Bagian Satu|Inhibitor NF-κB Dan Agonis AMPK: Prediksi Jaringan Dan Integrasi Multi-Omic Untuk Mendapatkan Jalur Pensinyalan Untuk Acteoside Melawan Penyakit Alzheimer

Bagian Satu|Acteosides: bagaimana cara mengobati penyakit Alzheimer sebagai salah satu bahan efektif Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* dan Fei Li1,2 * 1 Kunci Negara Laboratorium Obat Alami, Universitas Farmasi China, Nanjing, China, 2 College of Pharmacy, Universitas Kedokteran Xinjiang, Urumqi, China

Penyakit Alzheimer (AD) adalah jenis demensia yang paling sering.Akteosida (BERTINDAK) adalah senyawa yang diisolasi dariCistanche tubulosa, yang memiliki sifat neuroprotektif yang sangat baik. Namun, mekanisme yang mendasariBERTINDAKdalam mengatur polarisasi mikroglia tetap tidak jelas. Oleh karena itu, model jaringan komputasi dibuat untuk mengidentifikasi target penggerak dariBERTINDAKdan memprediksi mekanismenya dengan mengintegrasikan beberapa database yang tersedia. Model AD yang diinduksi AlCl3-dalam larva ikan zebra berhasil dibuat untuk menunjukkan kemanjuran terapeutik ACT. Selanjutnya, sel BV-2 yang diinduksi LPS mengungkap peran positif ACT dalam polarisasi M1/M2. Jalur NF-κB dan AMPK selanjutnya dikonfirmasi oleh analisis transkriptomik, analisis metabolomik, teknik biologi molekuler, dan docking molekuler. Penelitian ini memberikan mekanisme infus ACT dan mengungkapkan hubungan antara metabolisme dan polarisasi mikroglia dari perspektif fungsi mitokondria. Lebih penting lagi, ini memberikan pendekatan sistematis dan komprehensif untuk penemuan target obat, termasuk perubahan gen, metabolit, dan protein.

Kata kunci: akteosida, sel BV-2, metabolisme, RNA-seq, mitokondria, peradangan saraf

Untuk informasi lebih lanjut, silakan hubungi: ali.ma@wecistanche.com

Klik untuk Cistanche DHT untuk memori

PENGANTAR

Dengan bertambahnya usia dan pertumbuhan penduduk yang cepat, jumlah kasus demensia di dunia menunjukkan tren yang meningkat.penyakit alzheimer(AD) merupakan penyakit neurodegeneratif yang umum disertai dengan gangguan kognitif dan diskinesia (Perea et al., 2020), yang merupakan jenis demensia yang paling sering terjadi. Hal ini ditandai dengan hilangnya saraf yang parah, plak pikun, dan kusut neurofibrillary (Shiao et al., 2017). Patogenesis daripenyakit alzheimermultidimensi dan terkait dengan peradangan saraf. Peradangan saraf didorong oleh aktivasi sel glial, yang terkait erat dengan terjadinya dan perkembangan DA (Hanslik dan Ulland, 2020; Linnerbauer dan Rothhammer, 2020). Selama perkembangan dan eksaserbasi peradangan saraf, mikroglia dianggap sebagai faktor kunci. Mikroglia adalah sel imun utama dalam sistem saraf pusat, yang terkait erat dengan serangkaian proses seperti perkembangan otak, pemeliharaan lingkungan saraf, serta respons terhadap cedera dan perbaikan (Perea et al., 2020). Selain itu, mikroglia dapat dirangsang menjadi fenotipe M1 dan meningkatkan ekspresi sitokin pro-inflamasi ketika penyakit terkait peradangan saraf seperti AD terjadi (Tsukahara et al., 2020). Studi juga menunjukkan bahwa polarisasi ke fenotipe M1 sering disertai dengan gangguan metabolisme (Li L. et al., 2020), yang menyebabkan ketidakseimbangan metabolisme energi dan disfungsi mitokondria (Agrawal dan Jha, 2020). Perubahan merugikan ini berasal dari neurodegenerasi, bahkan penyakit Alzheimer.

