Bagian 2: Acteoside Menekan Osteoklastogenesis yang Dimediasi RANKL Dengan Menghambat Induksi C-Fos Dan Jalur NF-KB Dan Melemahkan Produksi ROS

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Pls klik di sini kembali ke Bagian 1

AkteosidaMenghambat Resorpsi Tulang oleh Makrofag Acteoside juga mencegah resorpsi tulang yang diperantarai RANKL dengan cara yang bergantung pada dosis, sebagaimana diukur dengan sistem model in vitro (Gbr. 3A). Resorpsi tulang secara signifikan dihambat ketika BMM diinkubasi dengan 1 mM acteoside (Gbr. 3B). Perlakuan akteosida 10 mM hampir sepenuhnya melemahkan pembentukan lubang yang diinduksi RANKL oleh BMM. Demikian pula, acteoside menurunkan resorpsi tulang dalam sel RAW264.7 yang dirangsang oleh RANKL (Gbr. S2A dan B). Kemampuan acteoside untuk menghambat resorpsi tulang tergantung pada waktu pengobatan relatif terhadap stimulasi RANKL. Acteoside (10 mM) ditambahkan 4 hari setelah stimulasi RANKL tidak mengurangi pembentukan lubang di BMM, sedangkan itu menekan jumlah osteoklas yang terbentuk (Gbr. 3C). Hasil yang berbeda ini sebagian disebabkan oleh area pit yang sudah terbentuk setelah 4 hari pembentukan stimulasi RANKL (Gbr. 3D).

EKSTRAK CISTANCHE

AkteosidaMenurunkan Regulasi Jalur Pensinyalan RANKL Awal

RANKL menginduksi aktivasi 3 MAPK dan NF-kB yang terkenal dalam prekursor osteoklas, dan aktivasi ini diperlukan untuk diferensiasi awal osteoklas. Untuk memahami kemungkinan mekanisme yangakteosidamenghambat osteoklastogenesis, kami menyelidiki efek dariakteosidapada MAPK dan aktivasi NF-kB di makrofag. Sel BMM dan RAW264.7 diberi perlakuan awal dengan 10 mM acteoside selama 2 jam dan kemudian distimulasi dengan 100 ng/ml RANKL selama 30 menit. Fosforilasi MAPK diperiksa dengan Western blotting dan analisis imunometri. RANKL menginduksi fosforilasi p38, ERK, dan JNK dalam sel BMM (Gbr. 4A) dan RAW264.7 (Gbr. 4B). Acteoside mencegah peningkatan p-p38, p-ERK, dan p-JNK yang diinduksi RANKL ini. Hasil ini didukung oleh analisis imunometrik, yang pra-perawatan dengan 10 mM acteoside secara signifikan menghambat tingkat MAPK terfosforilasi dalam makrofag ini (Gbr. 4C). Perlakuan RANKL meningkatkan pengikatan DNA dari NF-kB, sedangkan acteoside menghambat aktivasi pengikatan NF-kB-DNA yang diinduksi oleh RANKL (Gbr. 5A). Penghambatan ini lebih menonjol di BMM daripada di sel RAW264.7. Acteoside juga mengurangi fosforilasi p65 dan IkBa yang dirangsang oleh RANKL dalam sel BMM dan RAW264.7 (Gbr. 5B dan C). Menambahkan 10 mM acteoside hampir sepenuhnya menghambat degradasi dan aktivasi IkBa di BMM (Gbr. 5B). Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut bahwa aktivasi NF-kB terlibat dalam aksi acteoside, konstruksi promotor-luciferase kB ditransfusikan secara sementara ke dalam sel RAW264.7. Sel-sel yang diinkubasi dengan 100 ng/ml RANKL memiliki 3-aktivitas promotor kB lipat lebih tinggi, yang secara signifikan dilemahkan oleh 10 mM acteoside (Gbr. 5D).

