BAGIAN : Peran SIK1 dalam Transisi Cedera Ginjal Akut Menjadi Penyakit Ginjal Kronis
Mar 25, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 & dkk.
Latar belakang
Cedera ginjal akut(AKI), penyakit umum yang ditandai dengan penurunan laju filtrasi glomerulus (GFR) dan peningkatan kreatinin serum [1], dianggap sebagai faktor risiko untuk pengembangan dan perkembangan CKD [2,3]. Baru-baru ini, AKI-CKD (Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis) transisi telah menjadi salah satu hotspot dalam studi penyakit ginjal. Meskipun dilaporkan bahwa peradangan, EMT, dan fibrosis memainkan peran penting dalam kemajuan AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi [4,5], mekanisme molekuler yang tepat dari AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi masih belum jelas.
cistanche mengobati penyakit ginjal dan mencegah gagal ginjal
Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1(SIK1) adalah anggota dari keluarga AMP-activated protein kinases (AMPKs), yang memainkan peran penting dalam mengatur metabolisme, kelangsungan hidup sel, dan pertumbuhan [6, 7]. Studi telah menunjukkan bahwa penghambatan SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mempromosikan EMT, menyebabkan migrasi dan metastasis tumor[8-10]. Selain itu, dilaporkan bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)secara negatif mengatur aktivasi NF-kB yang diinduksi oleh TLR4- dan ekspresi sitokin proinflamasi yang dilemahkan [11]. Selain itu, bukti yang muncul menunjukkan hubungan antara SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dan penyakit ginjal [6,12]. Misalnya, upregulasi SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)membalikkan proliferasi sel mesangial yang diinduksi glukosa tinggi, dan akumulasi matriks ekstraseluler (ECM) dengan menghambat ekspresi FN dan PAI-1, keduanya terlibat dalam gangguan fibrotik, seperti glomerulosklerosis [6,13]. Jadi, kami berspekulasi bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mungkin terlibat dalam perkembangan AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi, yang ditandai dengan EMT, peradangan, dan fibrosis ginjal.
Jalur WNT/-catenin adalah jalur sinyal yang kompleks dan sangat terkonservasi yang mengatur berbagai proses biologis, seperti perkembangan organ, homeostasis jaringan, dan karsinogenesis [14, 15]. Meskipun diam pada ginjal orang dewasa normal, ditemukan untuk diaktifkan kembali dalam berbagai penyakit ginjal, termasuk cedera ginjal akut, nefropati diabetik, fibrosis interstisial, dan penyakit ginjal kistik [16]. Selain itu, dilaporkan bahwa pembungkaman jalur WNT/ -catenin memperbaiki fibrosis ginjal, menunda perkembangan AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)pada cedera yang diinduksi I/R [17]. Tapi apakah SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dapat berpartisipasi dalam AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi dengan memodulasi jalur WNT/-catenin masih harus diklarifikasi lebih lanjut.
Bukti yang muncul menunjukkan bahwa Snail and Twistl, faktor transkripsi EMT, memainkan peran penting dalam patogenesis fibrosis ginjal[18-20]. Dilaporkan bahwa penghapusan bersyarat Twistl atau Snail dalam sel epitel tubulus proksimal menghambat EMT, melemahkan fibrosis interstisial pada fibrosis ginjal yang diinduksi secara eksperimental pada tikus [21]. Mengingat Snail dan Twist1 adalah molekul signifikan yang terletak di hilir jalur WNT/ -catenin, kami berspekulasi bahwa mereka mungkin juga memainkan peran penting dalam SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dimediasi AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi.
Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menjelaskan peran dan mekanisme SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1) di AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi, yang akan memberikan target terapi baru untuk pencegahan klinis dan pengobatan fibrosis ginjal dan akan memberikan cara baru untuk menunda kemajuan AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi.
cistanche mengobati penyakit ginjal
Bahan dan metode
Pasien dan sampel jaringan
Penelitian ini disetujui oleh Komite Etika Penelitian Klinis Rumah Sakit Provinsi Shandong yang berafiliasi dengan Universitas Shandong. Sampel ginjal manusia dikumpulkan dari pasien dengan AKI (Cedera ginjal akut) didiagnosis berdasarkan biopsi ginjal, dan sampel ginjal pada kelompok kontrol diperoleh dari jaringan parakanker pasien dengan tumor ginjal yang menjalani reseksi bedah. Sampel jaringan diawetkan dalam nitrogen cair dan persetujuan ditandatangani oleh semua pasien sesuai dengan Deklarasi Helsinki.
Konstruksi AAV{}Sik1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)
Virus terkait adeno rekombinan (AAV9-Sik1) dan kontrol negatif virus terkait adeno (AAV9-NC) dibuat oleh GENECHEM (Shanghai, Cina). AAV rekombinan9-Vektor virus terkait adeno Sik1 GV467 mencakup promotor, wilayah pengkode antibodi, wilayah pengkode protein fluoresen hijau EGFP, dan wilayah pengkode protein tag 3FLAG. Kemampuan vektor AAV9 untuk mentransduksi ginjal telah diverifikasi (File tambahan 1).
Hewan dan metode pemodelan
Pemodelan dan program eksperimental tindak lanjut telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Shandong. Tikus C57BL/6 berusia 4-6 minggu dan berat 15-20 g dipasok oleh Pusat Hewan Eksperimental Universitas Shandong dan secara acak dialokasikan ke dalam 4 kelompok: kelompok kontrol (Kontrol), tikus normal yang diobati dengan kelompok AA ( AA), tikus AA yang diberi perlakuan dengan AAV9-kelompok Sik1(AAV9-Sik1 plus AA), tikus AA yang diberi kelompok AAV9-NC (AAV9-NC plus AA) . Mencit kelompok AA disuntik AA (10 mg/kg) secara intraperitoneal, sedangkan mencit kelompok kontrol disuntik PBS. Pada tanggal 3, 7, 14, dan 28 setelah injeksi AA, urin tikus 24 jam dikumpulkan dalam kandang metabolik dan supernatannya disimpan pada suhu -20 derajat C setelah sentrifugasi. Darah disentrifugasi pada 3000r selama 10 menit, dan supernatan disimpan pada -20 derajat .24 jam protein urin, kreatinin serum (Scr), dan nitrogen urea darah (BUN) diukur dengan penganalisis biokimia otomatis. Serum IL-1 dan TNF- dideteksi dengan ELSA. Kemudian mencit dikorbankan dan ditimbang. Setelah itu ginjal dipotong dan ditimbang. Semua sampel ginjal dibagi menjadi dua bagian, salah satunya difiksasi dalam paraformaldehida 4 persen untuk pewarnaan histologis, sementara yang lain disimpan di bawah derajat -80 untuk PCR real-time dan deteksi Western blot.
Histologi dan imunohistokimia
Setelah difiksasi dalam 4 persen paraformaldehyde, sampel ginjal didehidrasi, transparan, tertanam dalam parafin, dan dipotong menjadi irisan setebal 4 m. Selanjutnya, slide di-dewax, dihidrasi, dan diwarnai. Untuk analisis histologis ginjal, pewarnaan HE, pewarnaan PAS, dan pewarnaan trikrom Masson digunakan sesuai dengan instruksi pabrik. Untuk analisis imunohistokimia, bagian diinkubasi dengan antibodi primer terhadap SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)(51045-1-AP, Proteintech, USA), E-cadherin (20874-1-AP, Proteintech, USA), -SMA (ab32575, Abcam, USA), COL1(bs-10423R, Bioss , Beijing, Cina) pada 4 derajat semalam. Setelah inkubasi dengan antibodi sekunder, DAB ditambahkan, diikuti dengan pewarnaan nuklir dengan hematoxylin. Akhirnya, gambar diamati di bawah mikroskop (Leica, Jerman). Persentase pewarnaan positif untuk SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1), E-cadherin, -SMA, dan COLL diukur dengan menggunakan perangkat lunak Image-Pro plus 6.0 kuantitatif (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Kultur dan pengobatan sel
Sel epitel tubulus proksimal manusia (HK2) dikultur dalam media DMEM (Gibco, USA) yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi (FBS) (Gibco, AS) dan 1 persen penisilin-streptomisin (Sigma, AS) pada suhu 37 derajat C dalam a atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5 persen CO,. Asam Aristolochic(AA)(Sigma, USA) dilarutkan dalam DMSO menjadi 1 mg/mL dan sel diperlakukan dengan konsentrasi akhir pada 10 mol/L, 20 mol/L, 40 mol/L, dan 60 mol/L, dan kelompok kontrol diperlakukan dengan jumlah DMSO yang sama.