Akteosida (ACT), a glikosida feniletanoid, terutama berasal dariCistanche tubulosa. Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa ACT memiliki banyak aktivitas farmakologis, termasuk:pelindung saraf(Wei dkk., 2019),antiinflamasi(Lai et al., 2019), danantioksidan(Ji et al., 2019) efek. Secara khusus, telah terbukti bahwa Acteoside dapatmeningkatkan pembelajaran dan memorigangguan serta meningkatkan metabolisme energi pada tikus yang diinduksi streptozotocin (Chen J. et al., 2020). Selain itu, juga dapat menghambat kematian sel apoptosis neuron dan kerusakan mitokondria pada tikus percobaan ensefalomielitis autoimun (Li W. et al., 2020). Namun, efek ACT pada polarisasi mikroglia M1/M2 dan mekanismenya jarang dilaporkan. Sampai saat ini, mekanisme seperti perbaikan fungsi mitokondria dan pengaturan metabolisme sel masih belum jelas dan penelitian ilmiah lebih lanjut diperlukan untuk memperjelas mekanisme yang tepat.

Tujuan dari laporan ini adalah untuk menyelidiki kemanjuran terapi ACT serta mekanisme molekuler yang mendasari ACT pada AD. Di sini, metode in silico yang sistematis untuk identifikasi target obat dibuat berdasarkan database yang terkonsolidasi. Kami menyelidiki lebih lanjut kemungkinan mekanisme ACT pada tingkat biologi molekuler dengan mengintegrasikan RNA-sequencing (RNA-seq) dengan metode metabolomik dan teknik biologi molekuler. Kombinasi strategi penyaringan sistematis in silico, in vivo, dan in vitro memberikan protokol baru untuk secara objektif menemukan senyawa multi-target pengobatan tradisional Tiongkok.

BAHAN DAN METODE

Pemodelan Jaringan

Empat platform online digabungkan untuk memprediksi dan menemukan target dariAkteosida, yaitu, GeneCards1, pendekatan ensemble kesamaan (SEA2 ), SwissTargetPrediction3, dan PharmMapper4. Semua asosiasi gen AD dikumpulkan secara independen dari DisGeNET5 dan GeneCards. Setelah analisis interaksi target-target dilakukan oleh database String6, jaringan selanjutnya diintegrasikan oleh perangkat lunak Cytoscape (Versi 3.8.2). Analisis pengayaan GO dan KEGG dilakukan pada database DAVID7 untuk membuat anotasi dan menambang jaringan.

Pengelompokan Hewan dan Model

Ikan zebra tipe liar (strain AB, umur 4 bulan) dipilih dalam penelitian ini (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Mereka dipertahankan di bawah siklus terang/gelap 14/10-jam pada 28◦C, mengikuti metode sebelumnya (Li YQ et al., 2020). Semua eksperimen ikan zebra dilakukan di bawah pengawasan Komite Etika Hewan Universitas Farmasi China. Larva ikan zebra dibagi menjadi enam kelompok dan diberi perlakuan dari 3 hari pasca pemupukan (dpf) hingga 7 dpf: kelompok kontrol, kelompok model, model plus kelompok donepezil hidroklorida (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.), dan model plusAkteosida(Kemurnian HPLC Lebih besar dari atau sama dengan 98 persen , Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) kelompok. Kelompok kontrol dipertahankan dalam medium dengan 0.2 persen DMSO dan kelompok model diperlakukan dengan 150 M AlCl3 (pH 5,8). Model ditambah kelompok DPZ diperlakukan bersama dengan AlCl3 dan 8 M DPZ. Model ditambahAkteosidakelompok diberi perlakuan bersama dengan AlCl3 dan konsentrasi ACT yang berbeda (200, 100, dan 50 M).

Analisis Perilaku

Pergerakan larva ikan zebra direkam oleh penganalisis perilaku ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) pada suhu 28◦C. Secara singkat, parameter perilaku dan pemrosesan hasil konsisten dengan metode yang kami buat sebelumnya (Li YQ et al., 2020). Di sini, kecepatan rata-rata (AS), perubahan kecepatan (1S), tingkat pemulihan diskinesia (DRR), dan efisiensi respons (RE, persen) dipilih untuk mengevaluasi pemulihan diskinesia pada ikan zebra.

