Bagian 2: Anti-Inflamasi, Antioksidan, Pelembab, Dan Antimelanogenesis Efek Quercetin 3-O-β-D-Glucuronide dalam Keratinosit Manusia Dan Sel Melanoma Melalui Aktivasi Nf-κB Dan AP-1 Jalur

Untuk lebih jelasnya, hubungitina.xiang@wecistanche.com

Klik tautan untuk mempelajari bagian1:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118257.html

3. Diskusi

Dalam studi yang diterbitkan sebelumnya, Q-3-G telah digunakan untuk menghambat edema telinga, permeabilitas peritoneum, dan edema paru [50], bertindak sebagai ampuhAntioksidandalam plasma darah dengan lipoprotein densitas rendah [42], mengurangi modifikasi oksidatif yang diinduksi peroksinirit [51], mengerahkananti-inflamasiefek dengan menghambat jalur pensinyalan JNK dan ERK di bawah tantangan LPS [52] dan memiliki sifat antikanker terhadap sel kanker payudara [56]. Namun, tidak seperti senyawa induknya yang banyak dipelajari,Quercetin, manfaat farmakologis, dan mekanisme Q-3-G masih harus dieksplorasi. Sejauh pengetahuan kami, peran Q-3-G pada efek perlindungan kulit belum sepenuhnya dijelaskan. Dalam penelitian ini, dengan menggunakan berbagai penilaian in vitro, kami berfokus pada karakterisasi efek perlindungan kulit Q-3-G terhadap UVBor H2O2, -induced oxidative stress and inflammation, hidrasi kulit di HaCaT (garis sel keratinosit manusia), danantimelanogenesisaktivitas di B16F10 (garis sel melanoma murine).

Viabilitas sel HaCaT, B16F10, dan HEK293T ditentukan setelah perawatan dengan Q-3-G pada berbagai konsentrasi non-sitotoksik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada penghambatan viabilitas sel yang signifikan pada sel HaCaT, B16F10, dan HEK293T atas konsentrasi Q-3-Gup hingga 20 μM (Gambar 2a,3a, dan 4f). Viabilitas sel dalam sel HaCaT, B16F10, dan HEK293T pada konsentrasi O-3-G hingga 20 μM ditemukan lebih rendah dari konsentrasi quercetin ketika digunakan untuk menyelidiki efek sitotoksik pada sel SCC-9 dan HSC-6 (50 μM)【57】atau viabilitas sperma (50-100μM)【58】. Namun, Q-3-G terbukti jauh lebih tidak beracun dibandingkan dengan aglycone-nya [59]. Kurangnya kelompok OH bebas pada tiga posisi dapat berkontribusi pada efek yang kurang beracun dari Q-3-G [29].

Sinar UVB dengan panjang gelombang 280-315 nm menembus lapisan atas kulit dan lebih efektif daripada UVA dan UVC[60]. Sinar UVB adalah alasan sebagian besar kanker kulit dan kematian sel. Selain itu, kerusakan sel dalam sel HaCaT telah terbukti diinduksi oleh iradiasi UVB [61]. Akibatnya, kami menyelidiki kelangsungan hidup sel sel HaCaT setelah iradiasi UVB dibandingkan dengan pengobatan Q-3-G. Seperti yang ditunjukkan dalam laporan sebelumnya, salah satu faktor utama yang menyebabkan sel, jaringan, dan organ rusak adalah paparan UVB [62,63]. Q-3-G mengembalikan viabilitas sel yang berkurang yang diinduksi oleh iradiasi UVB (Gambar 2b-d). Hasilnya terbukti mirip dengan penelitian sebelumnya tentang efek dan mekanisme pada sitotoksisitas yang diinduksi UVB dalam HaCaT quercetin [64].

