Bagian2: Interaksi Asam Askorbat, 5-Asam Caffeoylquinic, Dan Quercetin-3-Rutinoside Dalam Adanya Dan Tidak Adanya Besi Selama Pemrosesan Termal Dan Pengaruhnya Terhadap Aktivitas Antioksidan

Untuk informasi lebih lanjut. kontak:{0}}

Klik tautan untuk mempelajari detail bagian 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Diskusi

3.1.Hubungan Struktur-Aktivitas Asam Askorbat,5-Asam Caffeoylquinic, dan Quercetin-3-Rutinoside

Indikator pertama AOA, diukur untuk zat yang berbeda tergantung pada hubungan struktur-aktivitas, dihasilkan dari jumlah gugus fungsi. Membandingkan ketiga zat yang dianalisis, asam askorbat memiliki AOA terendah, diikuti oleh 5-asam caffeoylquinic, sedangkankuersetin-3-rutinosidamencapai AOA tertinggi. Csepregi dkk. [14] menemukan urutan yang sama ketika membandingkan AOA dari ketiga senyawa ini. Peringkat ini dapat dijelaskan dengan jumlah total gugus hidroksi: quercetin-3-rutinoside memiliki sepuluh, 5-asam caffeoylquinic memiliki lima, danasam askorbatmemiliki empat. Untukflavonoid, jumlah total gugus hidroksi dan dampaknya terhadap mekanisme AOA sebelumnya ditunjukkan oleh Burda dan Oleszek [15]. Gugus hidroksi sangat berharga dalam struktur enediol, karena dapat dengan mudah teroksidasi menjadi diketon [8]. Dalam zat yang dianalisis, struktur endiol juga penting untuk kemampuan membentuk kompleks dengan ion logam [16-18]. Struktur endiol terjadi pada molekul quercetin-3-rutinoside dan 5-caffeoylquinic acid pada cincin fenil, yang juga dapat mempengaruhi AOA yang lebih kuat dari senyawa ini. Studi lebih lanjut menemukan bahwa AOA juga dapat dipengaruhi oleh struktur molekul lain. Asam fenolik kemungkinan dipengaruhi oleh gugus asam karboksilat, misalnya asam hidroksifenil asetat (R-CH=CH-COOH) merupakan gugus penarik elektron yang lebih lemah, dibandingkan dengan asam hidroksisinamat (R-CH,-COOH) seperti sebagai asam caffeic dalam 5-asam caffeoylquinic [19]. Dalam flavonoid, aglikon memiliki AOA lebih tinggi daripada glikosida yang sesuai [20,21], dalam kasus quercetin-3-rutinoside, glikosida, AOA dari aglikonkuersetinakibatnya lebih tinggi [14]. Ada banyak gugus fungsi berbeda yang dapat mempengaruhi AOA dan, oleh karena itu, penting untuk menggunakan uji uji yang berbeda dengan mekanisme yang berbeda, seperti transfer elektron tunggal (SET), transfer atom hidrogen (HAT), dan pelepasan elektron proton berurutan. transfer (SPLET) untuk deteksi. Setiap mekanisme dan bahkan reagen uji yang digunakan dapat mendeteksi struktur senyawa bioaktif yang berbeda [22].

3.2.Pengaruh Pemrosesan Termal dan Interaksi Antioksidan Berbeda Struktur Terhadap Aktivitas Antioksidan Tanpa Mineral Besi

