Bagian Ⅱ Pengembangan Immunoassay Aliran Lateral Nanopartikel Europium Untuk Deteksi NGAL dalam Urine Dan Diagnosis Cedera Ginjal Akut

Hasil

1. Ekspresi dan pemurnian protein NGAL rekombinan

Plasmid rekombinan pSecTag2A-NGAL ditransfeksi menjadi sel CHO. NGAL-6×Proteinnya terutama diekspresikan dalam supernatan sel dan selanjutnya dimurnikan oleh Ni Sepharose. Protein NGAL rekombinan yang dimurnikan diperoleh dengan kemurnian sekitar 95 persen dan dianalisis dengan SDS-PAGE dengan perkiraan berat molekul 23,7 kDa (Gbr. 1 A). Western blot juga mengkonfirmasi ekspresi dan pemurnian protein NGAL rekombinan (Gbr. 1B).

2. Generasi MAbs

Pertama, kami membandingkan efek tegangan DC pada perforasi membran sel di bawah intensitas medan listrik yang berbeda, dan amplitudo pulsa masing-masing adalah 400 V, 450 V, 500, dan 550 V, untuk mengoptimalkan skema fusi listrik. Menurut laporan sebelumnya, konsentrasi sel memiliki dampak yang signifikan terhadap efisiensi fusi[16]. Suspensi campuran sel limpa terisolasi dan sel myeloma SP2 / 0 dipindahkan ke ruang fusi pada konsentrasi berbeda sekitar 2 × 106, 2 × 107, dan 2 × 108 sel /mL. Efisiensi fusi adalah yang tertinggi pada 450 V DC, dan konsentrasi sel yang optimal adalah 2 × 107 sel/mL (Gbr. 2).

3. Karakterisasi MAbs

MAb dimurnikan dengan kolom Protein A. MAbs yang dimurnikan dipisahkan oleh 12 persen SDS-PAGE, dan dua pita dengan berat molekul 55 kDa dan 25 kDa diamati dalam kondisi reduksi. Pita bening 170 kDa dicatat dalam kondisi non-reduksi, yang merupakan protein utuh 2F4 dan 1G1 (Gbr. 3 A). Western blot menunjukkan bahwa semua MAbs secara khusus berikatan dengan protein NGAL manusia (Gbr. 3B). Setelah elektrofusi sel dan sub-kloning, supernatan hibridoma dideteksi oleh ELISA tidak langsung dengan NGAL-6×His dan PCT- 6×His untuk memastikan pengikatan khusus antibodi ke NGAL. Dua hibridoma yang sangat positif (1G1, 2F4) dengan pengikatan NGAL spesifik tanpa reaksi silang terhadap PCT-6×His berhasil dipilih untuk produksi dan pemurnian MAbs (Gbr. 3 C). Untuk mendeteksi afinitas dua MAbs, interaksi antara antibodi dengan konsentrasi berbeda dan protein NGAL dianalisis dengan sistem BIAcore T200. Diagram kinetik menunjukkan bahwa afinitas 2F4 dan 1G1 masing-masing adalah 4,5 × 10−7 dan 6,0 × 10−7 (Gbr. 3D). Isotipe dari kedua MAbs yang terdeteksi oleh kit komersial adalah IgG1. Tingkat pemblokiran pasangan 2F4 dan 1G1-HRP adalah 63 persen dengan deteksi cELISA, yang menunjukkan bahwa mereka mengenali epitop yang berbeda.