AkteosidaMenekan Produksi Sitokin Inflamasi dan Ekspresi TNF-a, c-Fos, dan NFATc1 dalam Makrofag Terstimulasi RANKL TNF-a, IL-1b, dan IL-6 penting dalam pembentukan osteoklas dan fungsi, yang dimediasi oleh pensinyalan NF-kB dalam makrofag yang distimulasi RANKL. RANKL merangsang produksi sitokin-sitokin ini, dan produksi ini berkurang secara nyata sebesar 10 mM sebelum perlakuan akteosida dalam BMM (Gbr. 6A). Demikian pula, acteoside melemahkan produksi sitokin yang diinduksi RANKL, kecuali IL-6, dalam makrofag RAW264.7 (Gbr. S3). Untuk memahami mekanisme molekuler aksi akteosida dalam osteoklastogenesis, kami meneliti lebih lanjut efek akteosida pada ekspresi TNF-a, c-Fos, dan NFATc1. RANKL mengatur ekspresi mRNA dari faktor-faktor ini dalam sel BMM dan RAW264.7 (Gbr. 6B dan C). Pretreatment dengan 10 mM acteoside secara signifikan menghambat ekspresi yang diinduksi RANKL dari faktor-faktor ini di keduanya

Sel BMM dan RAW264.7. Pretreatment acteoside juga sangat mengurangi tingkat protein c-Fos dan NFATc1 dalam BMM yang dirangsang RANKL (Gbr. 6D). Hasil ini menunjukkan bahwa acteoside down-regulates RANKL menginduksi mediator pembentukan osteoklas pada tingkat gen dan protein.

EKSTRAK CISTANCHE: ACTEOSIDE

Acteoside Mengurangi Generasi ROS Intraseluler dalam BMM dengan Cara yang Tergantung Dosis

Karena diketahui bahwa produksi ROS intraseluler berkorelasi dengan osteoklastogenesis terstimulasi RANKL, kami menyelidiki apakah acteoside menghambat produksi ROS selama diferensiasi osteoklas yang dimediasi RANKL menggunakan pewarna sensitif oksidasi yang permeabel, DCFH-DA. Analisis flow cytometry menunjukkan bahwa sinyal fluoresensi rata-rata spesifik untuk DCF di BMM tampaknya bergeser ke kanan setelah stimulasi dengan RANKL, dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati (Gbr. 7A). Pergeseran ini mirip dengan kasus dimana makrofag RAW264.7 diamati setelah stimulasi RANKL (data tidak ditampilkan). Mengobati BMM dengan acteoside mengurangi intensitas sinyal DCF dengan cara yang bergantung pada dosis. Pretreatment dengan 10 mM acteoside hampir sepenuhnya mengurangi tingkat ROS intraseluler yang dihasilkan selama diferensiasi osteoklas ke tingkat kontrol yang tidak diobati (Gbr. 7B).

Pemberian Acteoside Oral Menghambat Perubahan Penanda Biokimia Osteoporosis dan Pengeroposan Tulang pada Tikus Ovariektomi

Untuk mengeksplorasi efek akteosida pada pengeroposan tulang, kami menyiapkan model hewan osteoporosis dengan ovariektomi. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat badan antara tikus OVX dan Sham selama periode percobaan (data tidak ditampilkan). Kelompok OVX memiliki kadar serum IL-1b dan IL-6 yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok Sham (Gbr. 8). Peningkatan sitokin inflamasi yang diinduksi ovariektomi ini dilemahkan oleh pemberian akteosida oral (kelompok AC). Kadar serum penanda bone turnover seperti ALP, kalsium, TRAP5b, dan OC meningkat secara signifikan pada kelompok OVX. Dari penanda osteoporosis ini, peningkatan kadar kalsium, TRAP5b, dan OC pada tikus OVX tampaknya dihambat oleh pengobatan acteoside, sedangkan kadar serum ALP tidak diubah oleh pengobatan. Rata-rata beban fraktur maksimum ke tengah poros femoralis kanan secara signifikan lebih rendah pada kelompok OVX dibandingkan pada kelompok Sham (Gbr. 9A). Pengobatan acteoside mengangkat fraktur maksimum kembali ke kelompok Sham. Ketika tulang kortikal femur dibedah dan diamati dengan mikroskop optik, fitur osteoporosis yang ditunjukkan pada kelompok OVX hampir sepenuhnya menghilang pada tikus AC (Gbr. 9B). Untuk memverifikasi efek acteoside pada model osteoporosis yang diinduksi OVX, parameter BMD dan morfologi tulang dalam trabekular femur proksimal ringan dianalisis dengan mikro-CT. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 9C, perubahan arsitektur trabekular femoralis ditemukan pada tikus OVX, sedangkan perubahan ini berkurang dengan pengobatan dengan acteoside. Hasil dari analisis mikro-CT mengungkapkan bahwa BMD, ukuran kekuatan tulang, secara dramatis berkurang pada tikus OVX (Gbr. 9D). Dibandingkan dengan kelompok Sham, tikus OVX juga menunjukkan perubahan signifikan pada BV/TV, Tb. Sp, dan Tb. N, tapi tidak di Tb.Th. Pengobatan acteoside oral tikus OVX secara signifikan mencegah perubahan BMD serta BV/TV dan Tb.N.