AOA yang stabil selama waktu 40 menit pemrosesan termal menunjukkan bahwa degradasi termal kurang penting daripada yang dihipotesiskan semula. Selanjutnya, data HPLC menunjukkan bahwa 5-asam caffeoylquinic dan quercetin-3-rutinoside murni stabil, dengan degradasi maksimum 20 persen , selama pemrosesan termal. Penelitian sebelumnya membuktikan stabilitas 5-asam caffeoylquinic hingga titik didih normal air [23], sedangkan Dawidowicz dan Typek[24] menemukan sembilan senyawa turunan, setelah memanaskan 5-asam caffeoylquinic selama 5 jam di bawah surutnya. Untuk konsentrasi asam askorbat, ditemukan penurunan setelah 40 menit pemasakan. Faktor yang mempengaruhi, mengakibatkan degradasi asam askorbat tanpa besi dalam larutan berair, bisa menjadi nilai pH, paparan cahaya, oksidasi, suhu, dan konsentrasi yang berbeda [25,26]. Dalam studi ini, faktor suhu dan konsentrasi kemungkinan besar memainkan peran utama, karena proses oksidatif dikurangi seminimal mungkin karena ruang gas minimal dalam tabung mikro. Ada kemungkinan bahwa fase gas yang tersisa masih cukup untuk degradasi dalam kondisi aerobik. Kondisi yang berbeda menghasilkan produk yang berbeda [27,28], sehingga pada penelitian ini, setelah 40 menit pemasakan dapat ditemukan produk dari kedua kondisi tersebut. Yuan dan Chen [28] melaporkan bahwa furfural, 2-asam furoat, 3-hidroksi-2-piron, dan zat yang tidak diketahui adalah produk degradasi utama asam askorbat dalam larutan berair tergantung pada nilai pH . Shinoda dkk. [29,30] ditemukan dalam jus jeruk produk degradasi furfural, 2-asam furoat, 5-hidroksimaltol, 3-hidroksi-2-piron, dan 5-(hidroksimetil ) furfural. Hsu dkk. [31] menganalisis asam askorbat dalam larutan etanol dan mendeteksi 2-asam furoat dan 3-hidroksi-2-piron. Tergantung pada kondisi aerobik atau anaerobik, turunan asam askorbat yang terdeteksi (puncak 3 dan 4) mungkin furfural, 2-asam furoat, atau 3-hidroksi-2-piron atau zat antara. Asam askorbat menurun dalam hubungan dosis-respons, dan konsentrasi asam askorbat yang lebih tinggi menunjukkan rasio degradasi yang lebih rendah selama pemasakan. Asam askorbat tampaknya menstabilkan dirinya sendiri dalam konsentrasi yang lebih tinggi, mungkin karena ikatan hidrogen dan energi van de Waals [32].

Dalam campuran biner dan terner, terutama efek tambahan pada AOA ditemukan. Dalam campuran biner, jika zat dengan AOA lebih tinggi meningkat konsentrasinya, AOA kombinasinya juga meningkat. Studi lain juga menemukan efek aditif antara ( plus )-catechin (200 um) dengan asam askorbat (50-200 mg/L)[33], dan antara campuran biner dari monoterpen yang berbeda[34]. Hanya dalam uji DPPH, efek antagonis ditemukan pada 5-asam caffeoylquinic yang dikombinasikan dengan quercetin-3-rutinoside dan dalam campuran terner dengan konsentrasi quercetin-3-rutinoside ganda. Hal ini dapat disebabkan oleh orientasi molekul dalam ruang, terutama quercetin-3-rutinoside, sebagai molekul yang cukup besar, dan aksesibilitas sterik dari molekul radikal DPPH [35]. Dalam uji TPC, kombinasi asam askorbat dan 5-asam caffeoylquinic menghasilkan efek antagonis yang kuat dalam rasio 1:2, sedangkan campuran terbalik dengan rasio 2:1 menghasilkan efek sinergis yang kuat, melebihi jumlah dari masing-masing AOA. Asam askorbat konsentrasi ganda dapat memberikan, dalam kondisi ini, dorongan tambahan untuk AOA, karena stabilisasi diri diikuti oleh stabilisasi molekul lain, ditunjukkan oleh 5-asam caffeoylquinic dalam percobaan ini. Dalam jus delima-nektarin, antara fenol alami dan asam askorbat, interaksi yang sama ditemukan, sedangkan dalam jus anggur meningkatkan efek antagonis dengan meningkatkan konsentrasi asam askorbat diamati [36]. Hasil ini menunjukkan bahwa campuran asam askorbat, 5-caffeoylquinic, dan quercetin-3-rutinoside mencapai potensi AOA tertinggi ketika yang paling kuatantioksidantersedia berlimpah.

