Bagian2: Molekul Cedera Ginjal-1 Merupakan Reseptor Potensial Untuk SARS-CoV-2

Untuk informasi lebih lanjut. kontak{0}}

Manifestasi klinis virus corona

1. Masa inkubasinya lama, dan gejala utamanya adalah demam, kelelahan, sakit tenggorokan, dan batuk. Demam bisa berupa demam tinggi, demam sedang, atau demam rendah;

2. Bayi dan orang tua tidak khas dan sering disertai dengan mengi dan dispnea. Dalam kasus yang parah, kerusakan multi-sistem dapat terjadi;

3. Batuk kering pada tahap awal terutama paroksismal dan parah, mirip dengan batuk rejan, yang mempengaruhi tidur dan aktivitas; pada tahap selanjutnya, batuknya berdahak, dahaknya ganas, kadang-kadang mengandung sedikit darah, dan ada pula yang disertai dengan mengi;

4. Beberapa pasien memiliki gejala ringan dan mungkin tidak demam. Sebagian besar pasien memiliki prognosis yang baik, dan sejumlah kecil pasien sakit kritis atau bahkan meninggal;

5. Sindrom gangguan pernapasan akut, syok septik, asidosis metabolik refrakter, dan disfungsi koagulasi.

Cara mencegah virus corona baru, meningkatkan kekebalan diri adalah cara paling efektif bagi orang untuk melawan virus. Cistanche, yang telah digunakan sebagai harta yang bergizi sejak zaman kuno, dikenal sebagai "gurunginseng" dan merupakan raja untuk meningkatkan kekebalan. Cistanche - Raja Meningkatkan Kekebalan

Penelitian medis modern telah membuktikan bahwa selain fungsi memelihara dan memperkuat tubuh, Cistanche memiliki efek kuratif yang signifikan dalam mencegah tumor, anti-penuaan, anti-aritmia, menghambat apoptosis, dan meningkatkan kekebalan. kebaikan.

Itutotal glukosida dari Cistancheadalah komponen aktif dari ginseng untuk mengatur fungsi kekebalan tubuh, yang dapat meningkatkan fungsi kekebalan tidak hanya untuk orang normal tetapi juga untuk orang dengan fungsi kekebalan yang rendah.

Pengamatan klinis telah mengkonfirmasi bahwa Cistanche memiliki efek kuratif tertentu pada tumor ganas, dan memiliki efek yang jelas meningkatkan leukosit. Mengambil ginseng selama radioterapi dan kemoterapi dapat mengurangi racun dan efek samping dari radioterapi dan kemoterapi, mempercepat perbaikan jaringan yang rusak, dan mencegah leukopenia;

Diskusi

Untuk melawanCOVID{} pandemi, pemahaman yang mendalam tentang bagaimanaSARS-CoV-2menyerang sel manusia dijamin. Penelitian telah menunjukkan infeksi langsung SARS-CoV-2 diginjalselain paru-paru (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Namun, ACE2 tetap menjadi satu-satunya reseptor yang dikenal yang dapat memediasi invasi ini. Selanjutnya, tropisme ginjal SARS-CoV-2 dan terkaitcedera ginjaltampaknya tidak dapat dijelaskan oleh tingkat ACE2 yang relatif menurun setelah invasi virus (Kuba et al., 2005). Di sini, penelitian kami menunjukkan bahwa KIM1, biomarker yang diregulasi secara drastis untuk cedera ginjal (Yang et al., 2015), memediasi invasi ginjal SARS-CoV-2 sebagai reseptor.

