemulihan spontan. Untuk menentukan apakah ada perbedaan yang diamati dalam pengkondisian rasa takut disebabkan oleh perbedaan sensitivitas kejutan, kecemasan, atau defisit belajar yang lebih luas, hewan NIC- dan SAL-Sired jantan dan betina juga diuji di lapangan terbuka, sensitivitas goncangan, labirin plus yang ditinggikan ( EPM), dan paradigma pengenalan objek baru (lihat Informasi Pendukung untuk metode dan hasil lengkap).
2.5 Pemberian sendiri makanan dan nikotin intravena
A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 pelet per sesi di tiga sesi berikutnya), subjek dikateterisasi vena jugularis di bawah anestesi isoflurane (1 persen -3 persen)/uap oksigen, seperti yang dijelaskan sebelumnya.26 Tikus diizinkan lebih dari atau sama dengan 72 jam untuk pulih dari operasi sebelum akses untuk merespons lagi untuk hadiah makanan. Pembentukan kembali respons makanan memastikan bahwa tikus telah cukup pulih pasca operasi intravena dan menunjukkan respons operan normal setelah penundaan akses ke ruang operan. Tikus-tikus tersebut kemudian diizinkan untuk mendapatkan pemberian nikotin intravena (IV) selama sesi harian 1 jam, 6 hingga 7 hari per minggu (garam nikotin hidrogen tartrat dilarutkan dalam 0,9 persen saline steril, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infus, berat dasar bebas; MP Biomedical, Santa Ana, CA). Nikotin IV disampaikan oleh pompa jarum suntik Razel (Med Associates). Setiap sesi memiliki dua tuas yang dapat ditarik (satu aktif, satu tidak aktif). Penyelesaian kriteria respons pada tuas aktif menghasilkan pengiriman infus nikotin IV (0.{{20}}volume infus 3 ml; jadwal FR5TO20 detik). Tanggapan pada tuas yang tidak aktif dicatat tetapi tidak memiliki konsekuensi yang dijadwalkan. Setelah delapan sesi akuisisi pada 0,03 mg/kg/infus, dosis infus beralih ke 0,1 mg/kg/infus selama enam sesi. Untuk setiap dosis, asupan rata-rata dari tiga sesi terakhir digunakan untuk analisis statistik. Kateter dibilas setiap hari dengan salin steril fisiologis (0,9 persen b/v) yang mengandung heparin (100 unit USP/ml). Paten kateter diverifikasi dengan Brevital (methohexital sodium, Eli Lilly, Indianapolis, IN) setelah fase pemberian nikotin sendiri. Untuk menilai perilaku terkait kekambuhan, tikus diuji untuk inkubasi keinginan setelah sesi segera setelah 0,1 mg/kg/dosis infus pemberian sendiri nikotin IV; dalam prosedur ini, tikus diizinkan untuk merespon pada tuas aktif tetapi tidak menerima infus nikotin. Pada sesi inkubasi awal pertama (hari 1), tikus ditempatkan di ruang operan di bawah jadwal FR5TO20 detik dengan aktivasi cahaya isyarat kontingen. Setelah itu, mencit dikandangkan di kandang rumah selama 20 hari. Pada hari ke 21 pantang, tikus diperiksa untuk inkubasi keinginan, dengan lampu isyarat tuas aktif dikirimkan di bawah jadwal FR5TO20 detik. Studi dilakukan oleh para peneliti yang buta terhadap kondisi kelompok, dan respons perilaku secara otomatis direkam oleh perangkat lunak MedAssociates.
2.6 Pengikatan reseptor asetilkolin nikotinat
Uji pengikatan radioligand16 dilakukan menggunakan hippocampi dari tikus NIC-Sired berusia 8 minggu (5 M dan 10F) dan SAL-Sired (9 M dan 6F) F1. Sampel dihomogenisasi menggunakan buffer lisis (5 mM Tris ditambah 5 mM EDTA ditambah 5 mM EGTA), disentrifugasi pada 100 000 g selama 30 menit pada 4 derajat, disuspensikan kembali dalam buffer lisis, dan disentrifugasi lagi. Pelet disuspensikan kembali dalam buffer sukrosa Tris/10 persen dan diinkubasi dengan [3 H] Epibatidine ([3 H] EB) (~2 nM berdasarkan 27,28) (aktivitas spesifik 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) selama 1 jam pada suhu kamar. [3 H] EB dipilih untuk pengikatan nAChR, karena hasil sebelumnya menunjukkan bahwa hipokampus heteromer 4 2 nAChRs memediasi efek nikotin pada pengkondisian rasa takut.17 Pengikatan nonspesifik dinilai dengan adanya 300 M nikotin (garam nikotin hidrogen tartrat dilarutkan dalam Tris Buffer, konsentrasi basa bebas). [3 H] EB-terikat nAChR disaring (pemanen sel 24 sumur, Brandel Co, Gaithersburg, MD), dan penghitung kilau cair (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) mengukur radioaktivitas filter. Pengikatan spesifik yang dinyatakan sebagai jaringan fmol / mg dihitung sebagai perbedaan antara pengikatan total dan nonspesifik
2.7 Rekaman kolinergik amperometrik in vivo
Kohort terpisah dari tikus NIC-Sired dan SAL-Sired F1 naif 10- berusia 20 minggu digunakan untuk menilai perubahan dalam transmisi kolinergik hipokampus menggunakan amperometri. Mikroelektroda berbasis keramik (Pusat Teknologi Mikroelektroda, Lexington, KY), dengan 4 (15 × 333 m) tempat perekaman platinum yang disusun berpasangan (atas dan bawah), dilapisi dengan kolin oksidase (Nomor EC 1.1.3.17; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), seperti yang dilaporkan sebelumnya.29 Elektroda dielektropolimerisasi dengan meta-phenylenediamine (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) untuk meningkatkan selektivitas untuk mendeteksi arus kolin. Mikroelektroda dengan sensitivitas lebih besar atau sama dengan 3pA/μM dan batas deteksi kurang dari atau sama dengan 400 nM untuk kolin digunakan untuk memberikan indeks sensitif pelepasan asetilkolin (ACh).30 Hewan dibius dengan uretan (1,2-1,5 g/kg, ip), dan mikroelektroda berlapis enzim diturunkan secara stereotaksis ke bagian dorsal (A/P ‐1.7 mm, M/L ± 1.5 mm, D/V ‐2.3 mm) atau ventral (A/P 3.1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V 4,3 mm) hipokampus. Hippocampus ventral dan dorsal dievaluasi secara terpisah, karena mereka secara berbeda berkontribusi pada pengkondisian ketakutan kontekstual: hippocampus ventral (vHPC) memiliki peran yang lebih menonjol dalam asosiasi dan ekspresi ketakutan, sedangkan hippocampus dorsal (DHCP) sangat penting untuk memori kontekstual.31 Ag/ Elektroda referensi AgCl ditanamkan ke dalam korteks rostral kontralateral.
Perekaman amperometrik dilakukan pada 2 Hz dengan menerapkan potensi tetap plus 0.7 V, dan data didigitalkan (FAST-16 potensiostat, Quainton, Nicholasville, KY). Arus latar distabilkan selama 60 menit, kemudian obat dioleskan ke dalam hipokampus menggunakan kapiler kaca (diameter ujung: 15 m) yang dipasang pada elektroda. Pelepasan ACh yang dibangkitkan depolarisasi diukur dengan menerapkan pulsa kalium singkat (KCl 70 mM; 100 NL) atau NIC (1 mM freebase, nikotin tartrat; 100 NL) pada 2 hingga 10 psi setiap 2 menit. Rekaman diimbangi untuk wilayah hippocampal (dorsal atau ventral) dan obat (kalium atau NIC). Amplitudo sinyal kolin diukur dengan perubahan arus pada saluran berlapis enzim dari arus dasar dan diubah menjadi M setara kolin berdasarkan kalibrasi in vitro. Referensi diri diadopsi untuk menghilangkan artefak dengan mengurangi arus dari saluran sentinel. Penempatan mikroelektroda diverifikasi dengan pewarnaan Nissl pada bagian koronal hipokampus (Gambar S1). Rata-rata dua tanggapan per manipulasi obat per hewan digunakan untuk analisis statistik.