Penentuan Aktivitas Acetylcholinesterase dan Choline Acetyltransferase

Setelah perlakuan dari 3 hingga 7 dpf, larva ikan zebra dikumpulkan untuk mengukur aktivitas Acetylcholinesterase (AChE) dan Choline Acetyltransferase (ChAT). Berdasarkan protokol pabrikan, aktivitas tersebut dideteksi oleh kit enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)

Kultur dan Perawatan Sel

Garis sel BV-2 dibeli dari Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC, Manassas, VA, Amerika Serikat). Mereka dibudidayakan di DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Cina). Media dilengkapi dengan 10 persen FBS (Gibco, Grand Island, NY, Amerika Serikat), 100 U/ml penisilin, dan 100 mg/ml streptomisin, disertai dengan 95 persen udara/5 persen CO2 pada 37◦C. Sel BV-2 diinkubasi dengan ACT (50, 25, dan 12,5 M) atau distimulasi dengan lipopolisakarida (LPS, 1 g/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Amerika Serikat) selama 24 jam. Sel-sel diamati di bawah mikroskop terbalik (Nikon ECLIPSE Ti2, Jepang).

Uji Viabilitas Sel

Alat Penghitung Sel-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) digunakan untuk mengevaluasi viabilitas sel. Secara singkat, absorbansi diukur pada 450 nm dengan pembaca pelat mikro (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Amerika Serikat).

Uji Produksi Oksida Nitrat

Nitric oxide (NO) ditentukan dengan mengukur kadar nitrit dalam supernatan kultur BV-2 menggunakan reagen Griess. Secara singkat, media (100 l) dipindahkan ke piring 96-sumur baru, volume yang sama dari reagen Griess ditambahkan ke setiap sumur dan direaksikan selama 15 menit dalam gelap. Penyerapan pada 540 nm ditentukan oleh Microplate Reader.

Tingkat Sitokin Inflamasi dalam Supernatan

Konsentrasi TNF-, IL-1, dan IL-10 dalam supernatan sel BV-2 ditentukan dengan kit ELISA sesuai dengan instruksi pabrik.

Penentuan Metabolisme Seluler dengan Analisis HPLC-Q-TOF-MS

Sel BV{{0}} diunggulkan dalam cawan enam lubang secara terpisah (n=6/kelompok). Setelah perawatan, media dihilangkan, dan sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin. Mereka kemudian segera terkena nitrogen cair untuk menekan metabolisme sel. Sel-sel dipanen dengan 8{{30}} persen metanol dingin. Untuk memfasilitasi pengendapan protein, sel-sel divorteks dengan kuat selama 1 menit dan disentrifugasi pada 13,000 rpm (15 menit, 4◦C). Suspensi sel dikeringkan di bawah aliran nitrogen. Residu kering dilarutkan dalam 150 l asetonitril 25 persen yang telah didinginkan sebelumnya. Untuk memastikan stabilitas dan akurasi analisis urutan, setiap sampel sel dengan volume yang sama (10 l) digabungkan sebagai sampel kontrol kualitas. Selama deteksi metabolit, sampel ini disuntikkan setelah setiap enam sampel untuk memastikan stabilitasnya. Sebuah 1-µl aliquot disuntikkan untuk HPLC-Q-TOF-MS. Analisis dilakukan pada sistem HPLC Agilent 1290 yang terhubung dengan spektrometer massa Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Amerika Serikat). Pemisahan dilakukan pada kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 menit × 100 mm, 1,7 m). Fase gerak terdiri dari 0,1 persen asam format-air (v/v; A) dan asetonitril (B). Tingkat sesama ditetapkan pada 0,4 ml/menit dengan kondisi elusi gradien optimal berikut: 0 hingga 2 menit, 5 persen B; 2 hingga 20 menit, 5 hingga 95 persen B (mode ion positif); 0 sampai 2 menit, 5 persen B; 2 hingga 20 menit, 5 hingga 95 persen B (mode ion negatif). Parameter operasi spektrometer massa ditetapkan sebagai berikut: suhu gas, 320◦C; gas pengering, 10 L/menit; nebulizer, 35 psi; VCap, 4,000 V; fragmen, 120 V. Data mentah dioperasikan di bawah MassHunter Workstation Software versi B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Amerika Serikat). Data mentah telah diproses sebelumnya oleh platform XCMS. Analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan kuadrat terkecil (PLS-DA) dari data yang dinormalisasi dilakukan dengan MetaboAnalyst8. Dikombinasikan dengan literatur, metabolit diferensial (VIP> 1, uji-t p <0,05) diidentifikasi="" pada="" hmdb9="" .="" akhirnya,="" analisis="" jalur="" dilakukan="" dengan="">