4. Prosedur EU-NPS-LFIA

Berdasarkan EU-NPS sebagai label dan immunoassay tipe sandwich, LFIA didirikan untuk mendeteksi NGAL. MAb 2F4 dilapisi pada membran nitroselulosa dan dipasangkan dengan EU-NPS-1G1 berdasarkan pasangan antibodi dalam platform imunokromatografi aliran lateral. Seperti yang diilustrasikan secara skematis (Gbr. 4), TL dan CL membran nitroselulosa dilapisi dengan MAbs 2F4 dan IgG anti-tikus kambing. EU-NPS-1G1 diberi label pada conjugate pad. Sampel yang mengandung antigen NGAL bermigrasi ke bantalan konjugat untuk bergabung dengan EU-NPS-1G1 dan membentuk kompleks antigen-antibodi. Selanjutnya, kompleks ditangkap oleh mAb 2F4 di T-line sambil bermigrasi untuk membentuk kompleks sandwich. Kompleks berlebih dikombinasikan dengan IgG anti-tikus kambing. Strip uji diukur dengan detektor fluoresensi setelah 15 menit.

5. Evaluasi kinerja

Pasangan antibodi (2F4- labled1G1) sebagai antibodi pendeteksi dan penangkap digunakan untuk menetapkan imunokromatografi fluoresen, dan kinerja analitik EU-NPS-LFIA dievaluasi dengan membangun kurva standar. Rasio intensitas fluoresensi relatif (HT/HC) meningkat dengan konsentrasi NGAL. EU-NPS-1G1 menunjukkan reaksi terhadap mAb 2F4 (Gbr. 5 A). Pengaruh kait dosis tinggi tidak terdeteksi saat konsentrasi antigen mencapai 3000 ng/mL. Persamaan regresi diperlihatkan sebagai berikut: y=0.0012 x ditambah 0.0059 (R2=0.99), di mana y mewakili rasio HT/HC, dan x mewakili konsentrasi NGAL (Gbr. 5B). Batas deteksi (LOD) adalah 0,36 ng/mL (3 kali standar deviasi blanko, n=20) dihitung oleh Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) Guideline EP17-A2, konsentrasi NGAL memiliki hubungan linier dalam rentang 1-1500 ng/mL[17].

6. Presisi

Eksperimen pemulihan intra-assay dan interassay dilakukan untuk mengevaluasi presisi dan reproduktifitas metode imunologi. Konsentrasi yang berbeda (50, 200, dan 800 ng/mL) dari zat standar NGAL ditambahkan ke sampel urin negatif. Presisi intra-pengujian dihitung dengan tiga ulangan pada setiap konsentrasi berduri dalam 1 hari, dan presisi antar-pengujian dihitung dengan tiga ulangan pada setiap konsentrasi berduri setiap tiga hari selama lima belas hari terus menerus [18]. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1, koefisien variasi (CV) intraassay yang dihitung berkisar antara 2,57 hingga 4,98 persen (n=10), lebih rendah dari 10 persen . CV antar pengujian berkisar antara 4,11 hingga 7,83 persen (n=15), lebih rendah dari 10 persen juga.

Presisi intra-pengujian dan antar-pengujian diverifikasi oleh dua perangkat evaluator (Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd dan Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd), dan hasilnya pada akhirnya konsisten. Hasil ini menjelaskan bahwa presisi LFIA yang dikembangkan berada pada level tinggi, dan reproduktifitas berada pada level yang dapat diterima.

Klik di sini untuk membeliSuplemen cistanche

7. Kekhususan

Spesifisitas strip tes dievaluasi dengan menambahkan zat endogen dalam konsentrasi normal dan sampel urin yang berbeda, termasuk kreatinin, glukosa, dan nitrogen urea. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, hasil menunjukkan bahwa semua deviasi relatif (RD) berada dalam kisaran ± 10 persen, yang menunjukkan bahwa interaksi antigen-antibodi stabil dan menggambarkan spesifisitas strip uji dapat diterima terhadap NGAL.