Klik untuk mempelajari lebih lanjut tentang produk

3.3. Pengaruh Mineral Besi

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>asam askorbat. Namun, penambahan besi ke dalam campuran memiliki pengaruh pada hasil uji TEAC dan DPPH, sedangkan uji TPC tidak terpengaruh secara luas. Untuk alasan ini, penting untuk menggunakan uji uji yang berbeda dengan mekanisme kerja yang berbeda saat bekerja dengan sampel yang kaya zat besi.

Hanya dalam uji DPPH, AOA dari quercetin-3-rutinoside murni, dan dalam kombinasi dengan asam askorbat, equimolar atau non-equimolar dengan konsentrasi quercetin-3-rutinoside ganda, memiliki nilai yang lebih rendah dengan adanya besi. Bolivia dkk. [351 menjelaskan bahwa uji DPPH mendeteksi antioksidan yang lebih kecil lebih baik, karena aksesibilitas sterik dari radikal ini. Agaknya, quercetin-3-rutinoside dengan dua sisi pengikatan dapat membangun kompleks yang cukup besar dengan besi, dan dengan demikian tidak dapat diakses untuk pengujian. Seperti yang disebutkan oleh Kejic et al. [8], ini mungkin dijelaskan dengan pembentukan kompleks supramolekul melalui koordinasi ion logam. Dalam kombinasi dengan asam askorbat, yang mampu membangun kompleks valensi campuran dalam rasio 1:2 [12], diduga kompleks campuran yang lebih besar ini tidak dapat berinteraksi dengan radikal DPPH. Bertentangan dengan hasil dalam penelitian ini, penelitian lain [18,37,38] menemukan, dengan menggunakan uji DPPH, bahwa kompleks quercetin-3-rutinoside adalah antioksidan yang lebih efektif daripada quercetin-3-rutinoside murni. Diketahui bahwa kompleks khelat dari flavonoid dan ion logam dapat meniadakan aktivitas radikal dari ion logam yang terkompleks tersebut [39]. Satu-satunya perbedaan adalah bahwa dalam penelitian ini amonium besi (II) sulfat digunakan, bukan besi (ⅡI) klorida atau sulfat, digunakan dalam karya Symonowics dan Kolandek [39].

Efek sinergis antara asam askorbat dan 5-asam caffeoylquinic dengan adanya besi dalam rasio 2:1, dan efek antagonis dalam rasio 1:2, ditemukan. Kombinasi 5-asam caffeoylquinic dengan besi tidak direkomendasikan secara in vivo [6]. Namun, penelitian ini menunjukkan bahwa, secara in vitro, jumlah asam askorbat dua kali lipat dibandingkan dengan 5-asam caffeoylquinic bahkan dapat memiliki efek sinergis pada AOA. Penyelidikan lebih lanjut pada rasio dapat menunjukkan apakah efek positif juga dapat dicapai secara in vivo.