Pengukuran Potensi Membran Mitokondria

Potensi membran mitokondria (MMP) dideteksi menggunakan probe fluorescent FL JC-1 (Beyotime, China) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, sel-sel dari kelompok yang berbeda dibilas dengan PBS dan diinkubasi dengan larutan pewarnaan JC-1 selama 20 menit pada suhu 37◦C. Setelah pewarnaan, sel dicuci dua kali menggunakan buffer pewarnaan. Kemudian, sinyal fluoresen FL dideteksi oleh sesama sitometri (BD Accuri C6).

Pengukuran Adenosin Mitokondria 50 -Trifosfat

Konsentrasi adenosin 50 -trifosfat (ATP) dalam mitokondria dideteksi oleh ATP Assay Kit (Beyotime, China). Secara singkat, media kultur sel BV-2 dari kelompok yang berbeda dibuang, dan sel dihomogenisasi dengan buffer lisis di atas es. Supernatan yang diperoleh setelah sentrifugasi (12,000 g, 5 menit) digunakan untuk menentukan konsentrasi ATP. Pendaran terdeteksi oleh EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Pengukuran Tingkat Spesies Oksigen Reaktif Intraseluler

Kit Assay spesies oksigen reaktif (ROS) (Beyotime, Cina) digunakan untuk mengukur kadar ROS. Sel-sel dari kelompok yang berbeda diinkubasi dengan DCFH-DA (10 M) selama 20 menit pada 37◦C. Setelah pemuatan probe, sel dicuci tiga kali dengan DMEM. Kemudian, sinyal fluoresen FL dideteksi oleh sesama sitometri (BD Accuri C6).

Mikroskop Elektron Transmisi

Sel BV-2 diunggulkan dalam cawan enam lubang. Media dihilangkan dan 1 ml glutaraldehid 2,5 persen ditambahkan dengan cepat ke masing-masing sumur. Kemudian, sel-sel dikumpulkan dan difiksasi dengan glutaraldehid baru 2,5 persen pada suhu 4◦C semalaman. Setelah fiksasi, dehidrasi, dan penanaman, sel-sel diamati dengan mikroskop elektron transmisi HT7800 (Hitachi, Tokyo, Jepang).

RNA-Seq dan Analisis Data Bioinformatika

Total RNA dari sel BV-2 diekstraksi menggunakan reagen Trizol (Vazyme Biotech, China). Semua sampel analitik dikirim ke Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) untuk pengujian urutan RNA. Data dianalisis pada platform online Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 digunakan untuk mengukur kelimpahan gen. Pada dasarnya, ekspresi diferensial

analisis dilakukan dengan menggunakan DESeq2/DEGseq/EdgeR dengan nilai Q Kurang dari atau sama dengan 0.05; DEG dengan|log2FC| > 1 dan nilai Q Kurang dari atau sama dengan 0.05 (DESeq2 atau EdgeR)/nilai Q Kurang dari atau sama dengan 0,001 (DEGseq) dianggap sebagai gen yang diekspresikan berbeda secara signifikan. Selain itu, analisis pengayaan fungsional termasuk GO dan KEGG dilakukan untuk mengidentifikasi DEG mana yang diperkaya secara signifikan dalam istilah dan jalur GO pada nilai p yang dikoreksi Bonferroni Kurang dari atau sama dengan 0,05 dibandingkan dengan latar belakang seluruh transkriptom. Data urutan asli telah dikirimkan ke database Arsip Baca Urutan NCBI.