8. Tes sampel klinis

Untuk menilai kompetensi aplikatif NGAL berdasarkan EU-NPS-LFIA untuk penentuan sampel klinis, total 83 sampel urin mengandung 26 sampel bernilai rendah (11–70 ng/mL), 19 median sampel nilai (110–800 ng/mL), 38 sampel bernilai tinggi (800–1740 ng/mL), diukur pada uji NGAL urine ARCHITECT. Hasil koefisien korelasi (R2 ) dari kurva regresi adalah 0,9829 (p < 0,01), menunjukkan bahwa kedua metode deteksi memiliki hubungan linier yang signifikan (di mana x mewakili konsentrasi NGAL yang diperoleh oleh penganalisis ARCHITECT, y mewakili nilai yang diukur dengan strip uji yang dikembangkan) (Gbr. 6). Dengan demikian, EU-NPS-LFIA yang dikembangkan untuk penentuan NGAL sangat akurat dalam uji klinis.

Diskusi

EU-NPS-LFIA untuk deteksi NGAL dalam urin manusia dan diagnosis AKI telah dikembangkan dalam penelitian kami. Diagnosis AKI saat ini dikonfirmasi oleh konsentrasi serum kreatinin (sCr), yang stabil kecuali setidaknya 50 persen dari fungsi ginjal yang rusak[19]. AKI berkembang pada 89 persen pasien COVID-19 parah-19, dan sebagian besar pasien mengalami oliguria saat muncul lebih awal dari Kreatinin plasma[20]. Biomarker meningkatkan level tinggi saat masuk, yang dikaitkan dengan peningkatan mortalitas. NGAL adalah salah satu biomarker tersebut, yang tingkatnya mungkin berkorelasi positif dengan risiko kematian pada pasien rawat inap COVID-19[21]. Pada AKI, beberapa penelitian telah menemukan konsentrasi NGAL dalam urin secara signifikan berhubungan dengan konsentrasi sCr [22]. Dalam beberapa tahun terakhir, berbagai metode elektrokimia dan imunologi telah dikembangkan untuk mendeteksi NGAL, contoh penentuan elektrokimia, uji ligasi kedekatan fase padat, dan uji imunokimia elektrokimia bebas enzim [23, 24]. Namun, teknik ini membutuhkan peralatan yang tepat, personel khusus, dan interpretasi hasil yang profesional. Oleh karena itu, mengembangkan uji deteksi yang efektif dan nyaman untuk konsentrasi NGAL dalam urin sangat penting untuk pemantauan gangguan ini. Rendahnya efisiensi fusi polietilen glikol (PEG) dalam metode konvensional menyebabkan kesulitan dalam memperoleh antibodi fungsional, kami mengoptimalkan parameter fusi listrik yang memungkinkan peningkatan efisiensi fusi untuk menyiapkan hibridoma yang layak dan memperoleh dua MAb anti-NGAL. MAbs tidak hanya memiliki afinitas tinggi tetapi juga diarahkan ke epitop yang berbeda, digunakan untuk menetapkan uji diagnostik berkualitas tinggi.

Herba Cistanche

Dalam beberapa tahun terakhir, banyak penelitian telah dilaporkan untuk mengembangkan beberapa immunoassay diagnostik cepat NGAL, termasuk imunosensor fotoelektrokimia dan tiga imunosensor elektrokimia, uji ligasi kedekatan fase padat, dan uji aliran lateral [25]. Dalam satu penelitian, imunosensor telah dibuat oleh antibodi penangkap NGAL yang diimobilisasi ke elektroda karbon termodifikasi yang dicetak di layar dan penambahan berlabel antibodi sekunder terhadap NGA ke nanosheet g-C3N4 yang didekorasi dengan PB-NP membentuk sandwich pada SPCE [24]. Studi lain mengembangkan antibodi terhadap NGAL yang diimobilisasi pada elektroda cetak layar (SPCE) yang dimodifikasi dengan anilin elektropolimerisasi yang diendapkan di atas grafena/poli-anilin elektrospray (G/PANI)[25]. Dua laporan menunjukkan LOD sangat bervariasi dari 0.6 pg/mL hingga 21.1 ng/mL, tergantung pada nanosheet g-C3N4 dengan elemen N yang meningkatkan efisiensi elektrokatalitik nanohibrid daripada nanosheet graphene, dan LOD dari NGAL uji bervariasi tergantung pada imunosensor, kompleks terkonjugasi, dan antibodi [26]. Menurut penelitian tersebut, kami mengetahui bahwa sensitivitas LFIA dapat ditingkatkan dengan mendasarkan pada nanopartikel fluoresensi berbeda yang disebutkan di bagian pembukaan. Nanopartikel sensitivitas tinggi yang diberi label dalam LFIA sebagai probe fluoresen telah terus diteliti selama beberapa dekade terakhir, nanopartikel emas adalah yang paling banyak digunakan, tetapi penerapan uji aliran lateral berdasarkan label tradisional terbatas pada identifikasi yang buruk dan sinyal yang lebih lemah. 27]. Saat ini, ada antibodi yang tersedia untuk pengembangan NGAL telah diterapkan pada platform yang berbeda untuk deteksi NGAL, tetapi tidak tersedia di LFIA berdasarkan label EU-NPS yang bereksperimen pada deteksi NGAL selain uji aliran lateral berbasis teknologi UCP [28 , 29].