Menurut data HPLC, penambahan besi ke sampel akan memiliki efek minimal pada aktivitas katalitiknya, karena hanya konsentrasi asam askorbat dalam sampel yang dimasak selama 0 menit yang menurun. Dalam sampel asam askorbat yang dimasak, bertentangan dengan sampel tanpa besi, konsentrasi asam askorbat yang lebih tinggi menyebabkan rasio degradasi yang lebih tinggi.5-Asam caffeovlquinic dan quercetin-3-rutinoside membutuhkan faktor tambahan suhu dan waktu, serta interaksi dalam campuran, untuk aktivitas katalitik besi untuk bekerja. Quercetin-3-rutinoside, dengan adanya besi, hanya menurun dalam campuran biner dengan asam askorbat setelah pemrosesan termal. Hal ini dapat disebabkan oleh fakta bahwa flavonoid berperan sebagai antioksidan primer dan kemudian radikal senyawa yang dihasilkan bereaksi dengan asam askorbat, meregenerasi senyawa aslinya [18]. 5-Asam caffeoylquinic tampaknya istimewa, karena melindungi quercetin-3-rutinoside, sedangkan asam askorbat tidak mampu melindungi quercetin-3-rutinoside. Oleh karena itu, 5-asam caffeoylquinic mungkin menjadi molekul kunci untuk menstabilkan sistem dalam kombinasi dengan besi dan pemrosesan termal. Hipotesis 5-asam caffeoylquinic sebagai molekul penstabil dikonfirmasi lebih lanjut dalam campuran terner. Di sini, quercetin-3-rutinoside selalu distabilkan oleh 5-asam caffeoylquinic, sehingga bahkan dengan adanya asam askorbat tidak ada pengurangan konsentrasi quercetin-3-rutinoside yang diamati. Dalam studi lain, 5-asam caffeoylquinic menunjukkan sifat protektif terhadap degradasi antosianin melalui mekanisme co-pigmentasi [40]. Produk degradasi baru, dengan kemungkinan AOA yang lebih tinggi, muncul dari ketiga zat dengan adanya besi. Asam caffeic (puncak 6) diidentifikasi sebagai 5-produk pemecahan asam caffeoylquinic (data tidak ditampilkan). Hal ini menyebabkan asumsi bahwa zat lain mungkin asam quinic atau salah satu dari sembilan kemungkinan turunan yang dijelaskan oleh Dawidowicz dan Typek [24]: asam quinic;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihidroksifenil)-2-hidroksipropanoil]-1,4,5-asam karboksilat trihidroksi-sikloheksana;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihidroksifenil)-3-hidroksipropanoil]-1,4,5 asam trihidroksisikloheks-anekarboksilat; trans 3-asam O-caffeoylquinic; trans 5-asam O-caffeoylquinic; trans 4-asam O-caffeoylquinic; asam kafeat; cis-5-asam O-caffeoylquinic;4,5-asam dikaffeoilkuinat. Untuk quercetin-3-rutinoside, produk degradasi muncul di kromatogram, yang tidak dapat diidentifikasi.

3.4. Kemampuan Membentuk Kelat dengan Ferric (Fe3 plus ) dan Ferrous Iron (Fe2 plus )

Dalam semua sampel yang mengandung asam askorbat, besi besi direduksi menjadi besi besi. Dalam proses ini,asam askorbatmengambil elektron dari besi besi dan mereduksinya menjadi besi besi, dan menjadi radikal itu sendiri. Radikal yang tidak stabil berubah dengan cepat menjadi asam dehidroaskorbat dan produk degradasi lebih lanjut [12]. Karena hilangnya hidroksi peroksida, reaksi kembali ke besi besi melalui siklus Fenton tidak mungkin. Dalam 0 menit campuran biner yang dimasak, lebih dari 20 persen besi terikat dengan adanya asam askorbat. Diketahui bahwa asam askorbat membentuk kompleks dengan spesi besi dan ion logam lainnya melalui khelasi melalui inti 3-O dan 2-O mengikuti perpindahan hidrogen dari 3-OH dan 2- Gugus OH [16,17,41. Hal ini juga dapat membentuk kompleks besi-askorbat valensi campuran [42]. Namun, asam askorbat adalah agen pengkelat yang lemah dan, setelah dimasak, hanya jejak besi terikat yang terdeteksi dalam sampel murni dan campuran ketika asam askorbat hadir. Selanjutnya, karena proses pemasakan, asam askorbat terurai menjadi produk degradasi, yang tampaknya tidak dapat dikhelat dengan besi.

5-Asam caffeoylquinic adalah reduktor yang relatif buruk. Besi besi direduksi oleh 5-asam caffeoylquinic, dan dengan pemasakan yang lama, reduksi meningkat.5-Asam caffeoylquinic chelates dengan besi besi dalam ligan transfer muatan logam [17].5-Asam caffeoylquinic membawa satu sisi pengikatan yang mungkin pada struktur 3,4 endiol asam caffeic. Ini bisa menjadi indikator mengapa asam caffeic adalah bagian bioaktif dari 5-asam caffeoylquinic, sedangkan asam quinic hampir tidak memiliki AOA [43]. Endiol menghambat pembentukan OH karena pembentukan kompleks besi[41]dalam rasio satu-satu [44,45]. Lamy et al.[46]menyimpulkan bahwa 5-asam caffeoylquinic membentuk kompleks monomer, sedangkan Kiss et al. [47] ditemukan spesies oligomer. Bertentangan dengan penelitian sebelumnya [17,48], hanya jejak besi terikat yang ditemukan dengan adanya 5-asam caffeoylquinic sebelum dan sesudah pemrosesan termal. Hal ini dapat dijelaskan dengan kondisi pH netral dalam penelitian ini, sementara penelitian lain bekerja dalam media asam, berdasarkan nilai pH dari 1-2.5 di perut manusia [48]. Endapan hitam ditemukan dalam sampel yang disimpan setelah beberapa jam, yang merupakan indikator 5-kompleks besi asam-besi caffeoylicquinic. Sampel campuran baru-baru ini digunakan untuk analisis, sehingga pembentukan kompleks ini pada pH netral membutuhkan periode waktu yang lebih lama. Kompleks besi dengan asam caffeic menunjukkan sedikit aktivitas pembersihan [49]. Selanjutnya, tidak ada bukti spektrofotometri untuk reaksi antara asam quinic dan besi besi [48]. Berlawanan dengan 5-asam caffeoylquinic, dalam sampel quercetin-3-rutinoside, besi terikat ditemukan, bahkan setelah pemrosesan termal.