Reaksi Rantai Polimerase Real-Time Kuantitatif

Total RNA sel BV-2 dipanen menggunakan RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, China), dan reaksi transkripsi terbalik dilakukan dengan FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, China). Reaksi dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan. cDNA menjadi sasaran uji reaksi berantai polimerase waktu nyata kuantitatif (qRT-PCR) dengan primer spesifik dan TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Primer tercantum dalam Tabel Tambahan 1 dan -aktin digunakan sebagai kontrol internal. Metode CT 22 1 1 digunakan untuk analisis kuantitatif.

Analisis Western Blot

Sel BV-2 dilisiskan oleh buffer lisis RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) yang mengandung 1 persen Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher) untuk mendapatkan protein total. Protein dipisahkan oleh 10 persen SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran NC. Setelah diblok dengan 5 persen susu skim/BSA, membran diinkubasi dengan AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF- B (ABclonal), atau antibodi GAPDH (ABclonal) dalam 5 persen TBST pada 4◦C semalaman. Membran diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi peroksidase lobak sekunder (ABclonal) pada suhu kamar selama 1 jam. Substrat blotting ECL Western bertanda tinggi (Tanon, Cina), sistem pencitraan gel (Tanon, Cina), dan perangkat lunak ImageJ digunakan untuk visualisasi dan kuantisasi.

Docking Molekul

Analisis docking molekuler dilakukan dengan menggunakan software Autodock (Versi 4.2). Afinitas antara ACT dan protein diamati oleh perangkat lunak AutodockTools. Struktur protein tiga dimensi (3D) AMPK (PDB ID: 5g5j) dan NF-κB (PDB ID: 4q3j) diambil dari Protein Data Bank12.

Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dan dianalisis dengan Perangkat Lunak GraphPad Prism (Versi 8.0.1). Perbedaan antar kelompok dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA), dilanjutkan dengan uji komparasi ganda Tukey. p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">

HASIL

ACT-AD Menargetkan Jaringan Interaksi dan Prediksi Jalur

Melalui konsolidasi multi database, diperoleh 253 target ACT, sedangkan total 1.697 target terkait AD berhasil dikumpulkan. Setelah pemetaan jaringan target, total 70 target diserap ke dalam jaringan interaksi target ACT-AD (Gambar 1A). Analisis pengayaan KEGG menyiratkan bahwa ACT dapat memiliki spektrum luas dan efek target ganda (Gambar 1B). Ini juga menyarankan bahwa ACT memiliki beberapa jalur, titik target, dan elemen dalam pengobatan AD. Klasifikasikan jalur-jalur ini untuk mendapatkan interpretasi mekanisme yang akurat. ACT mungkin terutama berkorelasi dengan transduksi sinyal, sistem endokrin, sistem kekebalan, dan pertumbuhan dan kematian sel untuk memainkan peran konfrontatif melawan AD (Gambar 1C). Perlu dicatat bahwa sebagian besar jalur ini terkait dengan reaksi peradangan. Diperkirakan bahwa tindakan anti-inflamasi ACT mungkin merupakan bagian tak terpisahkan dari peran konfrontatifnya terhadap AD.

