Bagian 1: Farmakologi Jaringan Terintegrasi Dan Model Ikan Zebra Untuk Menyelidiki Komponen Efek Ganda Cistanche Tubulosa Untuk Mengobati Penyakit Osteoporosis Dan Alzheimer
Mar 30, 2022
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * dan Fei Li 1, 2, *
ABSTRAK
Relevansi etnofarmakologi:Osteoporosis (OP) dan penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit bersamaan geriatri umum, dan banyak penelitian menunjukkan hubungan patogenesis mereka. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) adalah obat tradisional Cina yang banyak digunakan dan telah diterapkan secara luas untuk mengobati OP dan AD, masing-masing. Namun, bahan aktif untuk kedua penyakit bersamaan secara bersamaan dan mekanisme yang mendasarinya terbatas.
Tujuan studi:Pekerjaan ini bertujuan untuk membangun metode penyaringan jaringan yang efektif dan andal untuk menemukan senyawa efek ganda di CT yang dapat melindungi AD dan OP secara bersamaan. Dan itu akan memberikan perspektif baru tentang hubungan antara OP dan AD pada mekanisme molekuler.
Bahan dan metode:Efek ganda CT dianalisis secara sistematis dengan mengintegrasikan beberapa database dan analisis ekstensif pada tingkat farmakologi jaringan. Jaringan interaksi obat-target rahasia dibangun untuk mengungkapkan perbedaan efek antara berbagai jenis senyawa. Untuk membuktikan keefektifan jaringan ini, beberapa senyawa dipilih untuk diverifikasi dalam model OP pra-induksi dan model AD ikan zebra yang diinduksi AlCl3-sesuai dengan parameter topologi.
Kata kunci:Farmakologi Jaringan; Osteoporosis;penyakit alzheimer; Cistanche tubulosa; ikan zebra.
Cistanche memiliki fungsi anti-Alzheimer.
1. Perkenalan
Kecenderungan penduduk yang menua mengakibatkan peningkatan prevalensi osteoporosis (OP) dan penyakit Alzheimer (AD) dari tahun ke tahun (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Saat ini OP dan AD telah diakui sebagai ancaman utama bagi kesehatan masyarakat karena dapat berkembang tanpa gejala dan membawa beban sosial yang besar (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Sebagai penyakit yang berkaitan dengan usia, mereka sering terlihat terjadi bersamaan dalam praktik klinis dengan tingkat kecacatan dan kematian yang tinggi (Dengler-Crish dan Elefteriou, 2019). OP adalah penyakit tulang sistemik yang ditandai dengan massa tulang yang rendah dan gangguan mikro-arsitektur jaringan tulang, dengan peningkatan kerapuhan tulang dan peningkatan risiko patah tulang (Rizzoli, 2018). AD adalah degenerasi otak paling umum yang ditandai dengan hilangnya memori dan fungsi kognitif lainnya secara progresif (Bondi et al., 2017). Sampai saat ini, masih belum ada pilihan yang cukup kuat untuk mencegah atau menyembuhkan kedua penyakit yang etiologi dan patogenesisnya kompleks. Dan yang lebih parah adalah pasien lebih sering mengalami efek samping (Brown, 2017; Huang dan Mucke, 2012).
Atas dasar teori diferensiasi sindrom (Sucher, 2013), obat-obatan tradisional Tiongkok (TCM) dengan beberapa komponen yang menargetkan lebih dari satu mekanisme patofisiologis memiliki keunggulan unik dalam pengobatan beberapa penyakit kompleks yang sudah dikenal. Sebagai ramuan tonik ginjal, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) banyak digunakan untuk melawan kehilangan memori dan kelemahan atrofi tulang oleh dokter tradisional Tiongkok (Fu et al., 2018). Selain khasiat tradisionalnya, banyak penelitian menunjukkan bahwa ia memiliki berbagai aktivitas farmakologis, seperti memperbaiki defisit kognitif dan perilaku (Wu et al., 2014), anti-inflamasi (Fu et al., 2018), mempromosikan pembentukan tulang, dan menekan tulang. resorpsi (Li et al., 2013; Li et al., 2012), serta aktivitas antioksidan (Zhang et al., 2016). Tetapi kerumitan bahan aktif dan proses metabolismenya menimbulkan kesulitan dalam mengeksplorasi target dalam jaringan manusia dan menjelaskan mekanisme kerjanya.