Acteoside tidak Mempengaruhi Osteoblastogenesis di Sel Sumsum Tulang

Peran acteoside pada diferensiasi osteoblastik diselidiki lebih lanjut menggunakan sel-sel sumsum tulang. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 10A, pengobatan DAG meningkatkan jumlah alizarin sel bernoda merah dan ini tidak berubah dengan 10 mM acteoside pretreatment. Jumlah pewarna yang ada menunjukkan bahwa kombinasi akteosida danPerlakuan DAG tidak mengubah mineralisasi (Gbr. 10B). Demikian pula, peningkatan yang diinduksi DAG dalam kandungan kalsium intraseluler (Gbr. 10C) dan level mRNA (Gbr. 10D) dari penanda spesifik tulang, seperti Runx2, osterix, BSP, dan OC, tidak terpengaruh oleh perlakuan awal dengan acteoside.

efek cistanche acteoside

Diskusi

Remodeling tulang diatur secara ketat oleh keseimbangan antara pembentukan tulang oleh osteoblas dan resorpsi tulang oleh osteoklas. Resorpsi tulang yang berkepanjangan dan berlebihan menyebabkan ketidakseimbangan pergantian tulang, yang mengakibatkan penyakit resorptif tulang. Untuk mengeksplorasi efek acteoside pada osteoklastogenesis, kami menggunakan dua makrofag, sel BMM yang dikultur primer dan sel RAW264.7.

Sel-sel ini dirangsang dengan RANKL untuk berdiferensiasi menjadi osteoklas dengan adanya dan tidak adanya akteosida. Kami menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa acteoside menghambat diferensiasi dan pembentukan osteoklas. Acteoside sendiri pada konsentrasi yang diperiksa tidak menyebabkan penurunan viabilitas makrofag kultur primer baik dalam kondisi pertumbuhan maupun diferensiasi.

Pengobatan acteoside juga menurunkan aktivitas resorpsi osteoklas dewasa. Hasil ini menunjukkan bahwa acteoside menekan pembentukan osteoklastik dari makrofag dan aktivitas resorpsi osteoklas. Hasil dari sistem kultur kami, yang tidak termasuk osteoblas atau sel stroma, juga menyarankan bahwa acteoside mencegah pembentukan osteoklas dengan secara langsung bekerja pada prekursor osteoklas.

RANKL mengaktifkan MAPK termasuk p38, ERK, dan JNK. Ketiga kinase ini terlibat dalam diferensiasi osteoklastik awal dan dengan demikian penghambatannya secara farmakologis atau dengan transfeksi JNK dominan-negatif menekan osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL [29]. Hasil kami mengungkapkan bahwa pretreatment acteoside menghambat semua kinase ini, menunjukkan regulasi MAPK yang tidak spesifik. Hasil ini sebagian berbeda dari laporan sebelumnya bahwa EGCG, senyawa anti-inflamasi utama dalam tee hijau, secara spesifik melemahkan aktivasi JNK tanpa mempengaruhi ERK atau aktivasi p38 pada BMM yang distimulasi RANKL [7]. Paeonol, senyawa anti-inflamasi yang berasal dari ramuan Cina, juga telah dilaporkan menghambat ERK dan p38, tetapi tidak JNK, fosforilasi dalam sel RAW264.7 yang dirangsang oleh RANKL [30]. Sebaliknya, silibinin, penghambat baru dalam tulang, melemahkan aktivasi p38, ERK, dan JNK yang diinduksi RANKL [31]. Temuan ini menunjukkan bahwa efek senyawa anti-resorptif pada aktivasi MAPK oleh RANKL bergantung pada senyawa tersebut, meskipun ketiga MAPK terlibat dalam osteoklastogenesis awal.