Klik dia untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang produk

Beberapa penelitian telah menjelaskan bahwa UVB dapat meningkatkan respons inflamasi yang parah, yang menyebabkan masalah pada kulit [1,2,4,27]. UVB mengaktifkan enzim pro-inflamasi penting seperti COX-2 dan sitokin seperti TNF-α.COX-2 adalah enzim terkait peradangan yang dipicu oleh sitokin dan mediator pro-inflamasi [65], yang merangsang respons inflamasi. Karena COX-2 menghasilkan mediator inflamasi PGE-2, cox-2 menginduksi respons inflamasi [66,67], dan TNF-α adalah sitokin pro-inflamasi utama [68] dalam respons inflamasi. Respons inflamasi ini menyebabkan kerusakan kulit, yang mengakibatkan penuaan kulit [69]. Tingkat ekspresi mRNA enzim inflamasi COX-2 dan sitokin pro-inflamasi TNF-α dihambat oleh Q-3-G (Gambar 2e,). Menurut hasil yang diterbitkan sebelumnya, quercetin juga menurunkan ekspresi gen dan produksi TNF-α[70]. Berkenaan dengan sifat antioksidan, uji pemulungan radikal DPPH dan ABTS adalah metode yang cepat, andal, dan dapat direproduksi untuk mengevaluasi in vitroaktivitas antioksidansenyawa murni dan ekstrak tumbuhan [54] dan telah digunakan secara luas dalam metode umum untuk menyelidiki kegiatan pemulung senyawa alami atau ekstrak [1,46,71,72]. Q-3-G ditemukan untuk mengurangi reaktivitas radikal baik dalam uji maupun flow cytometry dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Hasil ini sesuai dengan studi yang dilaporkan sebelumnya, di mana Q-3-G secara signifikan menghambat pembentukan ROS dalam sel PHEOCHROMOCYToma PC-12 [34]. Selain bertindak secara kimiawi dengan efek antioksidan, kami menunjukkan bahwa Q-3-G meningkatkan tingkat Nrf2, salah satu pengatur penting stres oksidatif dalam sel. Beberapa senyawa atau ekstrak alami telah dilaporkan memiliki sifat antioksidan melalui pensinyalan ARE yang bergantung pada Nrf2 [46,73,74]. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa Q-3-G memiliki aktivitas antioksidan (Gambar 2g-j). Melanosom dari sintesis melanin terjadi pada organel intraseluler [75-77]. Kelebihan produksi melanin dapat mempengaruhi penampilan kulit dan penyakit kulit yang berhubungan dengan hiperpigmentasi. Kami menemukan bahwa pengobatan dengan O-3-G dalam sel B16F10 yang diinduksi cα-MSH menghambat sekresi melanin. Seperti pada karya-karya sebelumnya, melanogenesis intraseluler juga dikendalikan oleh metabolit quercetin dan beberapa quercetin-3-O-β-D-glucopyranosides [24,78,79].

Menjaga kesehatan kulit membutuhkan hidrasi kulit yang memadai, dan NMF dan HA memiliki peran penting dalam proses ini [12]. FLG adalah konstituen dari penghalang kulit, sehingga peningkatan tingkat ekspresi FLG dapat dikaitkan dengan pelembab [80]. Dalam studi kami, Q-3-G ditemukan mempengaruhi aktivitas retensi kelembaban kulit dengan meningkatkan FLG dan TGM-1 (Gambar 3c,d). Tingkat ekspresi FLG dan TGM-1 masing-masing diblokir oleh JNK, IKKα, dan IkBainhibitors (SP600125 dan Bay11-7082). Kami berfokus pada enzim terkait MAPK karena penelitian kami bertujuan untuk menentukan mekanisme molekuler di mana Q-3-Gexerts efek perlindungan kulitnya. JNK memainkan peran penting dalam apoptosis keratinosit yang diinduksi oksidatif-stres [81]. Fosforilasi c-Jun, TAK1, MKK4, dan INK meningkat sebesar Q-3-G. Selain itu, retinol tidak secara signifikan meningkatkan fosforilasi c-Jun, TAK1, MKK4, atau JNK, menunjukkan bahwa ada beberapa perbedaan dalam karakteristik penghambatan antara Q-3-G dan retinol di jalur pensinyalan AP-1. Seperti dalam hasil yang diterbitkan sebelumnya, jalur JNK-c-Jun/AP-1 berkorelasi dengan efek anti-apoptosis dariQuercetin[82]. Dibandingkan dengan penelitian sebelumnya [83], dengan mengatur jalur pensinyalan NF-kB dan AP-1, jalur ini juga ditemukan terlibat dalam mekanisme yang mendasari quercetin. Sejalan dengan mekanisme senyawa induknya, hasil kami menunjukkan bahwa jalur NF-kB juga termasuk dalam efek perlindungan kulit Q-3-Gaby aktivasi p50, p65, IKKα, IkBα, Akt, dan Src setelah perawatan dengan Q-3-G dalam sel HaCaT. Selain itu, Q-3-G mengatur aktivitas Luc dan NF-B-Luc yang dimediasi AP-1 (Gambar 4). Temuan ini menunjukkan bahwa pensinyalan AP-1 dan NF-kB yang dimediasi MAPK berkontribusi pada sifat pelindung kulit yang dimediasi Q-3-G.