Transduksi vektor lentiviral dan transfeksi siRNA shRNA lentiviral membangun target SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1), -catenin dan shRNA yang diacak, serta vektor ekspresi berlebih lentiviral untuk SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dan vektor kontrol kosong dibangun oleh Cyagen (Guangzhou, Cina). Urutan target terdaftar sebagai berikut: SIKI shRNA:5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC-3';
manfaat cistanche gurun: mengobati penyakit ginjal kronis
Hasil
SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)diatur ke bawah di AKI(Cedera ginjal akut)
Mengingat bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)memainkan peran penting dalam cedera ginjal, pertama-tama kami mendeteksi ekspresi SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)di jaringan ginjal AKI(Cedera ginjal akut)pasien dan AKI(Cedera ginjal akut)tikus. Pewarnaan imunohistokimia mengungkapkan bahwa, tidak hanya pada pasien tetapi pada tikus, SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)ekspresi tubulus ginjal dalam kontrol lebih tinggi daripada di AKI(Cedera ginjal akut)kelompok, yang menunjukkan bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)diatur ke bawah selama AKI(Cedera ginjal akut)(Gbr.la,b). Selain itu, kami melakukan pewarnaan trikrom HE dan Masson untuk menganalisis perubahan histopatologis pada sampel ginjal AKI.(Cedera ginjal akut)pasien (Gbr. 1c). Dibandingkan dengan kontrol, pembengkakan sel epitel tubulus ginjal, degenerasi vakuolar, dan edema interstisial diamati pada kelompok AKI dengan pewarnaan HE. Selain itu, dibandingkan dengan kontrol, terutama sel-sel tubulus yang rata, batas sikat yang terlepas, dan linen tubulus yang membesar diamati pada kelompok AKI dengan pewarnaan trikrom Masson. Secara keseluruhan, semua temuan ini menunjukkan bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mungkin memainkan peran dalam cedera tubular.
Gbr.1 SIK1 diatur ke bawah di AKI(Cedera ginjal akut).a Gambar pewarnaan imunohistokimia representatif dari SIK1 di Kontrol dan AKI(Cedera ginjal akut)pasien. Bilah skala=50 m. Grafik menunjukkan analisis kuantitatif SIK1 pada bagian yang diwarnai secara imunohistokimia.b Gambar pewarnaan imunohistokimia representatif dari SIK1 pada Kontrol dan AKI(Cedera ginjal akut)tikus. Bilah skala=50 m. Grafik menunjukkan analisis kuantitatif SIK1 pada bagian yang diwarnai secara imunohistokimia. c Gambar representatif dari pewarnaan trichrome HE dan Masson di jaringan ginjal AKI(Cedera ginjal akut)pasien. Bilah skala=10 m. Data ditampilkan sebagai mean±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)diatur ke bawah dalam AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)tikus transisi
Untuk mendapatkan model tikus AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi, kami menyuntikkan AA secara intraperitoneal ke tikus. Dibandingkan dengan kontrol, tikus yang diobati dengan AA menunjukkan peningkatan produksi faktor inflamasi, EMT, dan fibrosis ginjal (Gbr. 2a-d). Selain itu, indeks ginjal, Scr serum, BUN, dan protein urin 24 jam ditingkatkan pada pengobatan AA (Gbr. 2e). Selanjutnya, AA merusak struktur ginjal, menyebabkan atrofi sel epitel tubulus ginjal, pembesaran kapur, dan tingkat yang berbeda dari deposisi serat kolagen di tubulointerstitium (Gbr.2f). Semua di atas menunjukkan bahwa AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)model transisi berhasil dibuat. Untuk mengeksplorasi peran SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)pada AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis) transisi, kami menilai ekspresinya dalam sampel ginjal tikus yang disuntik dengan AA. Kami menemukan SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dan p-SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)(Thr182) diturunkan secara tergantung waktu setelah injeksi AA (Gbr.2g), yang menunjukkan peran potensial untuk SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dalam mengatur AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi.