Quercetin-3-rutinoside mereduksi besi besi menjadi besi besi dengan peningkatan minimum dengan waktu memasak yang lama. Aktivitas pengurangan moderat dari quercetin-3-rutinoside ini sebelumnya dijelaskan oleh Mira et al. [50]. Aktivitas pereduksi besi dari quercetin-3-rutinoside terdeteksi pada 3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH [50]. Interaksi moderat dengan besi ferri dapat dijelaskan dengan jumlah gugus -OH yang lebih rendah, yang menghasilkan kerapatan muatan negatif yang lebih rendah di sisi khelasi [50]. Flavonoid dapat mengkelat dengan ion logam pada tiga sisi koordinasi potensial: (i) antara gugus 5-hidroksi dan 4-karbonil, (ii) antara gugus 3-hidroksi dan 4-karbonil, dan (ii) antara 3', gugus A'-hidroksi pada Bring [39]. Quercetin-3-rutinoside menggunakan sisi pengikatan (i) dan (i)[9], dan pada gugus 3-hidroksi, rutinoside melekat. Data spektral bahkan menunjukkan bahwa ion logam hanya terikat pada gugus 3', A'-hidroksi [18]. Chelate lebih efektif dengan besi dalam bentuk bivalen [50]. Dalam campuran biner, quercetin-3-rutinoside tidak dapat membentuk kompleks ketika asam askorbat hadir, sebaliknya dalam campuran terner. Jika 5-asam caffeoylquinic hadir, sejumlah kecil besi terikat ditemukan. Hal ini menunjukkan bahwa 5-caffeoylquinic melindungi molekul quercetin-3-rutinoside dengan adanya asam askorbat, sehingga quercetin-3-rutinoside dapat membentuk kompleks dengan besi.

4. Bahan dan Metode

4.1.Bahan kimia

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 persen), ferric amonium sulfate dodecahydrate, dan ferrous ammonium sulfate hexahydrate dibeli dari Carl Roth (Karlsruhe, Jerman).

4.2.Sampel

Larutan encer dan campuran standar otentik asam askorbat, {{0}}asam caffeoylquinic, dan quercetin-3-rutinoside disiapkan sebagai larutan murni dan campuran dengan perbandingan yang berbeda. Semua kemungkinan campuran biner dibuat dalam rasio equimolar, dan rasio non-ekuimolar dengan satu senyawa digandakan. Campuran terner juga disiapkan dalam rasio equimolar, serta rasio non-ekuimolar dengan satu atau dua senyawa digandakan, masing-masing. Konsentrasi akhir antioksidan adalah 0.3 mM untuk setiap larutan uji. Selain itu, semua percobaan diulang setelah penambahan 0.3 mM besi({{10}}.15 mM besi besi dan 0,15 mM besi besi) total per campuran. Jumlah antioksidan dan zat besi yang dipilih tidak didasarkan pada tingkat fisiologis atau makanan, mereka didasarkan pada massa molar untuk mempelajari efek interaksi molekuler. Akibatnya, rasio equimolar antara antioksidan total dan besi didirikan. Semua campuran dimasak selama 0, 10, 20, dan 40 menit dalam air mendidih, kemudian didinginkan di atas es untuk menghentikan proses pemanasan. Hal ini dilakukan untuk tiga ulangan independen.