Kami juga menemukan bahwa SARS-CoV-2-RBD mengikat KIM1 dengan afinitas yang lebih tinggi daripada SARS-CoV-RBD dan MERS-COV-RBD, yang mungkin mendasari penularan SARS-CoV yang lebih kuat-2 (Rabaan dkk, 2020); oleh karena itu, infeksi ginjal dan peran KIM1 dalam penyakit pernapasan parah ini perlu ditinjau kembali. Khususnya, hasil kami menyarankan situs pengikatan KIM1 dan ACE2 yang berbeda pada RBD virus, sehingga perlu diselidiki apakah dan bagaimana KIM1 dan ACE2 memediasi invasi SARS-CoV-2 di organ-organ ini. Selain itu, karena KIM1 diendositosis melalui jalur yang bergantung pada clathrin (Zhao et al., 2016), akan menarik untuk mengeksplorasi lebih lanjut proses yang bergantung pada KIM1-setelah perlekatan virus ke membran sel.

ACE2 adalah reseptor yang paling banyak dipelajari untuk SARS-CoV-2, namun bukan target terapi yang ideal untuk COVID-19, karena diekspresikan secara luas di banyak organ dan memainkan peran penting dalam mengatur tekanan darah dan mencegah cedera jantung/ginjal (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Sebaliknya, KIM1 memiliki hubungan yang lebih kuat dengan fungsi ginjal dan sangat diekspresikan hanya setelahcedera ginjal(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda dan Kaplan, 2018), yang menjadikannya target terapi yang lebih spesifik dan mungkin juga lebih aman untuk pasien COVID-19 dengan penyakit ginjal.

Singkatnya, data kami menunjukkan peran penting KIM1 dalam tropisme ginjal SARS-CoV-2 sebagai reseptor potensial untuk SARS-CoV-2. Di sini, kami mengusulkan model 'lingkaran setan' yang dimediasi oleh KIM1 dan ACE2 (Gambar 5G), yang dapat menjelaskan tropisme ginjal SARS-CoV-2 pada pasien COVID-19. Selama tahap awal invasi SARS-CoV-2, tingkat fisiologis yang lebih tinggi (Gambar Tambahan S1) dan afinitas pengikatan (Tabel Tambahan S1) menjadikan ACE2 sebagai target utama, yang tidak spesifik untuk ginjal. Namun, setelah timbulnya AKl yang diinduksi virus, KIM1 yang diregulasi secara drastis dengan cepat mendorong infeksi virus sekunder yang dimediasi oleh KIM1 dan ACE2, yang lebih spesifik untuk ginjal, dan akibatnya memperburuk kerusakan ginjal dalam lingkaran setan (Gambar 5G). Pendekatan yang dapat memutus interaksi antara SARS-CoV-2 dan KIM1, termasuk antibodi anti-KIM1, inhibitor molekul kecil, dan peptida antagonis turunan KIM1-, dapat menjelaskan COVID-19 perlakuan.

Bahan dan metode

Bahan:

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 persen) disintesis secara kimia oleh Genscript. Antibodi anti-lgG anti-tikus (p/n 18-8816-33) dan anti-badan anti-kelinci-lgG (p/n 18-8817-33) diperoleh dari Rockland. IgG dengan SureBeads" Protein G magnetic beads (J2112LB-02) dibeli dari Bio-Rad. DAPI (D9542) berasal dari Sigma. Alex Flour 594 berlabel phalloidin (C2205S) berasal dari Beyotimes. Antibodi terhadap KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma), dan ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) digunakan.

Akuisisi dan analisis profil ekspresi KIM1 dan ACE2

Untuk mendapatkan profil transkriptom dan protein komprehensif KIM1 dan ACE2 untuk jaringan manusia, kami mengumpulkan dan menganalisis data transkriptom dan profil protein berbasis imunohistokimia dari Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), yang menunjukkan ekspresi dan lokalisasi protein manusia di seluruh jaringan dan organ, berdasarkan deep sequencing RNA (RNA-seq) dari 37 jaringan normal dan imunohistokimia pada microarray jaringan yang mengandung 44 jenis jaringan (Uhlen et al., 2015). Jaringan RNA-seq HPA dari gen pengkode protein dicatat sebagai transkrip pengkodean protein rata-rata per juta (pTPM), sesuai dengan nilai rata-rata sampel dari setiap jaringan. Level ekspresi protein berbasis histologi dianalisis secara manual menjadi empat level (tidak terdeteksi, rendah, sedang, dan tinggi). Dalam Gambar Tambahan S1, 10 tingkat transkripsi jaringan teratas dan tingkat ekspresi protein berbasis histologi dari KIM1 dan ACE2 terdaftar, masing-masing, dan profil ekspresi yang tumpang tindih dari KIM1 dan ACE2 diringkas.