Gbr.2 SIK1 diatur ke bawah dalam AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)tikus transisi.analisis ELISA dari IL-1 , dan ekspresi TNF- pada kelompok tikus yang berbeda. b Western blot dan analisis PCR real-time dari ekspresi inflamasi dan penanda fibrosis (Caspase1/p20/p10, FN dan COL1); c Western blot dan analisis PCR real-time dari ekspresi penanda EMT (E-cadherin, Vimentin, dan -SMA). d Gambar pewarnaan imunohistokimia representatif dari E-cadherin pada kelompok tikus yang berbeda. Bilah skala=50 m. Grafik menunjukkan analisis kuantitatif E-cadherin pada bagian yang diwarnai secara imunohistokimia. e Indeks ginjal, Scr, BUN, dan kadar protein urin 24 jam pada kelompok tikus yang berbeda. f Pewarnaan histologis representatif (HE, PAS, dan pewarnaan trichrome Masson) gambar jaringan ginjal pada kelompok tikus yang berbeda. Bilah skala=50 m. g Analisis Western blot kadar protein SIK1 dan p-SIK (Thr182) pada tikus C57BL/6. Data ditampilkan sebagai mean±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Ekspresi berlebihan dari SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)meringankan AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi
Untuk menentukan fungsi SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)pada AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi, kami menyuntikkan AAV9-SikI ke dalam vena ekor tikus untuk mengekspresikan SIK1 secara berlebihan(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1). Kami menemukan setelah disuntik dengan AAV9-Sik1, disfungsi ginjal yang diinduksi AA secara signifikan diperbaiki, sebagaimana dibuktikan oleh penurunan kadar indeks ginjal, Scr, BUN, dan protein urin 24 jam (Gbr.3a). PCR waktu nyata mengungkapkan bahwa AAV9-Sik1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)meredakan respon inflamasi yang diinduksi AA (Gbr. 3b). Selain itu, AAV9-Sik1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)secara signifikan meningkatkan kerusakan histopatologi yang disebabkan oleh AA (Gbr.3c). Selanjutnya, hasil pewarnaan imunohistokimia menunjukkan bahwa AAV9-Sik1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mengurangi fibrosis interstisial dan EMT dalam proses AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi (Gbr.3d). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)memainkan peran protektif dalam AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi.
manfaat kesehatan cistanche: meningkatkan fungsi ginjal
SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)diregulasi ke bawah dalam sel HK2 yang diobati dengan AA Sejumlah besar penelitian telah menunjukkan bahwa tubulus proksimal ginjal adalah salah satu target utama cedera pada AKI(Cedera ginjal akut), dan cedera tubulus proksimal mungkin memainkan peran patofisiologis penting dalam perkembangan AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi. Untuk menilai lebih lanjut apakah SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)diatur secara in vitro, kami fokus pada sel HK2 dalam penelitian ini. Dengan melakukan uji CCK8, kami memilih 10 mol/L AA sebagai konsentrasi optimal untuk eksperimen selanjutnya (File tambahan 2). Secara konsisten, pengobatan AA menunjukkan peningkatan peradangan, EMT, dan fibrosis pada sel HK2 (Gbr.4a-c), menunjukkan cedera sel HK2 yang diinduksi AA secara in vitro. Selanjutnya, kami memeriksa kadar protein SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dan mengamati penurunan SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dan p-SIK1(Thr182) dalam sel HK2 dengan adanya AA (Gbr. 4d). Selanjutnya, kami mendeteksi lokasi SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)protein dalam sel HK2 sebelum dan sesudah terpapar AA dengan pewarnaan Immunofluorescence. Dalam sel yang tidak distimulasi, SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)diamati baik di nukleus maupun sitoplasma. Ketika diobati dengan AA, ekspresi SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)berkurang dan SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)secara bertahap terdeteksi dalam nukleus (File tambahan 3). Secara kolektif, hasil ini menjelaskan bahwa SIK1 terlibat dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA.