ACT Mengurangi Diskinesia dan Meningkatkan Fungsi Sistem Kolinergik pada Larva Ikan Zebra AD

Untuk memverifikasi model jaringan, model AD yang diinduksi AlCl3-pada larva ikan zebra digunakan untuk menunjukkan efek ACT. Pergerakan larva ikan zebra dalam siklus terang/gelap diamati, dan jejak renang mereka dicatat (Gambar 1D). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ACT efektif meningkatkan AS dan 1S ikan zebra, dan efek sinergis meningkat dengan peningkatan dosis (Gambar 1E). DRR dan RE menemukan perbandingan ACT dan DPZ yang lebih intuitif (Gambar 1F). Dengan demikian, ACT mengurangi diskinesia, menunjukkan efek yang mirip dengan DPZ. Secara umum disepakati bahwa sistem kolinergik memainkan peran penting dalam proses belajar dan memori. Dengan demikian, aktivitas AChE dan ChAT digunakan untuk mengungkapkan efek ACT. Paparan AlCl3 pada ikan zebra diberikan dengan perubahan kolinergik otak (Gambar 1G). Itu signifikan bahwa pengobatan ACT menekan aktivitas AChE. Selain itu, aktivitas ChAT menunjukkan penurunan setelah pengobatan ACT. Oleh karena itu, ACT menunjukkan dampak mendalam pada larva ikan zebra AD yang diinduksi AlCl3-.

ACT Menekan Polarisasi M1 dan Mempromosikan Polarisasi M2 dalam Sel BV yang Diinduksi LPS-2

Untuk mengkonfirmasi jaringan lebih lanjut, efek anti-inflamasi ACT dipelajari secara in vitro menggunakan sel mikroglial BV-2. Setelah pengobatan LPS selama 24 jam, viabilitas sel BV-2 menurun secara signifikan. Untungnya, ACT meningkatkan viabilitas sel sel BV-2 yang diinduksi LPS (Gambar 2A). Selain itu, morfologi sel BV-2 diamati. Setelah 24 jam stimulasi LPS, menunjukkan bahwa sel BV-2 mengalami keadaan polarisasi M1. Perubahan morfologi dicegah dengan pengobatan bersama ACT (Gambar 2B).

Selain itu, hasil menunjukkan bahwa, tidak seperti sel BV-2 yang distimulasi oleh LPS, sel BV-2 yang diobati bersama dengan ACT secara signifikan menekan ekspresi TNF- , IL-1 , dan NO (Gambar 2C). dalam supernatan sel. Ini adalah sitokin pro-inflamasi klasik sebagai indikator polarisasi mikroglia M1. Serupa dengan hasil ELISA, hasil qPCR menemukan bahwa ekspresi mRNA TNF- , nitric oxide synthase (iNOS), IL-1 , dan CD86 secara signifikan dihambat oleh perlakuan ACT dibandingkan dengan kelompok LPS. (Gambar 2D). Selanjutnya, kami mengukur tingkat polarisasi mikroglia M2 dengan ELISA (Gambar 2C) dan qPCR (Gambar 2E), dan hasilnya menunjukkan bahwa ACT secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi penanda terkait mikroglia M2 (IL-10, CD206, TGF-, dan Argumen-1). Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwaBERTINDAKmenekan polarisasi mikroglia M1 dan mempromosikan fenotipe M2.

Polarisasi M1/M2 yang Diatur ACT melalui Penghambatan Jalur NF-κB

Analisis transkriptomik dilakukan oleh RNA-seq untuk mengeksplorasi mekanisme ACT dalam sel BV-2 dari tingkat keseluruhan. PCA menggambarkan bahwa kelompok kontrol, LPS, dan ACT dapat dibedakan dengan baik (Gambar 3A). Ini mengungkapkan 899 gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) antara kelompok kontrol dan kelompok LPS, dan 49 DEG antara kelompok LPS dan kelompok ACT (Gambar 3B). Secara konsisten, analisis pengayaan GO (Gambar 3C) dan KEGG (Gambar 3D) mengungkap bahwa efek ACT terlibat dalam jalur NF-κB. Kumpulan gen yang terkait dengan jalur NF-κB dikonfirmasi lebih lanjut, dan homeostasis mereka tentu saja dipengaruhi oleh LPS. Seperti yang diharapkan, ACT secara signifikan mempengaruhi ekspresi mereka (Gambar 3E). Jalur NF-kB adalah jalur klasik untuk mengatur perkembangan peradangan, yang pada akhirnya menghasilkan pelepasan faktor pro-inflamasi. Untuk mendapatkan dukungan mekanistik, protein kunci dari jalur NF-κB dievaluasi dengan Western blot. Stimulasi LPS menyebabkan aktivasi NF-kB, terkait dengan mempromosikan polarisasi M1. Konsisten dengan analisis RNA-seq, ACT menghambat fosforilasi NF-kB yang distimulasi LPS (Gambar 3F). Oleh karena itu, ACT dapat meredakan polarisasi M1 yang diinduksi LPS melalui jalur NF-κB dalam sel BV-2.