Docking molekuler dan simulasi dinamika

Docking dilakukan melalui Z-Dock (http://zdock.umassmed.edu/). Struktur kristal SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42), dan KIM1 Ig Domain V (PDB ID 5DZO) digunakan untuk mencari model pengikatan potensial. Kompleks protein dengan skor terbaik dipilih untuk simulasi dinamika molekul berikut, yang dilakukan oleh server Desmond dan dianalisis oleh Pymol2.3 dan Maestro11.8.012. Diagram simulasi dinamika 50 ns diterapkan untuk mempelajari parameter dinamis kompleks protein . Energi bebas pengikatan MM-GBSA dihitung dengan HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Penyimpangan akar rata-rata kuadrat (RMSD) dan fluktuasi akar rata-rata kuadrat (RMSF)

RMSD digunakan untuk memperkirakan perubahan rata-rata perpindahan pilihan atom untuk kerangka tertentu seperti yang dijelaskan (Li et al., 2011).RMSF dilakukan untuk mempelajari perubahan perpindahan dalam rantai protein (Li et al., 2011) .

Model tikus AKI dan qPCR

Cedera I / R dilakukan pada tikus C57BL / 6 seperti yang kami jelaskan sebelumnya (Chen et al, 2015, 2017). Untuk AKI yang diinduksi cisplatin, cisplatin 30 mg/kg berat badan disuntikkan secara intraperitoneal ke tikus jantan 8-minggu, dan tikus dikorbankan 3 hari kemudian. Sampel darah dan ginjal dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut, dengan n=4 untuk setiap kelompok hewan percobaan. Total RNA diisolasi dari ginjal oleh RNAiso Plus (TaKaRa) dan ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan sistem sintesis untai pertama M-MLV (Invitrogen). Kelimpahan transkrip gen spesifik dinilai dengan qPCR. Primer yang digunakan dalam penelitian ini disediakan (Tabel Tambahan S4).

Konstruksi

Plasmid ekspresi mamalia untuk KIM1, KIM1 Ig V (residu KIM1 aa 20-127), KIM1 lg V (KIM1 terpotong tanpa residu aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S residu aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP, dan TIM4-YFP telah dibuat. Produk amplifikasi PCR dari fragmen cDNA yang sesuai diklon ke dalam vektor berbasis promotor pRK yang mengandung tag HA atau FLAG. Plasmid terkait SARS-CoV-2-adalah hadiah baik dari Dr. PHWang di Universitas Shandong.

Kultur sel dan transfeksi

Garis sel tubulus ginjal manusia HK-2 (diperoleh dari China Center for Type Culture Collection) dikultur dalam media DMEM/F12 (Hyclone) yang mengandung 17,5 mM glukosa dan 10 persen serum janin sapi. Untuk mengevaluasi dampak SARS-CoV-2 pada sel, sel HK-2 ditransfeksi dengan plasmid SARS-CoV-2-S dan SARS-CoV-2-RBD dan kemudian dikumpulkan untuk deteksi lebih lanjut.

IP Bersama

Sel HK-2/HEK293T terindikasi (1×10) dilisiskan dalam 1 ml buffer pra-lisis (25 mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl,1 persen NP-40, 1mM EDTA, 5 persen gliserol), yang diformulasikan untuk uji pulldown dan IP dan sebagai buffer pencuci untuk manik-manik. Untuk IP, lisat sel diimmunopresipitasi dengan antibodi yang ditunjukkan atau gG masing-masing dengan manik-manik magnetik SureBeadsTM Protein G semalaman pada suhu 4C. Setelah dicuci dengan buffer pra-lisis yang mengandung 500 mM NaCl, manik-manik direbus dalam buffer pemuatan dan dikenai imunoblotting (Wan et al., 2017).