2.8 Analisis statistik
Perbandingan statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS (IBM, Armonk, NY) atau GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Pencilan ditentukan dengan nilai 2 standar deviasi di atas rata-rata. Jika outlier terdeteksi, informasi tersebut disertakan di bagian hasil. Kriteria signifikansi ditetapkan pada=0,05. Analisis statistik awalnya dilakukan termasuk jenis kelamin sebagai faktor untuk semua percobaan menguji keturunan laki-laki dan perempuan. Analisis runtuh pada jenis kelamin ketika interaksi tiga arah atau dua arah dengan jenis kelamin tidak terdeteksi (P > 0,05). Data dianalisis dengan uji-t, 1-way, atau 2-way ANOVA, yang sesuai. Efek utama atau interaksi yang signifikan diikuti oleh perbandingan post hoc LSD. Tindakan berulang ANOVA diikuti oleh perbandingan post hoc Bonferroni dengan koreksi untuk beberapa perbandingan. Jika varians yang tidak sama terdeteksi, uji t Welch untuk varians yang tidak sama digunakan dan derajat kebebasan dibulatkan ke bawah.
2.9 Isolasi RNA/DNA
Tikus F1 dewasa (8 minggu; n=3 M dan 3 F per kelompok) di-eutanasia melalui dislokasi serviks. Hippocampi dengan cepat dibedah menjadi bagian ventral dan dorsal (dalam rasio 1: 1), dikumpulkan dari sisi kiri dan kanan, dan flash dibekukan di atas es kering. DNA dan RNA diisolasi bersama dan dimurnikan menggunakan Kit Mini AllPrep DNA/RNA (Qiagen, Valencia, CA). Konsentrasi dan kualitas RNA dan DNA dievaluasi menggunakan NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) dan Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Untuk ekstraksi RNA, RNA Integrity Number (RIN) minimum adalah 8,5.
2.10 Analisis transkriptom melalui
Pustaka pengurutan RNA disiapkan oleh Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) untuk pembacaan ujung tunggal 150 bp menggunakan Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) dan diurutkan pada Illumina HiSeq 2500 dalam mode lari cepat (tiga kali berturut-turut dengan sekitar 10 juta pembacaan per sampel). File FASTQ diperiksa kualitasnya melalui FASTQC dan memiliki skor kualitas Phred rata-rata per baca lebih besar dari 30 (yaitu, kesalahan pengurutan kurang dari 0,1 persen). File FASTQ disejajarkan dengan genom referensi mouse (mm10; UCSC Genome Browser) menggunakan TopHat (v2.1.0)32 di Galaxy Project33. Manset dan Manset (v2.2.1.0)34 digunakan untuk merakit transkrip dari bacaan yang dipetakan dan menggabungkan file transkrip untuk perakitan transkriptom akhir. Tingkat penemuan palsu (FDR) nilai P yang disesuaikan dihitung untuk ekspresi gen diferensial dari sampel NIC-Sired dan SAL-Sired menggunakan Cuffdiff (v2.2.1.3),34 dengan standar FDR cut-off 0,05,35 Dataset transkriptom disimpan ke Omnibus Ekspresi Gen.
2.11 Analisis pengayaan
Gen yang diekspresikan secara berbeda dianalisis menggunakan analisis jalur kecerdikan (IPA, dijalankan Desember 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 untuk mengungkapkan potensi pengayaan jaringan biologis asosiatif. Jalankan parameter yang ditentukan maksimum 35 molekul per jaringan gen dan analisis terbatas pada jaringan atau garis sel SSP mamalia. Signifikansi statistik untuk pengayaan ditentukan menggunakan uji eksak Fisher yang dikoreksi untuk beberapa pengujian.
2.12 Pengurutan bisulfit yang ditargetkan
DNA yang diisolasi bersama dengan RNA (lihat Bagian 2.9) digunakan untuk analisis metilasi DNA. RNA-seq mengidentifikasi 952 dan 162 gen yang diekspresikan secara berbeda dalam vHPC dan DHCP, masing-masing. 1010 gen unik dari daftar gabungan ini dipilih untuk pengayaan dalam bisulfit-seq menggunakan Sistem Pengayaan Epi SeqCap kustom (Roche, Pleasanton, CA, USA; Tabel S1).38 Bisulfit yang ditargetkan sekuensing dilakukan di Penn State Huck Institutes dari Life Sciences Genomics Core Facility. Perpustakaan dibangun menggunakan kit KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Pustaka yang dikonversi natrium bisulfit diperkuat dan diperkaya PCR untuk wilayah genomik yang dipilih menggunakan set probe tangkapan khusus (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). DNA yang ditangkap diurutkan pada Illumina HiSeq 2500 menggunakan pembacaan akhir berpasangan 100 nt. File FASTQ diperiksa kualitasnya melalui FASTQC. Urutan adaptor Illumina dihilangkan dan alas berkualitas rendah dipangkas menggunakan Trimmomatic.39 Pemangkasan alas berkualitas rendah dilakukan dengan pendekatan jendela geser, pemangkasan ketika kualitas rata-rata dalam empat jendela pasangan basa turun di bawah ambang batas 20, dengan panjang baca minimum 35. Setelah pemangkasan, file FASTQ memiliki skor kualitas Phred rata-rata per baca lebih besar dari 30 (yaitu, kesalahan pengurutan kurang dari 0,1 persen). Bacaan yang dipangkas dipetakan ke genom referensi tikus (mm10) menggunakan Bowtie240 yang diimplementasikan dalam Bismark.41 Ekstrak metil_dalam Bismark digunakan untuk mengekstrak informasi metilasi CpG dan untuk membuat laporan metilasi. MethylKit42 digunakan untuk analisis daerah termetilasi diferensial (DMRs). Status metilasi diringkas melalui jendela yang tidak tumpang tindih dari 500 pasangan basa dan analisis metilasi diferensial dilakukan, dengan FDR standar 0,05,35 Kumpulan data telah disimpan ke Omnibus Ekspresi Gen.
Manfaat ekstrak cistanche
3. HASIL
3.1 Nikotin ayah meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual dan membalikkan peningkatan nikotin akut dari pengkondisian ketakutan kontekstual pada tikus generasi F1 dan F2
Tikus jantan dan betina NIC-Sired dan SAL-Sired F1 dikondisikan ketakutan setelah pemberian SAL atau NIC akut (0.09 mg/kg ip, Gambar 1A). Analisis lengkap dari baseline, pra-CS, dan pembekuan CS disertakan dalam Informasi Pendukung. ANOVA 3-arah dari pembekuan kontekstual dengan pengobatan pejantan, pengobatan akut, dan jenis kelamin sebagai faktor mengungkapkan pejantan × interaksi pengobatan akut pejantan (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" karena="" tidak="" ada="" interaksi="" yang="" signifikan="" antara="" jenis="" kelamin="" dan="" pejantan="" atau="" pengobatan="" obat="" akut,="" anova="" 2-arah="" yang="" diciutkan="" di="" antara="" jenis="" kelamin="" dilakukan="" dan="" mengungkapkan="" pengobatan="" pejantan="" yang="" signifikan="" ×="" interaksi="" pengobatan="" obat="" akut="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< .001).="" perbandingan="" post="" hoc="" menunjukkan="" bahwa="" tikus="" nic-sired="" f1="" yang="" diberi="" garam="" menunjukkan="" pengkondisian="" ketakutan="" kontekstual="" yang="" ditambah="" dibandingkan="" dengan="" tikus="" f1="" sal-sired="" yang="" diberi="" garam="" (t20="2.73," p=""><.05). sejalan="" dengan="" temuan="" sebelumnya,43="" nic="" akut="" pada="" 0,09="" mg/kg="" menghasilkan="" pengkondisian="" ketakutan="" kontekstual="" yang="" ditingkatkan="" pada="" tikus="" sal-sired="" (t22="2.99," p=""><.01). namun,="" nic="" akut="" pada="" 0,09="" mg/kg="" mengganggu="" pengkondisian="" ketakutan="" kontekstual="" pada="" tikus="" yang="" dikandung="" nic="" (t18="3.36," p=""><.01). secara="" keseluruhan,="" tingkat="" pembekuan="" konteks="" pada="" tikus="" nic-sired="" nic="" sebanding="" dengan="" yang="" diamati="" pada="" tikus="" sal-sired="" sal="" pada="" keduanya="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).