4. Bahan dan Metode

4.1. Materi

Q-3-Gwas diperoleh dari Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA). Sel HaCaT, HEK293T, dan B16F10 dibeli dari American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Abts diammonium garam, DPPH, asam askorbat(AA), ABTS, dan retinol dibeli dari Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO, USA). Serum sapi janin (FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), dan phosphate-buffered saline (PBS) dibeli dari Gibco (Grand Island, NY, USA).3-(4-5-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetra-sodium bromide (MTT)dibeli dari Amresco (Brisbane, Australia). Premix TRILzol dan PCR dibeli dari Bio-D Inc. Kit sintesis cDNA dibeli dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, AS). Primer maju dan mundur untuk PCR (reaksi berantai polimerase) disintesis oleh Macrogen, Inc. Semua antibodi yang terkait dengan bentuk fosforilasi atau total protein target dibeli dari Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

4.2.Kultur Sel

Sel HaCaT dan B16F10 dikultur dalam DMEM dengan 10% FBS dan antibiotik 1% (streptomisin dan penisilin). Sel HEK293T dikultur dalam DMEM dengan 5% FBS dan 1% antibiotik. Garis sel ini diinkubasi dalam CO 5%, pada suhu 37°C.

4.3. Tes Viabilitas Sel

Sel B16F10 diunggulkan pada sel 2×10° per sumur dalam pelat 96-sumur selama 24 jam, konsentrasi Q-3-G(0-20 μM) yang berbeda ditambahkan ke dalamnya, dan kemudian mereka diinkubasi selama 48 jam. Sel HaCaT dilapisi dalam pelat 96-sumur, dan sel-sel diunggulkan pada sel 6×10 °/mL. Setelah inkubasi semalam, sel-sel diinkubasi dengan konsentrasi Q-3-G (0-20 μM) yang berbeda selama 24 jam. Sel HEK293T diunggulkan pada 6×10 °sel / mL dalam 96-sumur-pelat selama 24 jam dan kemudian diobati dengan Q-3-G (0-20 μM). Sel yang diinkubasi diperlakukan dengan larutan MTT 10μL/sumur, dan setelah 3 jam diobati dengan 100 μL Larutan Penghentian MTT. Menggunakan uji MTT konvensional untuk viabilitas sel yang diukur [84], absorbansi pada 570 nm diukur menggunakan pembaca (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

4.4.Analisis mRNA oleh RT-PCR Semi-Kuantitatif dan PCR Real-Time Kuantitatif

Sel HaCaT diobati dengan Q-3-G(5-30 μM) atau retinol(10ug/mL) selama 12 jam.RNA diendapkan menggunakan reagen TRI seperti yang dilaporkan sebelumnya [85]. Kit sintesis cDNA digunakan untuk mensintesis DNA komplementer. RT-PCR dilakukan dengan menggunakan primer reverse dan forward tertentu. Primer untuk RT-PCR dan real-time PCR tercantum dalam Tabel 1.

4.5. Uji DPPH

Uji DPPH digunakan untuk menilai kapasitas pemulungan radikal Q-3-G. Metanol digunakan untuk melarutkan DPPHuntuk konsentrasi akhir 250 μM. Kemudian,475 mL DPPHwas

bereaksi dengan5 mL Q-3-G (0-40 μM) atau AA (500 mM) pada37 ° C selama 30 menit. Kontrol positifnya adalah AA. Penentuan efek pemulungan dan perhitungan DPPH dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [86].

4.6.Uji ABTS

Uji ABTS dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [72]. Secara singkat, volume yang sama dari larutan ABTS 7,4 mM dan larutan kalium persulfat 2,4 mM dicampur dan disimpan pada suhu kamar semalaman untuk menghasilkan kation radikal ABTS. Solusi ABTS ditambahkan ke setiap sumur pelat 96-sumur, dengan penambahan Q-3-G (0-40 μM) atau AA (500 mM) per sumur. Campuran diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit, dan kemudian absorbansinya pada 730 nm diukur.