Mempertimbangkan pengamatan bahwa acteoside melemahkan p-JNK

tingkat dalam BMM terstimulasi RANKL, bahkan pada 1 mM, penyumbatan JNK daripada p38 MAPK atau ERK tampaknya merupakan peristiwa yang lebih spesifik dalam anti-osteoklastogenesis yang dimediasi oleh acteoside dalam sel. Meskipun acteoside pada konsentrasi yang sama tidak mengurangi jumlah osteoklas dalam BMM, ada penurunan yang signifikan dalam pembentukan pit dengan pengobatan acteoside. Kami juga menemukan bahwa pra-perawatan dengan SP600125, penghambat farmakologis spesifik untuk JNK, secara dramatis mencegah pembentukan osteoklas (data tidak ditampilkan). Secara kolektif, temuan ini menyarankan bahwa pensinyalan yang dimediasi JNK terkait erat dengan penekanan osteoklastogenesis yang dimediasi oleh acteoside yang dirangsang oleh RANKL.

Pensinyalan NF-kB mengatur peristiwa seluler, termasuk apoptosis, perkembangan siklus sel, adhesi sel, produksi sitokin, dan kelangsungan hidup dalam makrofag [32]. Pensinyalan NF-kB juga diperlukan untuk perkembangan osteoklas, yang telah ditunjukkan oleh munculnya osteopetrosis pada tikus-tikus kecil NF-kB-knockout [33,34]. Oleh karena itu, penghambatan NF-kB diusulkan menjadi target efektif untuk agen anti-resorptif untuk menurunkan regulasi aktivitas osteoklas dan mengobati osteoporosis. Modifikasi pasca-translasi protein subfamili NF-kB sangat penting dalam memodulasi aktivitas NF-kB. Khususnya, fosforilasi subunit p65 dan IkB kinase sangat penting bagi NF-kB untuk menginduksi osteoklastogenesis [7]. Temuan kami saat ini menunjukkan bahwa stimulasi RANKL meningkatkan aktivitas pengikatan DNA NF-kB dan fosforilasi subunit p65 dan IkBa di kedua sel BMM dan RAW264.7. Pretreatment dengan acteoside menghambat peningkatan yang diinduksi RANKL ini, menghasilkan aktivitas NF-kB yang diatur ke bawah. Akibatnya, hasil ini menyarankan bahwa, selain MAPK, pensinyalan NF-kB adalah target utama akteosida dalam menghambat diferensiasi dan pembentukan osteoklas dari makrofag yang distimulasi RANKL.

Selain pensinyalan NF-kB, jalur c-Fos/c-Jun/NFATc1 memainkan peran kunci dalam perkembangan osteoklas, dengan demikian kekurangan salah satu dari protein ini dapat menahan osteoklastogenesis [35,36]. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa acteoside mencegah ekspresi c-Fos dan NFATc1 yang diinduksi RANKL pada tingkat mRNA dan protein. JNK adalah upstream kinase dari c-Jun, yang diperlukan untuk ekspresi NFATc1 dan osteoklastogenesis sebagai respons terhadap RANKL [29].

Memblokir jalur JNK/c-Jun dengan penghambat rongsokan mengurangi pembentukan osteoklas yang diinduksi RANKL dan ekspresi c-Fos dan NFATc1 [7]. Hasil kami dan temuan sebelumnya menunjukkan bahwa menghambat pensinyalan yang dimediasi JNK oleh acteoside terkait erat dengan mencegah c-Fos dan NFATc1 yang dimediasi RANKLekspresi, yang menekan diferensiasi osteoklas dalam makrofag. Perbedaan efek acteoside pada sel BMM dan RAW264.7 setidaknya sebagian karena perbedaan sensitivitas terhadap penghambatan JNK.