Selain itu, hewan NIC- dan SAL-Sired jantan dan betina diuji dalam sensitivitas goncangan (Gambar S2), labirin plus yang ditinggikan (EPM, Gambar S3), bidang terbuka, dan paradigma pengenalan objek baru (Gambar S4, lihat Informasi Pendukung untuk metode lengkap dan hasil). Dengan pengecualian betina NIC-Sired di EPM (yang menunjukkan peningkatan perilaku seperti kecemasan) dan hewan NIC-Sired dalam sensitivitas shock (yang menunjukkan penurunan reaktivitas vokal terhadap syok, yang tidak akan mengacaukan fenotipe multigenerasi belajar ketakutan yang ditingkatkan), tidak ada perbedaan terdeteksi antara tikus NIC- dan SAL-Sired.
GAMBAR 1 Nikotin ayah meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual dan melemahkan peningkatan nikotin akut dari pengkondisian rasa takut. Pembekuan kontekstual secara signifikan lebih tinggi pada NIC-Sired plus SAL dibandingkan dengan kontrol SAL-Sired plus SAL. Nikotin akut pada 0.09 mg/kg meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual pada SAL-Sired tetapi secara signifikan mengurangi pengkondisian ketakutan kontekstual pada hewan NIC-Sired (n=10-12 per kelompok). B, Pembekuan kontekstual secara signifikan lebih tinggi pada NIC-grandsire plus SAL dibandingkan dengan SAL-grandsire plus kontrol SAL (n=9-11 per kelompok). Bilah kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata (SEM), *P <>
Untuk menentukan apakah gangguan pengkondisian ketakutan kontekstual berlanjut ke generasi berikutnya (F2), NIC-grandsire dan SAL-grandsire jantan dan betina tikus F2 dibiakkan dari tikus jantan F1 naif. Analisis lengkap dari baseline, pra-CS, dan pembekuan CS disertakan dalam Informasi Pendukung. ANOVA 3 arah dari pembekuan kontekstual dilakukan dengan pengobatan grandsire, pengobatan obat akut, dan jenis kelamin sebagai faktor independen (Gambar 1B). Karena tidak ada interaksi yang signifikan antara jenis kelamin dan pejantan atau pengobatan obat akut, ANOVA 2 arah runtuh di antara jenis kelamin dilakukan. Efek utama yang signifikan dari pejantan (F(1,37)=9.88, P < .01)="" ditemukan,="" dan="" perbandingan="" post="" hoc="" menunjukkan="" bahwa="" tikus="" nic-kakek="" menunjukkan="" pengkondisian="" ketakutan="" kontekstual="" yang="" ditambah="" dibandingkan="" dengan="" tikus="" sal-kakek="" (t39="3.04," p=""><0,01). selain="" itu,="" tikus="" sal-kakek="" yang="" diberikan="" nic="" akut="" telah="" meningkatkan="" pengkondisian="" ketakutan="" kontekstual="" (t19="2.41," p="0.026)" tetapi="" nic="" akut="" tidak="" meningkatkan="" pengkondisian="" ketakutan="" kontekstual="" pada="" tikus="">
GAMBAR 2 Nikotin ayah meningkatkan pengkondisian ketakutan yang ditandai dan pemulihan spontan memori ketakutan. Untuk menguji potensi efek langit-langit selama pengujian isyarat, kelompok tikus F1 terpisah menerima pelatihan identik dengan hanya satu pasangan CS-US. Pengkondisian ketakutan kontekstual dan isyarat ditingkatkan pada tikus NIC-Sired dibandingkan dengan tikus SAL-Sired yang dilatih dengan 1 pasangan CS-US (n=8-10 per kelompok). B, Paparan nikotin ayah tidak mempengaruhi kepunahan ketakutan kontekstual tetapi meningkatkan pemulihan spontan dari memori ketakutan 7 hari setelah sesi kepunahan terakhir (n=8-10 per kelompok). Bilah kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata (SEM), *P <>
3.2 Nikotin ayah meningkatkan pengkondisian ketakutan isyarat pada tikus generasi F1
Untuk memeriksa apakah efek langit-langit menghalangi deteksi perbedaan kelompok untuk pengkondisian ketakutan yang ditandai (lihat Informasi Pendukung), kelompok tikus F1 yang terpisah dilatih dengan satu pasangan CS-US. Dalam kohort ini, peningkatan pengkondisian ketakutan kontekstual (t7=3.21, P <.05) serta="" pengkondisian="" ketakutan="" isyarat="" ditemukan="" pada="" tikus="" nic-sired="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" gambar="">
3.3 Nikotin ayah meningkatkan pemulihan spontan memori ketakutan kontekstual pada tikus generasi F1
Kohort tikus F1 yang menerima satu pasangan CS-US kemudian diuji untuk kepunahan dan pemulihan spontan dari memori ketakutan kontekstual. Tikus F1 NIC-Sired menunjukkan kepunahan rasa takut yang normal tetapi menunjukkan peningkatan pemulihan spontan dari memori ketakutan kontekstual relatif terhadap tikus SAL-Sired (t7=3.38, P <0.05; gambar="">
3.4 Nikotin ayah menurunkan pemberian sendiri nikotin
Sebelum pelatihan untuk pemberian nikotin sendiri, subjek dianalisis kemampuannya untuk mempelajari tugas operan untuk mendapatkan hadiah makanan, dan tidak ada perbedaan yang diamati (Informasi pendukung, Gambar S5). Untuk menguji efek potensial dari paparan nikotin tuan pada penguatan nikotin pada keturunan F1, akuisisi pemberian sendiri nikotin IV (0.03 mg/kg/infus) dinilai dalam ANOVA desain campuran 2 arah, yang mengidentifikasi efek utama dari sesi (F(7.119)=13.60, P < .001)="" dan="" sesi="" ×="" interaksi="" perawatan="" bapak="" (f(7.119)="5.00," p="">< .001).="" namun,="" tes="" post="" hoc="" tidak="" mengungkapkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" secara="" statistik="" antara="" kelompok="" pada="" masing-masing="" dari="" delapan="" sesi="" akuisisi="" (gambar="" 3a).="" jumlah="" penekanan="" tuas="" aktif="" dan="" tidak="" aktif="" kemudian="" dianalisis="" untuk="" menentukan="" apakah="" kelompok="" mempertahankan="" preferensi="" lintas="" sesi="" untuk="" tuas="" aktif="" selama="" akuisisi="" (gambar="" 3b),="" yang="" mengidentifikasi="" efek="" utama="" sesi="" (f(7.238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" dan="" sesi="" ×="" interaksi="" perawatan="" bapak="" (f="" (21,238)="11.40," p="">< .001).="" analisis="" post="" hoc="" mengungkapkan="" bahwa="" kelompok="" berbeda="" pada="" hari="" pertama="" pemberian="" nikotin="" sendiri.="" kelompok="" nic-sired="" menunjukkan="" penekanan="" tuas="" aktif="" yang="" lebih="" besar="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" sal-sired.="" efek="" ini="" dapat="" mewakili="" tingkat="" yang="" lebih="" besar="" dari="" perilaku="" mencari="" obat="" pada="" hari="" pertama="" paparan,="" ketekunan="" merespons="" hadiah="" makanan="" dan/atau="" penurunan="" fleksibilitas="" kognitif="" dalam="" transisi="" respons="" dari="" makanan="" ke="" obat.="" namun,="" perbedaan="" ini="" tidak="" bertahan="" di="" sesi="" lebih="" lanjut.="" tikus="" sal-sired="" menunjukkan="" preferensi="" yang="" signifikan="" secara="" statistik="" untuk="" tuas="" aktif="" daripada="" tuas="" tidak="" aktif="" mereka="" (post="" hoc="" p=""><0,01), tetapi="" tikus="" nic-sired="" tidak="" menunjukkan="" preferensi="" yang="" dipertahankan="" ini="" untuk="" sesi="" 3="" hingga="">