Gambar 3 Overekspresi SIK1 mengurangi AKI-CKD . yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi.sebuah. Indeks ginjal, Scr, BUN, dan kadar protein urin 24 jam pada kelompok tikus yang berbeda. b Analisis PCR waktu-nyata dari tingkat mRNA Caspase 1, dan IL-1 pada kelompok tikus yang berbeda. c Pewarnaan trikrom HE, PAS, dan Masson digunakan untuk menilai perubahan histologis dan tingkat fibrosis tubulointerstitial. Bilah skala=50 m. d Gambar pewarnaan imunohistokimia representatif dari protein E-cadherin, -SMA, dan COLI pada kelompok tikus yang berbeda. Bilah skala=50 m. Grafik menunjukkan analisis kuantitatif E-cadherin, -SMA, dan COL1 pada bagian yang diwarnai secara imunohistokimia. Data ditampilkan sebagai mean ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
ekstrak cistanche: meningkatkan fungsi ginjal
Ekspresi berlebihan dari SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)meningkatkan cedera sel HK2 yang diinduksi AA
Untuk lebih memperjelas peran SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA, kami membangun garis sel yang secara stabil mengatur SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)oleh infeksi lentivirus sel HK2 (File tambahan 4). Ekspresi berlebih dari SIK1 menyebabkan peningkatan E-cadherin secara signifikan dan menekan Caspasel/p20/p10, Vimentin, COLI, dan Fspl bila dibandingkan dengan sel kontrol yang distimulasi dengan AA saja (Gbr. 4e, f). Selain itu, ekspresi berlebihan SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)menghambat kemampuan migrasi sel HK2 yang diinduksi oleh AA (Gbr.4g). Bersama-sama, temuan ini menunjukkan bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)protektif terhadap cedera yang diinduksi AA dalam sel HK2.
Gbr.4 SIK1 diatur ke bawah dalam sel HK2 yang diobati dengan AA dan ekspresi berlebih dari SIK1 meningkatkan cedera sel HK2 yang diinduksi AA.sebuah. Deteksi ELISA kadar IL{{0}} dan TNF- dalam supernatan sel HK2 yang diberi 10 mol/L AA selama 0 jam, 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. b Analisis Western blot kadar protein Caspase 1/p20/p10, E-cadherin, ZO-1, Vimentin, dan -SMA dalam sel HK2 yang diobati dengan 10 mol/L AA selama 0 jam, 24 jam, 48 jam, dan 72 jam, dengan efek terbesar setelah 72 jam pengobatan. -aktin digunakan sebagai kontrol. c Analisis PCR real-time dari indikator fibrosis awal (COLI, PAI-1, dan MMP9) tingkat mRNA dalam sel HK2 yang diobati dengan 10 mol/L AA selama 72 jam. d Analisis Western blot kadar p-SIK1(Thr182) dan SIK1 dalam sel HK2 yang diobati dengan 10 mol/L AA selama 0 jam, 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. e Analisis Western blot dari Caspase1/p20/p10, E-cadherin, Vimentin, Fsp1, dan COL1 dalam sel HK2 yang diperlakukan dengan vektor SIK1 (vektor ekspresi berlebih lentiviral SIK1) dengan adanya 10 mol/L AA atau diobati dengan 10 mol /L AA saja selama 72 jam. f Gambar imunofluoresensi representatif dari E-cadherin dan Vimentin dalam sel HK2. Bilah skala=50 m. g Perwakilan hasil migrasi sel HK2. Bilah skala=50 m. Data ditampilkan sebagai mean±sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
ekstrak cistanche deserticola: mengobati penyakit ginjal
SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mengatur jalur pensinyalan WNT/ -catenin in vivo dan in vitro