Imunoassay fluoresensi memiliki keunggulan dalam berbagai bidang deteksi, terutama pada titik-titik kuantum dewasa, sensitivitasnya dipengaruhi oleh MAbs dan bahan fluoresen, dan dapat ditingkatkan secara signifikan oleh EU-NPS dan MAb spesifik untuk menggunakan probe fluoresen[30 ]. EU-NPS diterapkan pada strip LFIA fluoresensi yang telah matang di bidang deteksi dan meningkatkan beberapa keunggulan LFIA untuk sensitivitas, spesifisitas, dan stabilitas pengujian [31]. Karena sifat EU-NPS yang sangat baik, batas deteksi NGAL dalam metode ini adalah 0.36 ng/mL, sedangkan rata-rata kadar NGAL urin sekitar 7,0 ng/mL pada individu sehat[32] . Perkembangan dan penerapan EU-NPS-LFIA NGAL masih dalam tahap awal, pengujian ini perlu menguji NGAL sampel serum dan urin dengan pasien COVID-19 yang perbaikan dalam perawatannya di masa mendatang berhasil .

Kesimpulan

Dalam penelitian tersebut, kami berhasil mendapatkan dua MAbs anti-NGAL tikus (2F4, 1G1) dan diberi label dengan EU-NPS untuk membangun teknik kekebalan aliran lateral. EU-NPSLFIA ditemukan mendeteksi NGAL dalam rentang luas 1- 3000 ng/mL dalam waktu 15 menit, sensitivitas deteksi mencapai 0.36 ng/mL. MAb anti-NGAL ini dapat digunakan secara andal dalam fluoresensi LFIA dari deteksi NGAL dalam sampel urin sehingga harus dapat diterapkan dalam diagnosis AKI.

Cistanche tubulosa

Efektivitas Cistanche Extract pada cedera ginjal akut

Cedera ginjal akut (AKI), juga dikenal sebagai gagal ginjal akut, adalah kondisi medis umum yang terkait dengan penurunan fungsi ginjal secara tiba-tiba. AKI dapat menyebabkan morbiditas dan mortalitas yang signifikan, terutama jika tidak ditangani. Dengan demikian, diagnosis dini dan pengobatan yang cepat sangat penting untuk meningkatkan hasil pasien.

Ekstrak Cistanche, berasal dari tanaman Cistanche deserticola, telah digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok untuk mengobati berbagai kondisi kesehatan. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa ekstrak Cistanche mungkin menjanjikan dalam pengobatan AKI.

Studi telah mengidentifikasi mekanisme potensial dimana ekstrak Cistanche memberikan efek terapeutiknya pada AKI. Ini termasuk penekanan peradangan, pengurangan stres oksidatif, penurunan regulasi jalur apoptosis, dan promosi regenerasi jaringan. Selain itu, ekstrak Cistanche telah terbukti mencegah perkembangan fibrosis ginjal, yang dapat terjadi akibat AKI.