Di atas segalanya, diskusi yang andal tentang target terapi OP/AD diperlukan. Terutama berdasarkan pemikiran "pengobatan yang sama untuk penyakit yang berbeda" di TCM, dan metodologi "terapi multi-komponen, jaringan biologis" farmakologi dalam jaringan, upaya untuk mencari target umum yang signifikan antara kedua penyakit mungkin memiliki tujuan yang sangat praktis. artinya dalam memberikan bimbingan untuk pencegahan dan pengendalian OP dan AD. Zebrafish memiliki kesamaan yang kuat dalam fisiologi kerangka mereka dengan mamalia dan gen yang sangat homolog dengan manusia. Ini adalah model hewan yang tersedia dan menarik in vivo untuk penelitian OP dan AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Dengan demikian, penelitian farmakologi jaringan ini ditujukan untuk menyaring konstituen aktif CT dengan efek ganda, mengeksplorasi target potensial umum dari OP dan AD, serta mengungkap kemungkinan penggunaan CT untuk mengobati dua penyakit secara bersamaan. Dalam penelitian ini, informasi target bahan aktif CT, genom, dan informasi proteomik OP dan AD masing-masing dikumpulkan dari database yang berbeda untuk membangun jaringan interaktif, dan analisis pengayaan dibangun untuk menemukan mekanisme sinergis CT untuk mengobati OP dan AD . Selanjutnya, kami masing-masing menginduksi model ikan zebra OP dan AD, dan menangkap senyawa kunci dalam jaringan untuk memverifikasi kemanjuran dan targetnya untuk dua penyakit.
Cistanche meningkatkan pertumbuhan sclerotin.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1 Reagen
Standar kimia genistein (GE), quercetin (QU), asam abietic (AA), -sitosterol (BSS) (kemurnian Lebih besar atau sama dengan 98 persen ) dibeli dari Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Pelat kultur diperoleh dari Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, China). Prednisolon (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O dibeli dari Aladdin Reagent Inc. Zebrafish alkaline phosphatase (ALP), tartrat-resistant acid phosphatase (TRAP), acetylcholinesterase (AChE), dan choline kit acetyltransferase (ChAT) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dipasok oleh Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Trizol diperoleh dari Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, Tiongkok). Transtar Top Green qPCR SuperMix dibeli dari TransGen Biotech. Co., Ltd. (Beijing, Tiongkok).
ekstrak cistanche
2.2 Hewan
Ikan zebra dewasa (strain AB, 4 bulan) dipelihara pada suhu 28 derajat di bawah siklus terang/gelap 14/10 jam di akuarium yang dilengkapi dengan pertukaran air tawar. Mereka dipelihara dua kali sehari dengan pakan udang air asin yang baru menetas (Chen et al., 2018). Embrio yang dibuahi secara normal dipilih dan dibiakkan hingga 3 hari setelah pembuahan (dpf) dalam inkubator pertumbuhan ringan. Semua hewan percobaan telah sesuai dengan pedoman dari lembaga dan pemerintah untuk hewan percobaan.
2.3 Proses Farmakologi Jaringan
2.3.1 Perhitungan Ruang Kimia dan Penapisan Senyawa Kandidat
Semua data bahan kimia CT dikumpulkan dari Basis Data Farmakologi dan Platform Analisis Sistem Pengobatan Tradisional Tiongkok. TCMSP adalah platform sistem farmakologi obat herbal Cina yang menangkap hubungan antara obat, target, dan penyakit (Ru et al., 2014). Sementara itu, empat parameter penting terkait farmakologi dalam TCMSP diperoleh untuk analisis komponen utama (PCA), termasuk berat molekul (MW), koefisien partisi antara oktanol dan air (AlogP), jumlah donor hidrogen (Hdon), dan jumlah akseptor hidrogen ( Hacc). Distribusi kimia CT dibangun dengan parameter di atas menggunakan perangkat lunak SIMCA (Versi 14.1, Umetrics). Dan obat molekul kecil yang disetujui untuk AD/OP dari DrugBank diproses dalam kursus yang sama. Bahan dari CT disaring oleh drug-likeness (DL). DL adalah konsep kualitatif yang digunakan dalam desain obat untuk memperkirakan seberapa "seperti obat" suatu senyawa prospektif. Sifat vital ini digunakan sebagai kriteria seleksi untuk senyawa "seperti obat" dalam ramuan tradisional Cina dan membantu mengoptimalkan sifat farmakokinetik dan farmasi (Tao et al., 2013). Berdasarkan saran dalam literatur dan TCMSP, kami memilih DL Lebih besar dari atau sama dengan 0.18 sebagai kondisi filter. Bahan-bahan yang sesuai dengan kondisi diekspor untuk analisis selanjutnya. Struktur 2-dimensi (2D) dan 3D mereka dilukis oleh perangkat lunak ChemDraw Professional 16.0. Dan struktur 3D dioptimalkan dengan fungsi meminimalkan energi di Chem3D 16.0.