GAMBAR 3 Nikotin ayah mengurangi pemberian sendiri nikotin. Tikus jantan NIC- dan SAL-Sired (n=9-10 per kelompok) tidak berbeda dalam jumlah total infus yang diperoleh untuk setiap sesi selama periode akuisisi pada 0 0,03 mg/kg/dosis infus. B, Selama akuisisi, jumlah penekanan tuas aktif dan tidak aktif berbeda secara signifikan pada sesi pertama, dengan tikus NIC-Sired nikotin menunjukkan jumlah yang lebih besar dari tekanan tuas aktif dibandingkan dengan tikus SAL-Sired. Namun, di sesi berikutnya, tikus NIC-Sired menurun merespons, menghasilkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara jumlah penekanan tuas aktif dan tidak aktif mereka di sesi 3 hingga 8. Sebaliknya, hewan SAL-Sired menunjukkan preferensi yang signifikan secara statistik untuk tuas aktif. atas tuas tidak aktif mereka. C, Rata-rata jumlah infus nikotin di tiga sesi akuisisi terakhir tidak berbeda secara signifikan antara tikus NIC- dan SAL-Sired. D, Pada dosis sedang 0,1 mg/kg/infus, tikus NIC-Sired memberikan sendiri jumlah infus nikotin yang jauh lebih rendah. E, Inkubasi penilaian keinginan mengungkapkan peningkatan yang signifikan dalam menanggapi tuas yang sebelumnya aktif setelah 21 hari pantang hanya untuk tikus SAL-Sired. Bilah kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata (SEM), *P <>
Untuk memeriksa lebih lanjut perbedaan kelompok potensial sambil mengendalikan variabilitas selama fase awal akuisisi, jumlah rata-rata infus nikotin diperiksa selama tiga sesi terakhir, waktu di mana subjek menunjukkan respons yang lebih konsisten untuk nikotin (Gambar 3C). Kelompok tidak berbeda secara signifikan dalam jumlah rata-rata infus nikotin (P > .05). Setelah itu, tikus dialihkan ke dosis nikotin 0,1 mg/kg/infus, yang sebelumnya terbukti lebih disukai pada tikus dewasa C57BL6/J.44 Pada dosis ini, tikus NIC-Sired memberikan sendiri jumlah infus yang lebih rendah (t{ {7}}.20, P < .05;="" gambar="" 3d).="" untuk="" inkubasi="" perilaku="" mengidam,="" yang="" dianggap="" sebagai="" ukuran="" peningkatan="" pencarian="" obat="" selama="" berpantang,="" anova="" desain="" campuran="" 2="" arah="" dengan="" perawatan="" sesi="" dan="" pejantan="" mengidentifikasi="" efek="" utama="" dari="" sesi="" tersebut="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" sementara="" hewan="" sal-sired="" menunjukkan="" efek="" inkubasi="" dengan="" respons="" yang="" lebih="" besar="" pada="" hari="" ke="" 21="" pantang="" dibandingkan="" dengan="" hari="" 1,="" tikus="" nic-sired="" tidak="" menunjukkan="" peningkatan="" perilaku="" pencarian="" nikotin="" (p=""><>
3.5 Paparan nikotin dari ayah mengubah ikatan dan fungsi kolinergik hipokampus
Pengikatan nAChR heteromerik hippocampal afinitas tinggi diregulasi pada tikus NIC-Sired F1 (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0,044).="" satu="" subjek="" (nic-sired)="" dihapus="" karena="" nilai="" pengikatan="" adalah="" dua="" standar="" deviasi="" di="" atas="">
Rekaman amperometrik arus ACh yang ditimbulkan oleh kalium dan nikotin dinilai dalam F1 dHPC dan vHPC. Karena ukuran sampel yang tidak merata per jenis kelamin, jenis kelamin tidak dimasukkan sebagai faktor awal dalam analisis ini. Sinyal kolinergik yang dibangkitkan depolarisasi KCl tidak berbeda antara tikus SAL- dan NIC-Sired di dHPC (P > .05; Gambar 4A); namun, aplikasi nikotin lokal menghasilkan penurunan yang signifikan dalam amplitudo sinyal kolinergik pada tikus NIC-Sired (t8=2.33, P <.05; gambar="" 4c).="" dalam="" vhpc,="" pelepasan="" ach="" menurun="" pada="" tikus="" nic-sired="" setelah="" aplikasi="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; gambar="" 4b)="" atau="" nikotin="" (t8="2.98," p=""><.05 ;="" gambar="">
GAMBAR 4 Nikotin ayah mengurangi sinyal kolinergik di hipokampus. Sinyal kolin populasi dHPC ditimbulkan oleh depolarisasi terminal yang diinduksi KCl. Tidak ada perbedaan signifikan yang terdeteksi antara hewan NIC- dan SAL-Sired (n=5 per kelompok). B, sinyal kolin populasi vHPC yang ditimbulkan oleh depolarisasi terminal yang diinduksi KCl berkurang pada tikus NIC-Sired. C, sinyal kolin dHPC populasi yang dibangkitkan nikotin berkurang pada tikus NIC-Sired. D, sinyal kolin vHPC populasi yang dibangkitkan nikotin berkurang pada tikus NIC-Sired. Tidak ada efek seks pada sinyal kolinergik yang diamati. Bilah kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata (SEM), *P <>
3.6 Paparan nikotin ayah secara berbeda mengubah ekspresi gen hipokampus dorsal dan ventral
Analisis transkriptom hippocampal F1 melalui pengurutan RNA mengungkapkan 952 gen yang diekspresikan secara berbeda dalam vHPC (FDR=0.05; Tabel S2). Dari gen-gen ini, 612 diturunkan regulasi dan 340 diregulasi pada tikus NIC-Sired. Dalam dHPC, hanya 162 gen yang diekspresikan secara berbeda pada tikus NIC-Sired dibandingkan dengan tikus SAL-Sired (FDR=0.05). Dari 162 gen ini, 86 diturunkan regulasi dan 76 diregulasi. Seratus tiga gen dengan ekspresi gen yang berubah tumpang tindih antara vHPC dan dHPC.
3.7 Paparan nikotin dari ayah mengubah jalur transkripsi yang terlibat dalam pengembangan sistem saraf
Dalam vHPC, analisis IPA mengidentifikasi jaringan teratas "Penyakit Neurologis, Cedera dan Kelainan Organisme, Kematian dan Kelangsungan Hidup Sel" (skor=41, Tabel S3) dan jaringan teratas kedua "Pengembangan dan Fungsi Sistem Saraf, Morfologi Jaringan, Neurologis Penyakit" (skor=23). Lima kategori Fungsi Molekuler dan Seluler teratas adalah: "Morfologi sel" (88 molekul), "Perakitan dan Organisasi Seluler" (79 molekul), "Pengembangan Seluler" (96 molekul), "Fungsi dan Pemeliharaan Seluler" (79 molekul), dan "Pertumbuhan dan Proliferasi Seluler" (87 molekul). Pengembangan dan Fungsi Sistem Fisiologis teratas adalah "Perkembangan dan Fungsi Sistem Saraf" (175 molekul), dan beberapa Fungsi Penyakit dan Gangguan teratas termasuk "Penyakit Neurologis" (kedua, 191 molekul) dan "Gangguan Psikologis" (keempat, 90 molekul ) (Tabel S4).
Melengkapi hasil IPA, analisis pengayaan menggunakan Enrichr memberikan bukti lebih lanjut untuk perubahan dalam pertumbuhan dan perkembangan seluler di vHPC, dengan istilah biologis GO teratas termasuk "RNA splicing," "respons terhadap protein yang tidak dilipat," dan "regulasi pertumbuhan sel" dan " stabilisasi protein" (Tabel S5). Sejalan dengan itu, "kompleks spliceosomal" diidentifikasi sebagai istilah seluler GO teratas. Analisis jalur KEGG melalui Enrichr juga menunjukkan fungsi spliceosome dan pensinyalan MAPK sebagai jalur yang berpotensi terpengaruh.