Penelitian pada hewan menunjukkan bahwa pemberian ekstrak Cistanche memiliki efek perlindungan pada fungsi ginjal pada model AKI, yang menyebabkan peningkatan laju filtrasi glomerulus, mengurangi kerusakan sel tubular, dan penurunan nitrogen urea darah dan kadar kreatinin serum. Studi lebih lanjut dalam praktik klinis pada subyek manusia menunjukkan peningkatan keluaran urin dan Laju Filtrasi Glomerulus (GFR) sambil mencegah peningkatan kadar serum nitrogen Urea dan Kreatin lebih lanjut pada pasien dengan AKI terkait operasi jantung.

Namun, masih ada beberapa pertanyaan mengenai dosis ideal, profil keamanan jangka panjang, dan standarisasi sediaan. Uji coba terkontrol acak berkualitas tinggi tambahan diperlukan untuk mengevaluasi dosis optimal dan rejimen pemberian ekstraksi Cistanche.

Secara keseluruhan, bukti menunjukkan bahwa ekstrak Cistanche mungkin merupakan terapi yang efektif untuk AKI, meskipun penelitian dan pengujian lebih lanjut diperlukan untuk mendapatkan rekomendasi yang lebih pasti. Kesimpulannya, meskipun ada beberapa keterbatasan, ekstrak Cistanche menunjukkan potensi dalam mengurangi keparahan AKI. Deteksi dini dan pengobatan yang tepat dapat meningkatkan hasil pasien dan kualitas hidup. Pasien harus menjalani konsultasi dengan penyedia layanan kesehatan sebelum melakukan terapi alternatif untuk memastikan keamanan dan menghindari efek samping.

efek Cistanche

Referensi

15. Huang X, Aguilar Z, Xu H, Lai W, Xiong Y: Strip imunokromatografi aliran lateral berbasis membran dengan nanopartikel sebagai reporter untuk deteksi: Tinjauan. Biosensors bioelectronics 2016, 75:166–180.

16. Weeratna R, Comanita L, Davis H: CPG ODN memungkinkan dosis antigen yang lebih rendah terhadap antigen permukaan hepatitis B pada tikus BALB/c. Biologi sel imunologi 2003, 81(1):59–62.

17. Tong Q, Chen B, Zhang R, Zuo C: Standarisasi analisis enzim klinis menggunakan kumpulan serum manusia beku dengan nilai yang ditetapkan oleh Federasi Internasional Kimia Klinis dan prosedur pengukuran rujukan Kedokteran Laboratorium. Jurnal Skandinavia investigasi laboratorium klinis 2018, 78:74–80.

18. Huang D, Ying H, Jiang D, Liu F, Tian Y, Du C, Zhang L, Pu X: Deteksi interleukin-6 yang cepat dan sensitif dalam serum melalui immunoassay aliran lateral yang diselesaikan waktu. Biokimia analitik 2020, 588:113468.

19. Shapiro N, Trzeciak S, Hollander J, Birkhahn R, Otero R, Osborn T, Moretti E, Nguyen H, Gunnerson K, Milzman D et al: Akurasi diagnostik lipocalin terkait gelatinase neutrofil plasma dalam prediksi ginjal akut cedera pada pasien gawat darurat dengan dugaan sepsis. Annals of emergency medicine 2010, 56(1):52–59.e51.

20. Luther T, Bülow-Anderberg S, Larsson A, Rubertsson S, Lipcsey M, Frithiof R, Hultström M: Pasien COVID-19 dalam perawatan intensif mengalami cedera ginjal akut yang dominan oliguria. Ahli anestesi Acta Scandinavica 2021, 65(3): 364–372.