4.3.Pengukuran Fotometri

Antioksidan(murni atau campuran) tanpa dan adanya besi diukur untuk aktivitas reduksi total dan aktivitas antioksidannya dalam tiga ulangan teknis independen menggunakan metode throughput tinggi di 96-pelat sumur (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, Instrumen BioTek, Winooski, VT, AS). Tes tes yang berbeda digunakan, karena mekanisme reaksi yang berbeda: transfer elektron tunggal (SET) dan transfer atom hidrogen (HAT). Sementara uji TEAC dan TPC didasarkan pada SET [17,18], untuk uji uji DPPH, literatur tidak cukup jelas apakah didasarkan pada SET, HAT, atau bahkan kombinasi dari kedua mekanisme ini [{{6} }]. Sebuah studi baru-baru ini oleh Foti [51] menemukan bahwa fenol dapat bereaksi dengan DPPH melalui transfer elektron kehilangan proton berurutan (SPLET), kombinasi dari dua mekanisme. Faktor-faktor, seperti polaritas medium dan potensi ionisasi, mempengaruhi mekanisme yang dominan.

4.3.1. Kandungan Fenolik Total (TPC)

Kandungan total fenol (TPC) ditentukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu dalam pelat sumur 96-, yang sebelumnya dijelaskan oleh Bobo-Garcia et al.[52] dengan beberapa modifikasi.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Nama umum tes ini menyesatkan karena reagen Folin-Ciocalteu juga bereaksi pada non-fenolik, seperti vitamin dan mineral [22]. Ini menggambarkan lebih baik "aktivitas pereduksi total" senyawa bioaktif.

4.3.2. Kapasitas Antioksidan Setara Trolox (TEAC)

Aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan uji TEAC dalam pelat 96-sumur dengan beberapa modifikasi. Larutan stok dengan 9,6 mg ABTS dan 1,66 mg kalium persulfat diisi dengan H2O hingga 25 mL disiapkan dan diinkubasi dalam gelap pada suhu kamar selama 12-16 jam. Dari larutan stok ini, larutan kerja TEAC, yang mengandung larutan stok 5mL yang diisi hingga 25 mL dengan 100 persen MeOH, disiapkan.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH * Pemulungan Radikal

Ituantioksidanactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Sinergisme dan Antagonisme

Untuk analisis efek sinergis dan antagonis dari aktivitas antioksidan, perbandingan hasil yang diperoleh secara eksperimental dengan nilai teoritis yang dihitung dengan jumlah efek masing-masing komponen pada konsentrasi yang sesuai [53]. Sinergisme menggambarkan interaksi dua zat atau lebih sehingga aksi gabungan lebih besar daripada jumlah masing-masing yang bertindak secara terpisah. Berlawanan dengan ini, antagonisme adalah fenomena di mana interaksi dua atau lebih zat dalam kombinasi memiliki efek keseluruhan yang lebih kecil daripada jumlah efek individualnya.

4.5.Penentuan Besi Ionik

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Perbedaan antara besi total dan besi ionik, jumlah besi besi dan besi besi, adalah besi terikat.

4.6.HPLC-DAD

Untuk mengukur antioksidan asam askorbat, 5-asam caffeoylquinic, dan quercetin-3-rutinoside dan produk degradasinya dalam ekstrak yang sama yang digunakan untuk fotometri

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） telah disiapkan. Senyawa yang diturunkan secara tentatif diidentifikasi dengan menganalisis standar murni di hadapan dan tidak adanya pengolahan besi pra-dan pasca-termal. Oleh karena itu, puncak baru harus diturunkan dari standar insert. Selanjutnya, campuran yang dipilih diukur melalui HPLC-MS untuk memverifikasi struktur yang diusulkan.

4.7. Analisis statistik

Microsoft Excel 2016(Microsoft, Redmond, USA) dan R Statistics (versi 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) digunakan untuk uji biostatistik dan menyajikan serta menggambar hasil data. Statistik inferensial untuk menilai dan menghubungkan perlakuan dilakukan dengan menggunakan analisis varians tiga arah (ANOVA), uji HSD Tukey post hoc, dan korelasi Pearson. Paket R yang digunakan adalah ggplot2 [55], mean [56], dan multcomp [57].