Mempertimbangkan peran penting jalur WNT/ -catenin dalam AKI-CKD(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)transisi, kami mengeksplorasi apakah SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mengatur jalur WNT/-catenin. Eksperimen in vivo, kami mengamati bahwa ekspresi berlebih SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)menghambat kadar protein WNT1, p- -catenin (Y654), dan nuklir -catenin pada AKI-CKD yang diinduksi AA(Cedera ginjal akut menjadi penyakit ginjal kronis)tikus (Gbr.5a). Untuk mengeksplorasi lebih lanjut apakah SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mengatur jalur WNT/ -catenin in vitro, kami membungkam ekspresi SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)oleh shRNA dalam sel HK2 (File tambahan 5). Konsisten dengan hasil in vivo, pembungkaman SIK1 menghasilkan peningkatan level -catenin, TCF4, dan LEF1 mRNA (Gbr.5b). Selain itu, knockdown SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)meningkatkan kadar protein -catenin dan p- -catenin(Y654)(Gbr. 5c). Selain itu, knockdown SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mempromosikan translokasi nuklir -catenin (Gbr.5d). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)mengatur jalur WNT/ -catenin in vivo dan in vitro.
Gbr.5 SIK1 mengatur jalur WNT/-catenin in vivo dan in vitro.sebuah. Analisis western blot dari SIK1, WNT1, p- -catenin (Y654), dan tingkat protein nuklir -catenin pada kelompok tikus yang berbeda. b Analisis PCR waktu-nyata dari -catenin, TCF4 danLEF1 dalam sel HK2 yang diobati dengan SIK1 shRNA atau Scramble shRNA. c Analisis Western blot -catenin, dan p- -catenin(Y654) dalam sel HK2 yang diobati dengan SIK1 shRNA atau Scramble shRNA.d Gambar imunofluoresensi representatif dari -catenin dalam sel HK2. Bilah skala=50 um. Data ditampilkan asmean±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Jalur pensinyalan WNT/ -catenin terlibat dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA
Untuk mengeksplorasi apakah jalur WNT/ -catenin berperan dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA, kami menguji tingkat ekspresi WNT1, nuklir -catenin, dan p- -catenin(Y654) setelah pengobatan AA. Hasil Western blot menunjukkan bahwa WNT1, nuklir -catenin, dan p- -catenin(Y654) meningkat secara signifikan setelah stimulasi AA (File tambahan 6a). Selain itu, pewarnaan imunofluoresensi mengungkapkan translokasi nuklir -catenin (File tambahan 6b), yang menunjukkan bahwa stimulasi AA dapat mengaktifkan jalur pensinyalan WNT/ -catenin. Mengingat -catenin adalah komponen utama dari jalur WNT/ -catenin, kami bertanya-tanya apakah regulasi -catenin mengatur cedera sel HK2 yang diinduksi AA. Dengan demikian, kami secara stabil merobohkan -catenin oleh shRNA lentivirus dalam sel HK2 (File tambahan 6c). Dan kami mengamati bahwa -catenin knockdown merusak ekspresi Caspasel, IL-1 yang diinduksi AA, Vimentin, PAI-1, dan MMP9 dan mempromosikan ekspresi E-cadherin (Gbr.6a, b). Selain itu, sel shRNA -catenin yang distimulasi dengan AA menunjukkan penurunan migrasi yang signifikan dibandingkan dengan sel kontrol -catenin yang distimulasi dengan AA saja (Gbr.6c). Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa jalur WNT/-catenin terlibat dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA.