2.3.2 Pengumpulan Target Terkait OP dan AD
Semua asosiasi gen untuk OP dan AD dikumpulkan secara independen dari DisGeNET dan GeneCards. Basis data DisGeNET adalah salah satu platform penemuan gen dan varian terbesar yang tersedia untuk umum yang terkait dengan penyakit manusia (Pinero et al., 2017). GeneCards adalah database terintegrasi dari gen manusia yang mencakup informasi genomik, transkriptomik, proteomik, genetik, klinis, dan fungsional (Safran et al., 2010).
2.3.3 Pengumpulan Target Majemuk dan Prediksi Docking Terbalik
Database GeneCards dan database Swiss TargetPrediction digabungkan untuk memprediksi target bahan aktif yang relevan di CT. GeneCards menunjukkan target aktif senyawa yang diketahui, sedangkan database Swiss TargetPrediction dapat memperkirakan target makromolekul yang paling mungkin dari molekul kecil (Daina et al., 2019). Sebelum prediksi, struktur calon molekul diubah dari format mol2 ke format SMILES dengan menggunakan Open Babel (Versi 2.4.1).
2.3.4 Analisis Interaksi Protein-protein
Database STRING diterapkan untuk menemukan interaksi di antara sekelompok target bersama CT-OP-AD. Setelah mencari di bawah pola "Homo sapiens", jaringan interaksi protein-protein (PPI) divisualisasikan oleh perangkat lunak Cytoscape (Versi 3.7.2). STRING adalah database PPI yang diketahui dan diprediksi, berasal dari prediksi konteks genomik, eksperimen lab throughput tinggi, ekspresi bersama (dilestarikan), penambangan teks otomatis, dan pengetahuan sebelumnya dalam database (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche baik untuk penyakit Alzheimer.
2.3.5 Analisis Pengayaan Jalur GO dan KEGG
Analisis pengayaan Gene Ontology (GO) dilakukan pada perangkat lunak Funrich. FunRich (Versi 3.1.3) adalah perangkat lunak fungsional yang digunakan terutama untuk analisis pengayaan gen dan protein (Pathan et al., 2015). Database manusia ConsensusPathDB digunakan untuk melakukan analisis pengayaan jalur. Daftar gen yang diperoleh dikirimkan ke database dengan pengaturan "p-value cutoff" sebagai 0,01. Setelah mendapatkan hasil, hanya jalur-jalur yang terkait dengan OP dan/atau AD ini yang dipilih dan dibagi ke dalam kelompok-kelompok sesuai dengan kategori fungsi KEGG. CPDB adalah jaringan interaksi tanpa batas yang mengandung interaksi protein-protein biner dan kompleks, genetik, metabolisme, pensinyalan, regulasi gen, dan target obat, serta jalur biokimia di Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Prosedur Eksperimental untuk Model Ikan Zebra OP
2.4.1 Pengelompokan Model
Larva ikan zebra dibagi menjadi beberapa kelompok: kelompok kontrol, kelompok model, kelompok model plus Ed, kelompok model plus senyawa yang masing-masing berisi 30 larva. Kelompok kontrol dipertahankan dalam medium dengan 0,2 persen DMSO. Kelompok model diperlakukan dengan Pre (25 M) dari 3 dpf hingga 8 dpf. Model ditambah kelompok Ed diberi perlakuan bersama dengan Pre dan Ed (30 g/mL).