TNF-a dapat menginduksi osteoklastogenesis independen dari pensinyalan RANKL-RANK [37]. IL-1 adalah mediator poten dari destruksi tulang patologis yang diinduksi oleh defisiensi estrogen atau inflamasi [7]. Mengganggu reseptor tipe I IL-1 atau pensinyalan IL-1 dapat membalikkan kehilangan tulang yang disebabkan oleh ovariektomi [38] atau rheumatoid arthritis [39]. Studi ini menunjukkan kemampuan acteoside untuk mengurangi produksi sitokin inflamasi seperti TNF-a, IL- 1b, dan IL-6 dalam makrofag. Acteoside diperkirakan menghambat produksi sitokin inflamasi dengan menekan p38 kinase dan sinyal ERK, karena mengaktifkan ERK1/2, p38 MAPK, atau keduanya diperlukan untuk produksi lipopolisakarida yang diinduksi sitokin ini dalam makrofag [40,41]. Luteolin, senyawa inflamasi, juga telah dilaporkan menekan produksi mediator inflamasi dengan menghambat aktivasi p38 MAPK [42]. Dalam penelitian ini, kami juga menemukan bahwa acteoside melemahkan pengeroposan tulang pada tikus yang diovariektomi, sebagaimana dibuktikan oleh kekuatan fraktur maksimum yang dipulihkan pada poros tengah femur kanan dan hilangnya tulang kortikal osteoporosis. Pemberian akteosida oral menurunkan regulasi peningkatan kadar serum IL-1b dan IL-6 yang diinduksi ovariektomi, tetapi tidak pada ALP. Peningkatan kadar serum kalsium, TRAP dan OC di OVX juga dihambat oleh pengobatan oral dengan acteoside, menunjukkan bahwa acteoside melemahkan perubahan biomarker khusus untuk pembentukan tulang serta resorpsi. Karena osteoporosis ditandai dengan berkurangnya kepadatan massa dan memburuknya arsitektur mikro tulang trabekular, kehilangan tulang trabekular yang diinduksi OVX dan perubahan parameter morfometrik secara signifikan dihambat oleh pemberian akteosida oral. Temuan ini menyarankan bahwa acteoside dapat digunakan sebagai agen anti-resorptif untuk mengobati osteoporosis dengan membalikkan aktivasi osteoklas yang tidak seimbang. Namun, osteoblas adalah faktor utama yang bertanggung jawab untuk pembentukan tulang baru. Dengan demikian diperlukan suatu agen yang mampu meningkatkan proliferasi atau diferensiasi osteoblas untuk meningkatkan pembentukan tulang [30]. Sebaliknya, kami menemukan bahwa acteoside tidak mempengaruhi diferensiasi atau mineralisasi osteoblas dalam sel sumsum tulang yang diobati dengan DAG. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa acteoside memiliki efek anti-resorpsi tetapi tidak secara langsung mempengaruhi pembentukan tulang. Eksperimen yang lebih rinci menganalisis parameter spesifik tulang in vivo dan in vitro diperlukan untuk mengklarifikasi apakah acteoside menguntungkan osteoblastogenesis atau tidak.

Penelitian ini menyoroti efek penghambatan acteoside pada diferensiasi osteoklas dan resorpsi tulang dengan menekan MAPK dan beberapa faktor transkripsi seperti NF-kB, c-Fos, dan NFATc1. Data menunjukkan dua kemungkinan mekanisme dimana acteoside memiliki manfaat ini.

CISTANCHE ECHINACOSIDE DAN ACTEOSIDE DAPAT Mengobati osteoporosis

Referensi

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimunologi: interaksi sistem kekebalan dan kerangka. Molekul dan Sel 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Tulang dan sumsum tulang: organ yang sama. Arsip Biokimia Biofisika 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporosis: sekarang dan masa depan. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Metastasis tulang pada kanker prostat: strategi terapi yang muncul. Ulasan Alam Onkologi Klinis 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Penemuan, obat-obatan, dan kelainan tulang. Ulasan Alam Penemuan Obat 1: 784-796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Pendekatan terapeutik untuk penyakit tulang. Sains 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, dkk. (2010) Epigallocatechin-3- gallate menghambat osteoklastogenesis dengan menurunkan regulasi ekspresi c-Fos dan menekan sinyal faktor-kappaB nuklir. Farmakologi Molekuler 77: 17– 25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, dkk. (2012) MS-275, penghambat benzamide histone deacetylase, mencegah osteoklastogenesis dengan menurunkan ekspresi c-Fos dan menekan pengeroposan tulang pada tikus kecil. Jurnal Farmakologi Eropa 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Efek anti-osteoporosis Yijung-tang dalam model tikus ovariektomi yang dimediasi oleh penghambatan diferensiasi osteoklas. Jurnal Etnofarmakologi 146: 83-89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Minyak ikan menekan resorpsi tulang dengan menghambat osteoklastogenesis melalui penurunan ekspresi M-CSF, PU.1, MITF dan RANK pada tikus yang diovariektomi. Laporan Kedokteran Molekuler 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklas: multinuklear, asal hematopoietik, sel osteoimun penyerap tulang. Jurnal Biokimia Seluler 102: 1130– 1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Mekanisme pengaturan osteoklastogenesis oleh sinyal RANKL dan Wnt. Perbatasan dalam Bioscience 16: 21–30.