Gbr.6 Jalur pensinyalan WNT/B-catenin terlibat dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA.Sel-sel HK2 diperlakukan dengan B-catenin shRNA atau Scramble shRNA dengan adanya 10 umol/LAA.analisis PCR real-time dari Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1.and Level mRNA MMP9 dalam sel HK2. b Gambar imunofluoresensi representatif dari E-cadherin dan Vimentin dalam sel HK2. Bilah skala=50 um.c Mewakili hasil migrasi sel HK2. Bilah skala=50 um. Data ditampilkan sebagai mean±sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Jalur pensinyalan WNT/ -catenin diperlukan untuk SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)cedera sel HK2 yang dimediasi yang disebabkan oleh AA
Untuk mempelajari apakah SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)cedera sel HK2 yang diinduksi AA yang diregulasi melalui jalur pensinyalan WNT/ -catenin, -catenin semakin menurun di SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)merobohkan sel HK2. Dibandingkan dengan sel knockdown SIK1, knockdown lebih lanjut dari -catenin menurunkan tingkat mRNA Caspasel, COLL, dan Vimentin, sementara meningkatkan tingkat mRNA E-cadherin (Gbr. 7a). Hasil West-ern blot konsisten dengan PCR real-time, menunjukkan pembungkaman -catenin dan SIK1 membalikkan downregulasi E-cadherin, upregulation Caspasel/p20/p10 dan Vimentin yang diinduksi oleh SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)knockdown (Gbr. 7b).
Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa penghambatan -catenin membalikkan respons inflamasi, EMT, dan perkembangan fibrosis yang dimediasi oleh SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)knockdown, yang dengan kuat mengungkapkan bahwa jalur WNT/ -catenin diperlukan untuk SIK1(Kinase yang Dapat Diinduksi Garam 1)cedera sel HK2 yang dimediasi yang disebabkan oleh AA.
Gbr.7 Jalur WNT/-catenin diperlukan untuk cedera sel HK2 yang dimediasi SIK1 yang diinduksi oleh AA.Sel HK-2 ditransfeksi bersama dengan SIK1 dan B-catenin shRNA atau ditransfeksi dengan SIK1 atau -catenin shRNA saja, dan kemudian diobati dengan 10 umol/L AA selama 72 ha analisis PCR real-time Caspase1, COL1. E-cadherin, dan ekspresi Vimentin. b. Analisis Western blot ekspresi Caspase1/p20/p10, E-cadherin, dan Vimentin. Data ditampilkan sebagai mean±sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Peran Twist1 dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA
Bertindak sebagai EMT-TF, Twistl dapat mempromosikan EMT dan fibrosis ginjal. Dalam penelitian ini, kami menemukan AA mempromosikan ekspresi protein dan mRNA Snail dan Twist1 sementara knockdown -catenin menghambat ekspresi Snail dan Twist1 yang diinduksi oleh AA(Gbr.8a), menunjukkan Snail dan Twist1 terletak di hilir -catenin dan dimainkan peran dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA. Untuk memverifikasi hipotesis kami, kami merobohkan Twist1 oleh siRNA (File tambahan 7) dan melakukan analisis PCR dan Western blot waktu-nyata. Seperti yang diharapkan, bila dibandingkan dengan sel kontrol yang distimulasi dengan AA saja, ekspresi Vimentin, dan COLI berkurang sementara ZO-1 meningkat dalam sel siRNA Twist1 dengan adanya AA, menunjukkan keheningan Twist1 mengurangi terjadinya EMT dan perkembangan fibrosis ginjal yang diinduksi oleh AA (Gbr. 8b dan c).
Gbr.8 Peran Twist dalam cedera sel HK2 yang diinduksi AA.a Western blot dan analisis PCR real-time tingkat Snail dan Twist1 dalam sel HK2. b Analisis PCR waktu-nyata dari tingkat Twist1, COL1, ZO-1, dan Vimentin dalam sel HK2 yang diobati dengan Twist1 siRNA atau NC siRNA.c. Analisis Western blot tingkat Twist1, ZO-1, dan vimentin dalam sel HK2 yang diobati dengan Twist1 siRNA atau NC siRNA. Data ditampilkan sebagai mean±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