Meskipun daftar gen yang diekspresikan secara berbeda jauh lebih pendek dalam dHPC dibandingkan dengan vHPC, jalur dan istilah yang diperkaya dHPC yang serupa diidentifikasi (Tabel S3 dan S4). Analisis IPA mengidentifikasi jaringan teratas "Perilaku, Penyakit Neurologis, Cedera Organisme dan Abnormalitas" (skor=24) dan jaringan teratas kedua "Penyakit Neurologis, Cedera dan Kelainan Organisme, dan Gangguan Psikologis (skor=20) .
Lima kategori Fungsi Molekuler dan Seluler teratas dalam dHPC adalah "Perkembangan Seluler" (29 molekul), "Pertumbuhan dan Proliferasi Seluler" (29 molekul), "Morfologi Sel" (27 molekul), "Perakitan dan Organisasi Seluler" (23 molekul) , dan "Fungsi dan Pemeliharaan Seluler" (25 molekul). "Pengembangan dan Fungsi Sistem Saraf" kembali diidentifikasi sebagai istilah paling kaya di bawah klasifikasi Fungsi dan Pengembangan Sistem Fisiologis (kedua, 44 molekul). Istilah yang diperkaya teratas di bawah klasifikasi Fungsi Penyakit dan Gangguan termasuk "Penyakit Neurologis" (1, 51 molekul), dan "Gangguan Psikologis" (kelima, 31 molekul). Analisis pengayaan menggunakan Enrichr mengidentifikasi beberapa istilah biologis GO yang berbeda untuk dHPC dibandingkan dengan vHPC, termasuk "regulasi kematian neuron" dan "perkembangan otak" (Tabel S5), yang melengkapi fungsi molekuler dan seluler IPA "Kematian dan Kelangsungan Hidup Sel".
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut peran fungsional transkrip yang diekspresikan secara berbeda yang tumpang tindih antara dHPC dan vHPC, gen yang diekspresikan secara berbeda yang umum untuk kedua wilayah (total 103) dievaluasi. Tumpang tindih transkrip yang diekspresikan secara berbeda antara kedua wilayah semuanya diregulasi ke bawah atau diregulasi ke arah yang sama, menunjukkan perubahan umum dalam jalur transkripsi di seluruh wilayah otak pada tikus yang memiliki NIC. Lima kategori Fungsi Molekuler dan Seluler teratas yang diidentifikasi oleh IPA adalah "Kematian dan Kelangsungan Hidup Sel" (17 molekul), "Gerakan Seluler" (10 molekul), "Pensinyalan dan Interaksi Sel-ke-Sel" (17 molekul), "Pertumbuhan Seluler dan Proliferasi" (18 molekul), dan "Morfologi Sel" (17 molekul) (Tabel S4)
Gen yang diekspresikan secara berbeda unik untuk dHPC dan vHPC kemudian dianalisis secara terpisah dalam IPA untuk menguji adaptasi neurobiologis yang berbeda antara kedua wilayah (Tabel S6). Tidak ada jalur kanonik yang diperkaya yang tumpang tindih antara analisis unik dHPC vHPC. Jalur kanonik yang diperkaya teratas yang unik untuk vHPC (total 44) termasuk "Pensinyalan kalsium" dan "Pensinyalan reseptor glukokortikoid," sementara jalur kanonik dHPC teratas (total delapan) termasuk "Metabolisme Hormon Tiroid" dan "Pensinyalan Apoptosis yang Dimediasi asam retinoat." Penyakit dan fungsi yang diperkaya unik untuk vHPC (total 295) termasuk "Pembentukan [Hippocampus] Ammon's Horn" dan "Jumlah Tonjolan Seluler" sementara istilah penyakit dan fungsi yang diperkaya secara unik dHPC (total 111) termasuk "Peradangan materi putih" dan "Demyelination ."
3.8 Paparan nikotin dari ayah mengubah metilasi DNA hipokampus
Analisis metilasi DNA yang ditargetkan dilakukan untuk menentukan apakah metilasi DNA yang diubah di daerah regulasi yang sesuai menyumbang ekspresi gen diferensial pada keturunan NIC-Sired F1. Target termasuk 1114 gen yang diekspresikan secara berbeda yang diidentifikasi dalam dHPC atau vHPC. Dalam vHPC, 11 daerah metilasi diferensial (DMR) terdeteksi, dengan delapan menunjukkan peningkatan metilasi dan tiga menunjukkan penurunan metilasi (Tabel 1). Dari 11 DMR, 10 terletak di daerah yang terkait dengan gen yang menunjukkan ekspresi yang berubah di vHPC. Dalam dHPC, 30 DMR terdeteksi, dengan 15 menunjukkan peningkatan metilasi dan 15 menunjukkan penurunan metilasi. Dari 30 DMR, 29 terletak di daerah yang terkait dengan gen yang menunjukkan ekspresi yang berubah di dHPC.
Benkhasiat cistanche echincoside
4. DISKUSI
Peningkatan pemahaman proses epigenetik dalam hubungannya dengan data terbaru, termasuk temuan ini, telah menantang pemahaman tradisional tentang pewarisan. Faktor-faktor di luar genotipe saja dapat menentukan fenotipe pada generasi berikutnya, dan paparan dalam satu generasi mungkin tidak dipisahkan dari keturunan. Penelitian ini menunjukkan bahwa efek kesehatan yang merugikan dari paparan nikotin dapat melampaui paparan individu dan mempengaruhi generasi berikutnya. Kami mengidentifikasi efek multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin paternal prakonsepsi pada tikus C57BL / 6J pada pengkondisian ketakutan Pavlov, menghasilkan ingatan ketakutan yang lebih kuat pada keturunan F1 dan F2. Paparan nikotin dari ayah juga mengakibatkan penurunan pemberian nikotin sendiri dan perilaku terkait kekambuhan yang dilemahkan, menunjukkan respons permusuhan yang lebih besar terhadap nikotin. Untuk mendukung perbedaan perilaku ini, perubahan multigenerasi dalam fungsi kolinergik hipokampus dan proses epigenetik diamati. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan perubahan fungsi sistem saraf pada keturunan tikus yang terpapar nikotin yang mengakibatkan perubahan fenotipe perilaku.
Keturunan F1 dan F2 dari tikus jantan yang terpapar nikotin menunjukkan pengkondisian ketakutan kontekstual dan isyarat yang ditingkatkan. Meskipun tidak ada perbedaan dalam kepunahan rasa takut kontekstual antara tikus F1 NIC- dan SAL-Sired, tikus NIC-Sired menunjukkan peningkatan pemulihan spontan dari ingatan ketakutan kontekstual. Yang penting, tidak ada perbedaan sensitivitas kejutan antara tikus NIC- dan SAL-Sired yang dapat menjelaskan peningkatan pengkondisian rasa takut yang ditemukan. Pengkondisian rasa takut yang ditingkatkan mungkin menyarankan peningkatan umum proses pembelajaran sebagai lawan dari modulasi proses yang lebih spesifik untuk rasa takut untuk belajar. Namun, tidak ada perubahan dalam pengenalan objek baru, pelatihan makanan operan, atau penggerak lapangan terbuka yang diamati pada tikus NIC-Sired, meskipun efek spesifik jenis kelamin dari peningkatan waktu lengan terbuka EPM pada tikus betina NIC-Sired telah diidentifikasi. Meskipun ini tidak mengesampingkan potensi modifikasi pada sistem pembelajaran atau proses kognitif lainnya, temuan ini bersama-sama menunjukkan bahwa pembelajaran rasa takut mungkin lebih sensitif terhadap efek multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin ayah. Selain itu, temuan ini menunjukkan fungsi kolinergik yang berubah pada hewan NIC-Sired. Nikotin memodulasi pengkondisian ketakutan kontekstual. Sedangkan nikotin akut meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual, 15,45 penarikan dari nikotin kronis mengganggu pengkondisian ketakutan kontekstual. 16,21 Dalam penelitian ini, nikotin akut meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual pada tikus F1 dan F2 dari tikus yang diberi garam. Sebaliknya, pengkondisian ketakutan kontekstual yang terganggu nikotin akut pada tikus NIC-Sired dan tidak berpengaruh pada tikus NIC-grandsire, yang mungkin menunjukkan perubahan fungsi kolinergik di hippocampus.