4.7. Uji ROS Seluler oleh Flow Cytometry

Untuk memeriksa pembentukan ROS intraseluler, pewarna sensitif oksidasi,2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA), digunakan. Sel HaCaT terkena UV, dan kemudian sel dipanen dan disuspensikan kembali dengan PBS 300 ul dengan DCFDA 20 μM selama 30 menit pada suhu 37 °C dalam gelap. Sel-sel kemudian dicuci dengan PBS dan fluoresensi diukur pada 485/535 nm oleh Beckman CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

4.8.Analisis Western Blot

Sel HaCaT diunggulkan pada kepadatan sel 6× 10° /mL. Setelah inkubasi semalaman, konsentrasi Q-3-G yang berbeda (0-10 μM) atau retinol (10 μg / mL) ditambahkan dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Persiapan protein dan lisat sel utuh dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [87]. Antibodi spesifik digunakan untuk mendeteksi bentuk total dan bentuk fosfat jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKKα, IkBα, Src, dan Akt, yang divisualisasikan dengan reagen chemiluminescence [88].

4.9. Analisis Konten dan Sekresi Melanin

Sel B16F10 diunggulkan pada kepadatan sel 2×10° / mL menjadi pelat 12 sumur dan diinkubasi dalam semalam. Media kultur diubah untuk media segar yang dilengkapi dengan Q-3-G (10-20 μM) atau arbutin (1 mM). Produksi melanin dirangsang dengan a-MSH (100 nM) selama 48 jam. Untuk uji sekresi melanin, kepadatan optik pada 475 nm diukur. Setelah itu, sel-sel dipanen untuk menentukan tenda kon-tent melanin intraseluler, menggunakan penyangga lisis untuk lisis sel dan membuat peletnya dengan sentrifugasi (12.000 rpm, 5 menit). Pelet sel pekat dilarutkan dalam buffer pelarutan 100 mL (1 M NaOH, 10% DMSO) dan dilebur pada suhu 55 °C. Absorbansi diukur pada 405 nm menggunakan pembaca kerapatan optik [89].

4.10.Iradiasi UVB

Sel HaCaT diunggulkan pada kepadatan 1×105 sel/mL menjadi pelat 6 sumur menggunakan MEM bebas serum dan mengalami kelaparan 24 jam. Sel HaCaT telah diobati sebelumnya dengan G-3-Q selama 30 menit dan kemudian iradiasi UVB. Kemudian, sel-sel HaCaT dicuci dengan PBS dan terkena iradiasi UVB (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Prancis). Energi iradiasi UVB adalah 30 mJ /cm2² 【90】.

4.11.H2O2 Pengobatan

Sel-sel HaCaT diunggulkan menjadi lempeng 6-sumur dan mengalami 24 jam kelaparan US-ing serum-free MEM. Sel-sel diolah sebelumnya dengan konsentrasi Q-3-G yang berbeda (5-10 μM dan setelah 30 menit diinkubasi dengan H2O2 (500 μM) selama 12 jam.

4.12. Luciferase Reporter Gene Assay

Sel HEK293T diunggulkan pada kepadatan sel 3×10°/mL menjadi pelat 24 sumur. Sel HEK293T ditransfer dengan 2 μg plasmid yang mengandung AP-1-Luc atau NF-kB-Luc dan b-galaktosidase, menggunakan polietilina[91]. Setelah 24 jam inkubasi, sel-sel diperlakukan dengan Q-3-G (5-10 μM) atau retinol (10 ug / mL) selama 24 jam lebih lanjut. Uji luciferase dilakukan oleh luminometer pada absorbansi setiap sampel diukur pada 475 nm menggunakan pembaca pelat mikro Spectramax 250 (Perangkat Molekuler, San Jose, CA, AS), seperti yang dilaporkan sebelumnya [92].

4.13. Penembakan Morfologi Sel

Sel HaCaT diunggulkan menjadi pelat 6 sumur dengan kepadatan sel 1× 10° /mL. Sel-sel HaCaT diobati dengan G-3-Q selama 30 menit dan kemudian iradiasi UVB. Setelah foto objektif mikroskop 24 jam,4×, 10×, dan 20× diambil (Olympus, Tokyo, Jepang).