ACT Mengganggu Biosintesis Arginin serta Biosintesis Pantotenat dan CoA

Prediksi jaringan ACT mengungkapkan bahwa itu terkait dengan arginin (Arg) dan metabolisme prolin (Gambar 1B). RNA seq menunjukkan bahwa jalur yang dipengaruhi oleh ACT juga termasuk biosintesis Arg serta biosintesis pantotenat dan CoA (Gambar 3D). Telah disarankan bahwa gangguan metabolisme sel BV-2 yang diinduksi oleh stimulasi LPS dikaitkan dengan polarisasi M1 (Orihuela et al., 2016). Dengan demikian, metabolisme sel yang tidak ditargetkan oleh HPLC-Q-TOF-MS digunakan untuk mengidentifikasi efek ACT pada metabolisme sel. PCA dan PLS-DA (Gambar 3G) menggambarkan bahwa kelompok kontrol, LPS, dan ACT dapat dibedakan dengan baik berdasarkan metabolit intraseluler. Tingkat berbagai metabolit dalam sel BV yang diinduksi LPS -2 diubah setelah pengobatan ACT (Gambar 3H). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, ada 11 metabolit yang berubah secara signifikan pada kelompok LPS (Tabel Tambahan 2), sedangkan 14 metabolit berubah secara jelas setelah pengobatan ACT (Tabel Tambahan 3), yang melibatkan 11 jalur metabolisme (Gambar 3I). Efek ACT terutama terdiri dari pengaturan metabolisme asam amino, metabolisme nukleotida, metabolisme energi, dan metabolisme kofaktor dan vitamin. Menariknya, jalur metabolisme yang diperoleh metabolome konsisten dengan prediksi jaringan dan RNA-seq, termasuk biosintesis Arg serta biosintesis pantotenat dan CoA. Hal di atas menunjukkan bahwa ACT dapat mengatur biosintesis Arg serta biosintesis pantotenat dan CoA dalam sel BV yang distimulasi LPS- 2.

BERTINDAKDisfungsi Mitokondria yang Diinduksi LPS yang Dimitigasi-2

Mitokondria adalah inti dari jalur metabolisme. Bukti yang berkembang menunjukkan bahwa mitokondria adalah pemain kunci dalam polarisasi mikroglial M1/M2. Gambaran status mitokondria dalam morfologi dan distribusi sel dinilai oleh TEM. Setelah stimulasi LPS, kromatin sel BV-2 memadat, dan sitoplasma serta mitokondria berkurang (Gambar 4A). Selain itu, krista mitokondria kelompok LPS tidak teratur atau bahkan menghilang, menunjukkan kristolisis parsial, pengurangan ukuran, dan morfologi berbentuk bulat. Menariknya, pengobatan ACT dapat meringankan perubahan morfologis yang diinduksi LPS di mitokondria. Secara bergantian, kami memeriksa fungsi mitokondria sel BV-2 yang diobati dengan LPS, termasuk produksi MMP dan ATP. MMP (Gambar 4B) dan produksi ATP di mitokondria (Gambar 4C) meningkat secara signifikan pada kelompok ACT dibandingkan dengan kelompok LPS. Disfungsi mitokondria mungkin terkait dengan peningkatan kadar ROS dalam sel. Analisis flow cytometry mengungkapkan bahwa kandungan ROS kelebihan beban pada kelompok LPS (Gambar 4D). Untungnya, ACT menghilangkan ROS yang berlebihan. Ini menunjukkan bahwa ACT dapat mengembalikan fungsi mitokondria dengan membersihkan ROS.