Efek paparan nikotin ayah pada pemberian nikotin berikutnya pada generasi F1 juga menunjukkan gangguan fungsi kolinergik. Selama perolehan pemberian sendiri nikotin IV pada dosis yang lebih rendah, kelompok tidak berbeda dalam jumlah infus nikotin, meskipun peningkatan jumlah penekanan tuas aktif ditemukan pada kelompok NIC-Sired. Ini menunjukkan bahwa tikus NIC-Sired mungkin telah menunjukkan ketekunan dalam menanggapi hadiah makanan dan / atau penurunan fleksibilitas kognitif dalam transisi merespons dari makanan ke obat. Namun, penting juga untuk dicatat bahwa kelompok-kelompok tersebut tidak berbeda pada hari pertama inkubasi keinginan, yang mewakili sesi kepunahan (misalnya, tidak ada infus nikotin selama sesi), dan dengan demikian, efek ini tampaknya telah ada ketika penguat diberikan. diaktifkan tetapi tidak dengan tidak adanya penguat selama sesi pemadaman. Tikus NIC-Sired juga menunjukkan penurunan pemberian nikotin sendiri pada dosis sedang, yang sejalan dengan penelitian terbaru yang mengidentifikasi penurunan alkohol, kokain, dan pemberian opioid yang terkait dengan paparan alkohol, kokain, dan morfin orang tua (misalnya Vassoler et al,46 sebagai ditinjau di Goldberg dan Gould47). Pengurangan yang diamati dalam pemberian nikotin sendiri dapat dikaitkan dengan penurunan sensitivitas terhadap efek menguntungkan nikotin dan / atau peningkatan sensitivitas terhadap efek permusuhan nikotin. Memang, kelompok berbeda pada dosis nikotin moderat tetapi tidak pada dosis nikotin yang lebih rendah, yang mendukung gagasan peningkatan respons permusuhan dengan dosis yang lebih tinggi. Menariknya, kami juga menemukan kurangnya inkubasi hasrat pada hari ke 21 pada tikus NIC-Sired setelah pemberian sendiri pada dosis sedang, menunjukkan bahwa penurunan perilaku mencari nikotin dapat dikaitkan dengan memori terkait keengganan untuk nikotin. Meskipun berbagai substrat saraf mungkin mendasari efek ini pada asupan nikotin dan respons terkait kekambuhan, penelitian terbaru menemukan bahwa penurunan DNA methyltransferase di wilayah CA1 hipokampus mengurangi pemberian sendiri morfin. Temuan ini, bersama dengan fungsi fungsi hipokampus kolinergik yang diketahui pada proses pembelajaran dan memori, lebih lanjut mendukung gagasan pemrosesan yang dimediasi nikotin yang terganggu di hippocampus tikus NIC-Sired.
Sepanjang garis ini, tikus NIC-Sired menunjukkan peningkatan pengikatan nAChR afinitas tinggi hipokampus. Kami juga menemukan pengurangan pelepasan ACh yang dibangkitkan kalium di vHPC serta dalam pelepasan ACh yang dibangkitkan nikotin di dHPC dan vHPC hewan NIC-Sired. Perubahan pelepasan ACh yang dibangkitkan depolarisasi mencerminkan perubahan fungsi kolinergik di hilir pengikatan reseptor, sementara perubahan pelepasan ACh yang dibangkitkan nikotin mencerminkan perubahan fungsi nAChR. Data ini sejalan dengan temuan sebelumnya tentang pengikatan nAChR afinitas tinggi yang diregulasi setelah penurunan fungsi nAChR. 49 Karena pelepasan ACh yang dipicu oleh kalium dan nikotin diubah dalam vHPC tikus NIC-Sired, vHPC mungkin lebih sensitif terhadap efek multigenerasi dari paparan nikotin ayah. DHPC diketahui memodulasi pengkondisian ketakutan kontekstual.31,50 Penghambatan vHPC mengganggu kondisi ketakutan yang ditandai dan kontekstual ing51,52 dan lesi kolinergik vHPC merusak pengkondisian ketakutan yang ditandai.53
Cistanche herbal
Kami juga telah menunjukkan bahwa infus nikotin langsung ke dHPC meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual sementara infus ke vHPC mengganggu pengkondisian ketakutan kontekstual.15 vHPC juga dapat memodulasi pemulihan spontan dari ingatan ketakutan kontekstual, karena inaktivasi sirkuit vHPC-prelimbic mengurangi pemulihan spontan dari ingatan ketakutan kontekstual. 54 Sementara daerah otak lain yang terlibat dalam pengkondisian rasa takut, seperti amigdala,55 juga dapat dipengaruhi oleh paparan nikotin ayah, temuan ini bersama dengan data ini menunjukkan bahwa perubahan fungsi vHPC mungkin bertanggung jawab atas perubahan pengkondisian rasa takut pada tikus NIC-Sired. . Kami berhipotesis bahwa efek multigenerasi dari paparan nikotin ayah mungkin terkait dengan perubahan efektor transkripsional yang bekerja di hulu sistem saraf ini. Pengurutan transkripsi genom di vHPC dan dHPC dari tikus generasi F1 mengidentifikasi 1114 gen yang diekspresikan secara berbeda antara tikus NIC- dan SAL-Sired. Perbedaan ini lebih besar pada vHPC (952) dibandingkan dHPC (162), sejalan dengan perubahan yang lebih besar pada vHPC relatif terhadap fungsi kolinergik dHPC dan perubahan pada pengkondisian ketakutan kontekstual dan isyarat. Analisis jalur selanjutnya menyarankan perubahan luas pada jalur transkripsi yang terkait dengan pensinyalan glukokortikoid dan perkembangan / plastisitas saraf di kedua wilayah hippocampal.
Untuk mengidentifikasi adaptasi potensial khusus untuk vHPC, analisis jalur dilakukan hanya menggunakan transkrip khusus untuk subregion hippocampal. Tidak ada jalur kanonik IPA yang diperkaya yang tumpang tindih antara vHPC dan dHPC, yang secara fungsional merupakan subkawasan yang berbeda dari hippocampus.31 Ketika gen yang tumpang tindih antara dHPC dan vHPC dihilangkan, jalur kanonik yang diperkaya teratas yang unik untuk vHPC termasuk "Pensinyalan Reseptor Glukokortikoid," menunjukkan keunikan , perubahan tambahan pada fungsi glukokortikoid di wilayah ini dibandingkan dengan dHPC. Dengan tujuan mengidentifikasi regulator epigenetik hulu yang dapat bertindak pada ekspresi gen, kami melakukan pengurutan metilasi DNA yang ditargetkan menggunakan daftar kompilasi gen dHPC dan vHPC yang diekspresikan secara berbeda yang diidentifikasi dari sekuensing RNA. Anehnya, kami hanya menemukan 11 DMR di vHPC dan 30 DMR di dHPC antara hewan NIC- dan SAL-Sired. Meskipun ini tidak terduga mengingat jumlah transkrip yang diekspresikan secara berbeda jauh lebih tinggi dalam vHPC, metilasi DNA hanyalah salah satu dari beberapa faktor regulasi yang dapat memengaruhi ekspresi gen dan metilasi DNA tidak secara konsisten diterjemahkan ke dalam ekspresi gen yang diubah.56 Dari 11 vHPC DMR, tujuh menunjukkan pola metilasi yang konsisten dengan arah transkripsi diferensial (penurunan transkripsi dengan peningkatan metilasi DNA dan peningkatan transkripsi dengan penurunan metilasi). Gen termetilasi yang berbeda dalam vHPC termasuk Fkbp5, Ksr1, dan Pnpla2. Menariknya, transkripsi Fkbp5 dan Ksr1 terganggu dalam satu model tikus perilaku PTSD,57 di mana tikus terkena sengatan listrik dan kemudian disajikan pengingat situasional. Fkbp5 mengkode pendamping reseptor glukokortikoid yang fungsinya telah dikaitkan dengan respons stres berkepanjangan yang maladaptif pada individu dengan PTSD dan gangguan kecemasan lainnya.58
Secara khusus, penelitian pada manusia menunjukkan bahwa metilasi dan transkripsi Fkbp5 berkorelasi dengan keparahan gejala PTSD, sehingga peningkatan metilasi dan penurunan transkripsi memprediksi gejala PTSD yang lebih parah.59,60 Ekspresi Fkbp5 memodulasi fungsi sumbu HPA, yang diperkirakan memediasi keterlibatannya dalam PTSD.59,61 Temuan kami tentang peningkatan pemulihan spontan dari memori ketakutan dalam hubungannya dengan disregulasi jalur transkripsi yang terkait dengan pensinyalan glukokortikoid pada hewan NIC-Sired dapat menunjukkan peningkatan kerentanan terhadap fenotipe seperti PTSD. Dalam dHPC, pola DMR sebagian besar tidak konsisten dengan arah ekspresi transkrip diferensial yang ditemukan oleh sekuensing RNA, yang menunjukkan bahwa perubahan dalam metilasi DNA vHPC yang dihasilkan oleh paparan nikotin ayah lebih penting dalam hal memengaruhi ekspresi gen daripada yang ada di dHPC. Ini sejalan dengan identifikasi kami tentang lebih banyak transkrip yang diekspresikan secara berbeda dan perubahan yang lebih berlebihan dalam transmisi kolinergik di NIC-Sired vHPC dibandingkan dengan dHPC. Pendekatan sekuensing bertarget kami mungkin membatasi kemampuan untuk mendeteksi regulasi transkripsi potensial dengan sekuens termetilasi distal. Investigasi di masa depan termasuk analisis metilasi DNA genom-lebar, modifikasi histone, dan ekspresi RNA kecil akan memberikan interpretasi yang lebih lengkap dari temuan ini.