4.14. Analisis Statistik

Semua data disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi dari setidaknya tiga percobaan independen. Tes Mann-Whitney dan uji-t Siswa digunakan untuk membandingkan perbedaan statistik antar kelompok. Nilai p<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Kesimpulan

Penelitian kami menunjukkan bahwa aktivitas antiinflamasi dan antioksidan Q-3-Gexhibited melindungi terhadap faktor-faktor stres oksidatif dan peradangan di bawah iradiasi UVB dan HO, paparan. Kami juga menunjukkan bahwa Q-3-G memiliki kemampuan merangsang pelembab dalam sel HaCaT. Selain efek antimelanogenesis Q-3-G, itu ditunjukkan untuk menghambat sekresi melanin di α-MSH-induced B16F10. Akhirnya, efek Q-3-G dimediasi melalui aktivasi jalur pensinyalan AP-1 dan NF-kB. Aktivitas pelindung kulit Q-3-G dalam sel keratinosit manusia HaCaT dan sel melanoma murine B16F10 dirangkum pada Gambar 5. Studi ini menetapkan bahwa Q-3-G dapat efektif karena sifat anti-inflamasi, antioksidan, pelembab, dan antimelanogenesis dalam sel keratinosit dan melanoma manusia melalui aktivasi jalur NF-kB dan AP-1. Kesimpulannya, hasilnya jelas menunjukkan bahwa metabolit konjugat ini berpotensi melindungi sel-sel kulit. Penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk memvalidasi efek Q-3-G dalam berbagai model in vivo, terutama dalam kaitannya dengan model pelindung kulit.

Referensi

1. Kim, E.; Hwang, K.; Lee, J.; Han, S.Y.; Kim, E.-M.; Taman, J.; Cho, J.Y. Efek perlindungan kulit dari epigallocatechin gallate. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 173. [CrossRef]

2. Draelos, Z.D. Perawatan baru untuk memulihkan gangguan permeabilitas penghalang epidermis: krim perbaikan penghalang kulit. Clin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.T.; Zmijewski, M.A.; Zbytek, B.; Tobin, DJ; Theoharides, T.C.; Rivier, J. Peran kunci CRF dalam sistem respons stres kulit. Endokr. Wahyu 2013, 34, 827–884. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Scott, T. Radiasi UV dan kulit. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 12222–12248. [CrossRef]

5. Rittie, L.; Fisher, GJ UV-induced signal cascades dan penuaan kulit. Res. Res. 2002, 1, 705–720. [CrossRef]

6. Videira, I.F.; Moura, D.F.; Magina, S. Mekanisme mengatur melanogenesis. An. Kuningan. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [CrossRef] [PubMed]

7. Che, D.N.; Xie, G.H.; Cho, B.O.; Shin, J.Y.; Kang, HJ; Jang, S.I. Efek perlindungan ekstrak batang anggur terhadap kerusakan yang disebabkan UVB pada kulit tikus C57BL. J. Photochem. Fotobiol. B 2017, 173, 551–559. [CrossRef]

8. Jeong, D.; Lee, J.; Jeong, S.G.; Hong, Y.H.; Yoo, S.; Han, S.Y.; Kim, J.H.; Kim, S.; Kim, JS; Chung, Y.S.; et al. Artemisia Asiatica etanol ekstrak pameran kegiatan anti-fotoaging. J. Ethnopharmacol. 2018, 220, 57–66. [CrossRef]

9. McDaniel, D.; Farris, P.; Valacchi, G. Penuaan kulit atmosfer-Kontributor, dan inhibitor. J. Cosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [CrossRef]

10. Rao, CV; Sobat, S.; Muhammad, A.; Farooqui, M.; Doescher, M.P.; Asch, A.S.; Yamada, H.Y. Efek biologis dan konsekuensi epidemiologis dari paparan arsenik, dan reagen yang dapat memperbaiki kerusakan arsenik secara in vivo. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Sinha, K.; Das, J.; Sobat, P.B.; Sil, P.C. Stres oksidatif: Jalur apoptosis yang bergantung pada mitokondria dan mitokondria. Lengkungan Toksikol. 2013, 87, 1157–1180. [CrossRef]