ACT Memulihkan Fungsi Mitokondria Melalui Upregulasi PGC-1 dan UCP-2

Peroxisome proliferative-activated receptor-co-activator-1 (PGC-1 ) memainkan peran penting dalam biogenesis mitokondria (Bi et al., 2019). Stimulasi LPS menurunkan ekspresi PGC-1 , menunjukkan disfungsi mitokondria. Hebatnya, mRNA gen PGC-1 dan ekspresi protein dibalik secara signifikan oleh pengobatan ACT dalam sel BV-2 yang diobati dengan LPS (Gambar 4E).

Protein uncoupling mitokondria-2 (UCP-2) juga diketahui mengatur fungsi mitokondria. Sebagai protein hilir PGC-1 , ia dapat mengontrol depolarisasi MMP yang diinduksi LPS dan produksi ROS. Laporan terbaru menunjukkan bahwa itu adalah pusat dari proses aktivasi mikroglial, dengan regulasi berlawanan dari polarisasi M1 dan M2 (De Simone et al., 2015). Hasil Western blot menunjukkan bahwa kadar protein UCP-2 menurun setelah pemberian stimulasi LPS. Pengobatan bersama LPS dan ACT dapat meningkatkan regulasi ekspresi UCP-2 dibandingkan dengan pengobatan LPS. Tingkat ekspresi mRNA UCP-2 juga menunjukkan perubahan yang serupa (Gambar 4F). Singkatnya, ACT memulihkan fungsi mitokondria melalui peningkatan regulasi PGC-1 dan UCP-2.

ACT Ditekan Microglia M1

Polarisasi melalui Aktivasi AMPK

Sebagai kunci sensor energi seluler, AMP-activated protein kinase (AMPK) memainkan peran penting dalam menjaga keseimbangan metabolisme sel. Pada saat yang sama, PGC-1 adalah protein hilir AMPK. Seperti yang ditunjukkan dalam analisis model jaringan,BERTINDAKmungkin mengatur jalur AMPK (Gambar 1B). Hasil menemukan bahwa LPS menghambat aktivasi AMPK, yang mengakibatkan gangguan metabolisme sel dan disfungsi mitokondria. Patut dicatat bahwa ACT dapat bergantung pada dosis meningkatkan ekspresi protein p-AMPK (Gambar 5A). Disarankan bahwa ACT dapat meningkatkan ekspresi PGC-1 dan mengembalikan fungsi mitokondria dengan mengaktifkan jalur pensinyalan AMPK. Dalam penelitian ini, untuk menyelidiki apakah aktivasi AMPK berkontribusi terhadap efek regulasi dariBERTINDAKpada polarisasi M1/M2, senyawa C (CC) digunakan untuk menghambat efek AMPK. Berbeda dengan level NO yang diturunkan regulasinya pada kelompok perlakuan ACT, CC sebagian memblokir efek ACT pada level NO (Gambar 5B). Berdasarkan hasil tersebut, ACT dapat mengatur polarisasi M1/M2 sel BV-2 melalui aktivasi AMPK.

BERTINDAKMengikat dan Menghambat NF-κB serta Mengaktifkan AMPK

Docking molekuler diterapkan untuk mengkonfirmasi apakah ACT mengikat protein NF-κB dan AMPK. Temuan menunjukkan bahwa energi ikat dariBERTINDAKdan NF-κB adalah -8.4 kkal/mol, sedangkanBERTINDAKdan AMPK adalah -10.8 kkal/mol. Afinitas yang signifikan memverifikasi bahwa ACT terikat ke NF-κB dan AMPK secara langsung (Gambar 5C, D, F, G). Selanjutnya, kemungkinan mode pengikatan dan interaksi dalam kantong asam amino dieksplorasi lebih lanjut, termasuk 11 residu asam amino NF-κB (Gambar 5E) serta 12 residu asam amino AMPK (Gambar 5H). Hasil ini menunjukkan bahwa ACT mungkin secara langsung mempengaruhi NF-κB dan AMPK untuk melemahkan polarisasi mikroglia M1 BV-2 dan mempromosikan fenotipe M2.