uji FRET

Interaksi intraseluler antara KIM1 dan SARS-CoV-2-RBD dideteksi dengan uji berbasis FRET standar (Karpova dan McNally,2006) menggunakan KIM1-CFP dan SARS-CoV-2-RBD-YFP . Secara singkat, plasmid ekspresi mamalia yang mengekspresikan KIM1-CFP atau KIM1 Alg V-CFP ditransfeksi bersama dengan SARS-CoV-2-RBD-YFP ke dalam-293sel T. Untuk deteksi berbasis spektrofotometer fluoresensi, sel dikumpulkan dan dilisiskan 24 jam setelah transfeksi, dan lisat dideteksi oleh F-2700 Spektrofotometer Fluoresensi (Hitachi) melalui pemindaian panjang gelombang (500-600nm) dan pemindaian waktu (435 /527 nm, eksitasi/emisi). Untuk deteksi berbasis confocal, sel dicitrakan dengan mikroskop confocal Leica TCS SP8 di bawah lensa objektif berdaya tinggi (40×) (saluran CFP: 435/485 nm, eksitasi/emisi; saluran YFP :485/527nm, eksitasi/emisi; saluran FRET:435/527 nm, eksitasi/emisi) (Li et al,2020b). Kotransfeksi CFP dan YFP tak terkonjugasi dimasukkan sebagai kontrol negatif seperti yang dijelaskan (Karpova dan McNally, 2006). Interaksi antara KIM1 dan ligan TIM4 dideteksi dengan uji FRET sebagai kontrol positif (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-KO yang dimediasi dari KIM1

Protokol berbasis CRISPR-Cas9-untuk rekayasa genom digunakan seperti yang dijelaskan (Zhang et al.,2017). Panduan urutan target RNA untuk KIM1 disediakan (Tabel Tambahan S4).

Pelabelan FITC dan mikroskop confocal

Label FITC dilakukan seperti yang kami jelaskan sebelumnya (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Secara singkat, SARS-CoV-2-RBD diinkubasi dengan FITC (rasio molar 1:5) semalaman, dan kemudian 5 mM NHCl ditambahkan untuk menghentikan reaksi dan memadamkan FITC yang tidak bereaksi. Solusinya didialisis dua kali dan diliofilisasi untuk penggunaan lebih lanjut.

Sel HEK293T (5×109)atau sel HK-2 (1×107) diinkubasi dengan FITC atau FITC-SARS-CoV-2-RBD 100ug/ml gratis selama 2. Untuk uji internalisasi berbasis peptida, AP1 atau AP2（50μM）ditambahkan bersama dengan FITC-SARS-CoV-2-RBD 100 ug/m）. Setelah difiksasi dengan formaldehida 4 persen (b/v), membran sel diwarnai dengan Alex Flour 594 berlabel phalloidin 2ug/ml）, dan inti diwarnai dengan DAPI（1ug/m）, dan kemudian dicitrakan dengan Leica TCS Mikroskop confocal SP8. Untuk setiap kelompok, setidaknya 100 sel dari lima bidang di bawah lensa objektif berdaya tinggi (64 ×) dimasukkan dalam penilaian. Gambar representatif disajikan. Kuantifikasi gambar dilakukan oleh ImageJ1.8.0.

Tes viabilitas sel

Sel dilapisi pada 3000-4000 sel per lubang di 96-piring sumur. Pada pertemuan 80 persen, sel yang diinkubasi dengan SARS-CoV-2-RBD 100 ug/ml） diobati dengan atau tanpa AP1 atau AP2（10,50,100 M）. Setelah itu, 10ul MTT 5 mg/ml ditambahkan ke masing-masing

baik selama 4 jam, media telah dihapus, dan DMSO ditambahkan. Absorbansi diukur pada 490nm dinormalisasi ke masing-masing kelompok kontrol.

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai mean±SD. Perbedaan yang signifikan dinilai dengan tes Student dua sisi. Nilai P dua sisi<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">