21. Abers M, Delmonte O, Ricotta E, Fintzi J, Fink D, de Jesus A, Zarember K, Alehashemi S, Oikonomou V, Desai J: Tanda biomarker berbasis kekebalan dikaitkan dengan kematian pada COVID-19 pasien. Wawasan JCI 2021, 6(1).

22. Wagener G, Jan M, Kim M, Mori K, Barasch J, Sladen R, Lee H. Hubungan antara peningkatan lipocalin terkait gelatinase neutrofil urin dan disfungsi ginjal akut setelah operasi jantung dewasa. Anestesiologi 2006, 105(3):485–491.

23. Kannan P, Tiong H, Kim D: Penentuan elektrokimia yang sangat sensitif dari lipocalin terkait gelatinase neutrofil untuk cedera ginjal akut. Biosensor bioelectronics 2012, 31(1):32–36.

24. Zhang F, Zhong H, Lin Y, Chen M, Wang Q, Lin Y, Huang: Sebuah nanohybrid terdiri dari Prusia Blue dan nanosheet CN grafit sebagai tag penghasil sinyal dalam immunoassay elektrokimia bebas enzim untuk neutrofil gelatinase- lipokalin terkait. Mikrochimica acta 2018, 185(7):327.

25. Yukird J, Wongtangprasert T, Rangkupan R, Chailapakul O, Pisitkun T, Rodthongkum N: Immunosensor bebas label berdasarkan graphene / polyaniline nanocomposite untuk deteksi lipocalin terkait neutrofil gelatinase. Biosensor bioelektronika 2017, 87:249–255.

26. Gong Y, Li M, Wang Y: Karbon nitrida dalam konversi dan penyimpanan energi: kemajuan dan prospek terkini. ChemSusChem 2015, 8(6):931–946.

27. Chen A, Yang S: Mengganti antibodi dengan aptamers dalam immunoassay aliran lateral. Biosensor bioelectronics 2015, 71:230–242.

28. Li H, Mu Y, Yan J, Cui D, Ou W, Wan Y, Liu S: imunosensor fotoelektrokimia bebas label untuk lipocalin terkait gelatinase neutrofil berdasarkan penggunaan nanobodi. Kimia analitik 2015, 87(3): 2007–2015.

29. Lei L, Zhu J, Xia G, Feng H, Zhang H, Han Y: Pengujian yang cepat dan ramah pengguna untuk mendeteksi lipocalin terkait gelatinase neutrofil (NGAL) menggunakan nanopartikel konversi naik. Talanta 2017, 162:339–344.

30. Yeo S, Bao D, Seo G, Bui C, Kim D, Anh N, Tien T, Linh N, Sohn H, Chong C et al: Peningkatan aplikasi diagnostik cepat antibodi monoklonal terhadap virus subtipe H7 flu burung menggunakan nanopartikel Europium. Laporan Ilmiah 2017, 7(1):7933.

31. Chen E, Xu Y, Ma B, Cui H, Sun C, Zhang M: MonascusCarboxylFunctionalized, Uji Immunochromatographic Berbasis Nanopartikel Europium untuk Deteksi Sensitif Citrinin dalam Makanan Fermentasi. Racun 2019, 11(10).

32. Bolignano D, Coppolino G, Campo S, Aloisi C, Nicocia G, Frisina N, Buemi M: Lipocalin terkait gelatinase neutrofil pada pasien dengan penyakit ginjal polikistik dominan autosomal. Jurnal Nefrologi Amerika 2007, 27(4):373–378.

Moli Yin 1 % 2c Yuanwang Nie 2 % 2c % 2c Lei Liu 1 % 2c Lu Tang 1 % 2c Yuan Dong 2 % 2c Chuanmin Hu 1 dan Huiyan Wang 1

1 Pusat Inovasi Kolaborasi Jilin untuk Rekayasa Antibodi, Universitas Kedokteran Jilin, 132013 Jilin, PR China.

2 Akademi Laboratorium, Universitas Kedokteran Jilin, 132013 Jilin, PR China.