5. Kesimpulan

Berdasarkan temuan di atas, AOA asam askorbat, 5-asam caffeoylquinic, dan quercetin-3-rutinoside dipengaruhi oleh struktur molekul, konsentrasi, rasio, dan interaksinya dengan antioksidan dan besi lain. Interaksi terutama tampaknya berperan dalam AOA ketika menggabungkan asam askorbat dan asam 5-caffeoylquinic. Di sini, efek sinergis dan antagonis terdeteksi. Suhu memiliki pengaruh minimal pada AOA, sementara pada saat yang sama suhu mempengaruhi stabilitas semua antioksidan dalam campuran tertentu, terutama dengan adanya besi. Hanya konsentrasi asam askorbat yang menurun tanpa adanya besi dengan waktu pemasakan yang lama dan konsentrasi asam 5-caffeoylquinic menurun hanya dengan adanya besi, sedangkan konsentrasi quercetin-3-rutinoside menurun hanya dalam kombinasi dengan asam askorbat dalam keberadaan besi. Dalam kombinasi dengan besi, asam 5-caffeoylquinic mampu melindungi molekul lain dari pengurangan konsentrasinya oleh pemrosesan termal.

Pada tumbuhan, kombinasi asam askorbat, 5-asam caffeoylquinic, dan quercetin-3-rutinoside tidak hanya mungkin tetapi juga umum. Oleh karena itu, hasil ini memberikan pengetahuan dasar tentang proses yang terjadi selama memasak sayuran. Matriks makanan lebih kompleks dan mengandung senyawa bioaktif yang tak terhitung jumlahnya, termasuk enzim, mineral lain, atau asam, yang mengubah kondisi reaksi atau reaktan itu sendiri. Interaksi kompleks tersebut jauh di luar cakupan penelitian ini dan konsentrasi serta interaksi yang menguntungkan dariantioksidandalam sayuran yang dimasak harus ditangani di masa depan.

Referensi

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Pengaruh Kakao pada Diabetes: Potensi Pankreas dan Hati sebagai Organ Sasaran Utama, Lebih dari Efek Antioksidan? Int. J. Ilmu Pangan. teknologi. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenol, Polifenol dan Tanin: Sebuah Tinjauan. Metabolit Sekunder Dalam Tumbuhan: Kejadian, Struktur, dan Peran dalam Makanan Manusia; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Penerbitan Blackwell: Hoboken, NJ, AS, 2006; hal 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Logam Transisi sebagai Katalis Reaksi "Autoksidasi". Radikal Bebas. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krubein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Pengaruh Pengolahan Termal pada Flavonols Rutin dan Quercetin. Komunitas Cepat. Spektrom Massa. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; Garcia-Casal, MN; Solano, L.; Baron, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramirez, J.; Leet, saya.; Tropper, E. Bioavailabilitas Besi pada Manusia dari Sarapan Diperkaya dengan Besi Bis-Glycine Chelate, Phytates dan Polyphenols. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Penghambatan Penyerapan Besi Non-Haem pada Manusia oleh Minuman yang Mengandung Polifenol. sdr. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, Efek Antiradikal dan Kelat AI dalam Perlindungan Flavonoid terhadap Cedera Sel yang Diinduksi Silika. Lengkungan. Biokimia. Biofis. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejik, Z.; Kaplanek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipensk, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Skora, D.; Martásek, P.; dkk. Kompleks Besi Flavonoid-Antioksidan Kapasitas dan Beyond. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Analisis Hubungan Struktur-Aktivitas Polifenol Monomer dan Polimer (Quercetin, Rutin dan Catechin) yang Diperoleh dengan Berbagai Metode Polimerisasi. Kimia keanekaragaman hayati. 2019, 16, e190426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullon, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Tinjauan tentang Metode Ekstraksi, Identifikasi dan Pemurnian, Aktivitas dan Pendekatan Biologis untuk Meningkatkan Bioavailabilitasnya. Tren Makanan Sci. teknologi. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]