Batasan potensial dari desain paparan nikotin kami adalah fokus pada paparan nikotin ayah untuk menyelidiki dampak multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin. Meskipun penelitian lain menemukan fenotipe multi/transgenerasi setelah pajanan obat ayah, termasuk kokain46 dan morfin,62 tidak menemukan perbedaan dalam perawatan ibu, ada kemungkinan bahwa paparan nikotin ayah dapat berdampak pada perawatan ibu. Studi masa depan menyelidiki dampak pada perawatan ibu dibenarkan. Karena fokus kami saat ini adalah pada paparan ayah, pekerjaan di masa depan juga harus membandingkan dampak paparan ayah vs ibu. Secara keseluruhan, temuan ini memberikan pemahaman baru tentang efek multigenerasi dan transgenerasi dari paparan nikotin, yang didukung oleh literatur yang berkembang yang mencirikan efek multigenerasi dan transgenerasi dari paparan obat (seperti yang diulas dalam Goldberg dan Gould47). Studi ini adalah yang pertama menguji pengkondisian ketakutan kontekstual pada keturunan F1 dan F2 dari laki-laki yang terpapar nikotin dan mengidentifikasi peningkatan pembentukan memori ketakutan dan pemulihan spontan dari ingatan ketakutan. Studi ini juga yang pertama mengidentifikasi perubahan pemberian nikotin sendiri dan inkubasi keinginan pada keturunan yang terpajan nikotin F1.
Metilasi diferensial dalam gen yang terkait dengan PTSD dan disregulasi sumbu HPA serta gangguan bersamaan dalam jalur transkripsi terkait stres ditemukan pada tikus NIC-Sired. Nikotin ayah juga dikaitkan dengan penurunan fungsi kolinergik hipokampus dan peningkatan pengikatan nAChR hipokampus. Menariknya, pasien PTSD yang tidak merokok menunjukkan pengikatan nAChR afinitas tinggi kortikal mesiotemporal yang secara signifikan lebih tinggi63, dan PTSD dikaitkan dengan pengkondisian rasa takut yang lebih besar dan pemulihan spontan dari ingatan ketakutan yang padam.64 Bersama-sama, temuan kami menunjukkan bahwa paparan nikotin mungkin memiliki dampak multigenerasi dari meningkatkan kerentanan keturunan terhadap gejala mirip PTSD. Temuan ini bersama dengan temuan terbaru lainnya yang menunjukkan efek multi-generasi dari paparan nikotin pada fleksibilitas kognitif2 menunjukkan bahwa hasil kesehatan negatif dari paparan nikotin memberikan jaring yang lebih luas daripada yang diperkirakan sebelumnya.
Ekstrak cistanche
REFERENSI
1 Dai J, Wang Z, Xu W, dkk. Paparan nikotin ayah mendefinisikan perilaku yang berbeda pada generasi berikutnya melalui hipermetilasi mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.
2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, dkk. Paparan nikotin pada tikus jantan menghasilkan gangguan perilaku pada beberapa generasi keturunan. PLoS Biol. 2018;16(10):e20066497.
3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transmisi transgenerasi hiperaktif dalam model tikus ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.
4. Cummings KM, Proctor RN. Perubahan citra publik tentang merokok di Amerika Serikat: 1964-2014. Biomarker Epidemiol Kanker Sebelumnya. 2014;23(1):32-36.
5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Penggunaan rokok elektronik di kalangan siswa sekolah menengah dan hubungannya dengan penggunaan rokok dan berhenti merokok, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 dan 2013. Sebelumnya Chronic Dis. 2016;13:E103.
6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, dkk. Efek jangka panjang nikotin kronis pada perilaku emosional dan kognitif dan morfologi sel hipokampus pada tikus: perbandingan paparan nikotin dewasa dan remaja. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.
7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Hubungan antara merokok dan gangguan kecemasan selama masa remaja dan dewasa awal. JAMA. 2000;284:2348-2351.
8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, dkk. Mekanisme epigenetik memediasi efek nikotin perkembangan pada struktur dan perilaku saraf. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.
9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, dkk. Kolin memperbaiki defisit pembelajaran orang dewasa dan membalikkan modifikasi epigenetik faktor remodeling kromatin yang terkait dengan paparan nikotin remaja. Neurobiol Belajar Mem. 2018;155:239-248.
10. Burung A. Persepsi epigenetik. Alam. 2007;447:396-398.
11. Skinner MK. Warisan transgenerasi epigenetik lingkungan dan stabilitas mitosis epigenetik somatik. Epigenetik. 2011; 6:838-842.
12. Davis JA, Gould TJ. Pembelajaran asosiatif, hippocampus, dan kecanduan nikotin. Penyalahgunaan Narkoba Curr Rev. 2008;1:9-19.
13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Kecanduan nikotin dan gangguan kejiwaan. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.
14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Disfungsi nAChR sebagai substrat umum untuk skizofrenia dan kecanduan nikotin komorbiditas: tren dan perspektif saat ini. Skizofren Res. 2016;171:1-15.
15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Reseptor nikotinik di hippocampus dorsal dan ventral secara berbeda memodulasi pengkondisian ketakutan kontekstual. Hipokampus. 2012;22:1681-1690.
16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Latar belakang genetik mempengaruhi efek penarikan dari nikotin kronis pada pembelajaran dan reseptor asetilkolin nikotinik afinitas tinggi yang mengikat di hippocampus dorsal dan ventral. Psikofarmakologi (Berl). 2013;225(1): 201-208.
17. Davis JA, Gould TJ. Efek DHBE dan MLA pada peningkatan pengkondisian ketakutan kontekstual yang diinduksi nikotin pada tikus C57BL / 6 Psikofarmakologi (Berl). 2006;184:345-352.
18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Tikus pra-remaja dan remaja kurang sensitif terhadap efek nikotin akut pada kepunahan dan pemulihan spontan. Otak Res Banteng. 2018;138:50-55.
19. Kutlu MG, Gould TJ. Nikotin akut menunda kepunahan ketakutan kontekstual pada tikus Perilaku Otak Res. 2014;263:133-137.
20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3rd. Kimia nikotin, metabolisme, kinetika, dan biomarker. Dalam: Psikofarmakologi nikotin. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009:29-60.
21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Penarikan dari pemberian nikotin kronis merusak pengkondisian ketakutan kontekstual pada tikus C57BL / 6 J Neurosci. 2005;25:8708-8713.
22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Sebuah studi perbandingan disposisi nikotin dan metabolitnya pada tiga galur tikus inbrida. Pembuangan Metab Narkoba. 1984; 12:725-731.