2.4.2 Pewarnaan Alizarin Merah
Setelah 5 hari kultur dengan senyawa yang berbeda, larva dibius, difiksasi, dan diputihkan secara bergantian. Alizarin red digunakan untuk menodai tulang kepala ikan zebra. 1 persen KOH dan gliserol (rasio 3:1, 1:1 dan 1:3) diterapkan masing-masing untuk menghilangkan kelebihan. Akhirnya, mikroskop stereo (Olympus SZX16) digunakan untuk menangkap gambar pewarnaan ikan zebra di bawah posisi tengkurap. Area pewarnaan dan kepadatan optik terintegrasi (IOD) dihitung dengan Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 Penentuan Aktivitas ALP dan TRAP
Larva ikan zebra pada 3 dpf disubkultur di 6-piring sumur dan diinkubasi dengan Pre dengan ada atau tidak adanya senyawa selama 5 hari. Kemudian dikumpulkan untuk mengukur aktivitas ALP. Aktivitas ALP ditentukan dengan menggunakan kit ELISA ALP ikan zebra berdasarkan protokol pabrikan. Metode untuk mengevaluasi aktivitas TRAP sama dengan ALP.
2.5 Prosedur Eksperimen Model Ikan Zebra AD
2.5.1 Pengelompokan Model
Larva ikan zebra dibagi menjadi beberapa kelompok: kelompok kontrol, kelompok model, kelompok model plus DPZ, kelompok model plus senyawa yang masing-masing berisi 30 larva. Kelompok kontrol dipertahankan dalam medium dengan 0,2 persen DMSO. Kelompok model diperlakukan dengan AlCl3 (150 M, pH 5,8) dari 3 dpf hingga 6 dpf. Model ditambah kelompok DPZ diberi perlakuan bersama dengan AlCl3 dan DPZ (8 M).
2.5.2 Analisis Perilaku
Setelah 3 hari pemberian obat, pergerakan larva dicatat oleh penganalisis perilaku ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Semua percobaan diselesaikan dalam 60 menit pada 28˚C, mengandung 3 siklus fase terang/gelap (masing-masing 10 menit untuk terang dan gelap). Menurut metode dalam laporan sebelumnya, kecepatan rata-rata (AS), perubahan kecepatan (∆S), tingkat pemulihan diskinesia (DRR, persamaan a), dan efisiensi respons (RE, persamaan b) dipilih sebagai efisiensi obat anti-AD indeks evaluasi dalam model ini (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/dtk)=D / T, DRR ( persen )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
di mana D adalah jarak pergerakan ikan zebra selama 60 menit, T adalah waktu percobaan.
RE ( persen )=100 × (∆SDrug - SModel) / (∆SControl - SModel), b
di mana S adalah perubahan kecepatan ikan zebra dalam siklus terang/gelap.
2.5.3 Pengukuran Aktivitas AChE dan Chat
Larva ikan zebra pada 3 dpf disubkultur di 6-piring sumur dan diinkubasi dengan AlCl3 dengan ada atau tidak adanya senyawa selama 3 hari. Kemudian dikumpulkan untuk kegiatan AChE. Aktivitas AChE dideteksi dengan menggunakan kit AChE ELISA ikan zebra berdasarkan protokol pabrikan. Metode untuk mengevaluasi aktivitas ChAT sama dengan AChE.
2.6 Analisis PCR Real-Time Kuantitatif
Larva ikan zebra dibagi menjadi kelompok OP dan AD. Kelompok OP terdiri dari kelompok kontrol, kelompok Pre, dan kelompok senyawa Pre plus, dikultur dari 3 dpf hingga 8 dpf. Kelompok AD termasuk kelompok kontrol, kelompok AlCl3, dan kelompok senyawa AlCl3 plus, dikultur dari 3 dpf hingga 5 dpf. Setiap kelompok berisi 30 ekor larva. Total RNA masing-masing diekstraksi dari sampel larva ikan zebra ini oleh Trizol. Sampel RNA ditranskripsi balik ke cDNA sesuai dengan instruksi pabrikan dari kit cDNA. Tingkat ekspresi mRNA dideteksi oleh PCR kuantitatif fluoresen waktu nyata (Roche LightCycler96). Hasilnya dinormalisasi ke ekspresi -aktin dan dikuantifikasi dengan metode komparatif (2−∆∆Ct). Primer maju dan mundur yang digunakan disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, Cina) dan tercantum dalam Tabel Tambahan S1.
cistanche dan bubuk Tongkat alimembantu meningkatkan kekebalan.
Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik di sini.
2.7 Analisis Statistik
GraphPad Prism versi 8.00 digunakan untuk analisis statistik deskriptif. Data dinyatakan sebagai mean ± SD dan dianalisis dengan metode ANOVA untuk menguji variabilitas antara setiap percobaan dengan mempertimbangkan P Kurang dari atau sama dengan 0.05 sebagai signifikan.