23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, dkk. Durasi defisit terkait penarikan nikotin dalam pengkondisian ketakutan kontekstual paralel dengan perubahan dalam upregulasi reseptor asetilkolin nikotinik afinitas tinggi hipokampus. Neurofarmakologi. 2012;62:2118-2125.
24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. Penurunan kepunahan rasa takut kontekstual oleh nikotin kronis dan penarikan dari nikotin kronis dikaitkan dengan upregulasi nAChR hippocampal. Neurofarmakologi. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Karakterisasi penarikan nikotin spontan dan diendapkan pada tikus. J Pharmacol Exp Ada. 2003;307:526-534.
26. CD Fowler, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Pensinyalan subunit reseptor nikotinik alfa5 habenular mengontrol asupan nikotin. Alam. 2011;471:597-601.
27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Analisis kuantitatif reseptor nikotinik neuronal heteromer di hippocampus tikus. J Neurokimia. 2010;115:625-634.
28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Efek seperti ansiolitik paralel dan peningkatan regulasi reseptor asetilkolin nikotinat neuronal setelah nikotin kronis dan varenicline. Nikotin Tob Res. 2011;13:41-46.
29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontal beta2 subunit yang mengandung dan alpha7 nicotinic acetylcholine reseptor secara berbeda mengontrol glutamatergik dan kolinergik signaling. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.
30. Parikh V, Starter M. Sistem kolinergik dan kognisi otak depan: wawasan baru berdasarkan deteksi cepat lonjakan kolin menggunakan biosensor berbasis enzim. Dalam: Mikroelektroda Biosensor. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257-277.
31. Fanselow MS, Dong HW. Apakah struktur hippocampus dorsal dan ventral berbeda secara fungsional? saraf. 2010;65(1):7–19.
32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: penyelarasan transkriptom yang akurat dengan adanya penyisipan, penghapusan, dan fusi gen. Biola genom. 2013;14(4): R36.
33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, dkk. Platform Galaxy untuk analisis biomedis yang dapat diakses, direproduksi, dan kolaboratif: Pembaruan 2016. Asam Nukleat Res. 2016;44:W3-w10.
34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, dkk. Perakitan dan kuantifikasi transkrip oleh RNA-Seq mengungkapkan transkrip tanpa catatan dan peralihan isoform selama diferensiasi sel Nat Bioteknologi. 2010;28(5): 511-515.
35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Mengontrol tingkat penemuan palsu dalam penelitian genetika perilaku. Perilaku Otak Res. 2001; 125(1-2):279-284.
36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Pendekatan analisis kausal dalam Analisis Jalur Kecerdikan. Bioinformatika. 2014;30(4): 523-530.
37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, dkk. Enrichr: pembaruan server web analisis pengayaan kumpulan gen yang komprehensif 2016. Asam Nukleat Res. 2016;44(W1): W90-W97.
38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Pengurutan bisulfit yang ditargetkan menggunakan sistem pengayaan epi SeqCap. Metode Mol Biol. 2018;1708:383-405.
39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: pemangkas fleksibel untuk data urutan Illumina. Bioinformatika. 2014;30(15):2114-2120.
40. Langmead B, Salzberg SL. Penyelarasan baca-gapped cepat dengan Bowtie 2. Metode Nat. 2012;9(4):357–359.
41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: pelurus fleksibel dan pemanggil metilasi untuk aplikasi Bisulfite-Seq. Bioinformatika. 2011;27(11):1571-1572.
42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, dkk. methylKit: paket R komprehensif untuk analisis profil metilasi DNA genom-lebar. Biola genom. 2012;13(10): R87.
43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin meningkatkan pengkondisian ketakutan kontekstual dan memperbaiki defisit yang diinduksi etanol dalam pengkondisian ketakutan kontekstual. Perilaku Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.
44. CD Fowler, Kenny PJ. Pemberian sendiri nikotin intravena dan pemulihan yang diinduksi isyarat pada tikus: efek dosis nikotin, laju infus obat, dan pelatihan instrumental sebelumnya. Neurofarmakologi. 2011;61(4):687-698.
45. Gould TJ, Wehner JM. Peningkatan nikotin dari pengkondisian ketakutan kontekstual. Perilaku Otak Res. 1999;102(1-2):31-39.
46. Vassoler FM, SL Putih, Schmidt HD, Sadri-Vakili G, Pierce RC. Warisan epigenetik dari fenotipe resistensi kokain. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.
47. Goldberg LR, Gould TJ. Efek multigenerasi dan transgenerasi dari pajanan ayah terhadap penyalahgunaan obat pada fungsi perilaku dan saraf. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.
48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, dkk. DNMT3a dalam CA1 hipokampus sangat penting dalam perolehan pemberian sendiri morfin pada tikus Pecandu Biol. 2019;▪:▪–▪.
49. Schwartz RD, Kellar KJ. Situs pengikatan reseptor kolinergik nikotinik di otak: regulasi in vivo. Sains. 1983;220(4593):214-216.
50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Lesi hipokampus menyebabkan defisit pembelajaran pada tikus inbrida di labirin air Morris dan tugas ketakutan terkondisi. Perilaku Neurosci. 1997;111(1):104-113.
51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Hipokampus ventral dan pengkondisian ketakutan pada tikus: amnesia anterograde yang berbeda dari ketakutan setelah infus N-metil-D-aspartat atau antagonis nonkompetitifnya MK-801 ke dalam hipokampus ventral. Perilaku Otak Res. 2001;126(1–2):159-174.
52. Maren S, Holt WG. Pengkondisian ketakutan Hippocampus dan Pavlovian pada tikus: infus muscimol ke dalam ventral, tetapi tidak ke dorsal, hippocampus merusak akuisisi pembekuan bersyarat menjadi stimulus bersyarat pendengaran. Perilaku Neurosci. 2004;118(1):97-110.
53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Gangguan septum medial dan pita diagonal dari proyeksi kolinergik Broca ke hipokampus ventral mengganggu memori ketakutan pendengaran. Neurobiol Belajar Mem. 2018;152:71-79.
54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Aktivasi jalur spesifik sel hipokampus ventral yang memproyeksikan ke korteks prelimbik mengurangi pembaruan rasa takut. Neurobiol Belajar Mem. 2019;161:63-71.
55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Nukleus amigdaloid lateral: antarmuka sensorik amigdala dalam pengkondisian rasa takut. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.
56. Jones PA. Fungsi metilasi DNA: pulau, situs awal, badan gen, dan seterusnya. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.
57. Tanaka M, Li H, Zhang X, dkk. Regulasi gen yang bergantung pada wilayah dan waktu di amigdala dan korteks cingulate anterior model tikus seperti PTSD. Otak Mol. 2019;12(1):25.
58. Pengikat EB. Peran FKBP5, pendamping pendamping reseptor glukokortikoid dalam patogenesis dan terapi gangguan afektif dan kecemasan. Psikoneuroendokrinologi. 2009;34(Lampiran 1): S186-S195.
59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, dkk. Penanda genetik untuk risiko PTSD dan ketahanan di antara para penyintas serangan World Trade Center. Dis Marker. 2011;30(2-3):101-110.
60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, dkk. Biomarker epigenetik sebagai prediktor dan korelasi peningkatan gejala setelah psikoterapi pada veteran perang dengan PTSD. Psikolog Depan. 2013;4:118.
61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, dkk. Pola ekspresi gen yang terkait dengan gangguan stres pascatrauma setelah terpapar serangan World Trade Center. Biola Psikiatri. 2009;66:708-711.
62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, dkk. Pengembangan perilaku seperti kecemasan melalui pensinyalan IGF-2 hipokampus pada keturunan paparan morfin orang tua: efek lingkungan yang diperkaya. Neuropsikofarmakologi. 2014;39(12):2777-2787.
63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, dkk. beta2 Ketersediaan reseptor asetilkolin nikotinat pada gangguan stres pasca-trauma. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.
64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, dkk. Dasar neurobiologis kegagalan untuk mengingat memori kepunahan pada gangguan stres pascatrauma. Biola Psikiatri. 2009;66(12)::1075-1082.