Bagian 1:Echinacoside Menghambat Pelepasan Glutamat Dengan Menekan Ca2 Bergantung Tegangan plus Entri Dan Protein Kinase C di Terminal Saraf Serebrokortikal Tikus

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 dan Su Jane Wang 3,*

Abstrak:

Sistem glutamatergik mungkin terlibat dalam efek terapi neuroprotektan.echinacosida, glikosida fenilethanoid yang diekstraksi dari ramuan obat CinaHerbal Cistanche, memiliki efek neuroprotektif. Studi ini menyelidiki efek dariechinacosidapada pelepasan glutamat 4-aminopyridine-evoked glutamat di terminal saraf serebrokortikal tikus (sinaptosom). Echinacosida menghambat Ca2 plus-dependen, tetapi tidak Ca2 plus-independen, 4-pembebasan glutamat yang dibangkitkan aminopiridin dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Echincoside juga mengurangi 4-peningkatan yang ditimbulkan oleh aminopyridine dalam konsentrasi Ca2 plus bebas sitoplasma tetapi tidak mengubah potensi membran sinaptosom. Efek penghambatan echinacoside pada 4- pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin dicegah oleh o-conotoxin MVIIC, penghambat spektrum luas saluran Cav2.2 (tipe N) dan Cav2.1 (tipe P/Q). , tetapi tidak sensitif terhadap Ca2 intraseluler ditambah pelepasan-inhibitor dantrolene dan 7-kloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro-4 ,1-benzodiazepin-2(3H)-satu (CGP37157). Selanjutnya, echinacoside menurunkan 4-fosforilasi protein kinase C yang diinduksi aminopyridine, dan inhibitor protein kinase C menghapuskan efek echinacosida pada pelepasan glutamat. Menurut hasil ini, kami menyarankan bahwa efek penghambatan echinacosida pada pelepasan glutamat yang ditimbulkan dikaitkan dengan masuknya Ca2 plus yang bergantung pada voltase dan penekanan selanjutnya dari aktivitas protein kinase C.

Kata kunci:echinacosida; pelepasan glutamat; terminal saraf serebrokortikal; saluran Ca2 plus yang bergantung pada tegangan; protein kinase C

1. Perkenalan

echinacosidaadalah glikosida fenilethanoid utama yang ada dijamuBenteng, obat tradisional Tiongkok yang terkenal digunakan untuk mengobati pelupa, impotensi, dan sembelit kronis [1].echinacosidamemiliki berbagai bioaktivitas seperti antioksidan, anti-inflamasi, antikanker, hepatoproteksi, dan modulasi imun [2-4]. Khususnya, echinacosida memiliki efek neuroprotektif; misalnya, dapat melindungi terhadap stres oksidatif atau neurotoksisitas yang diinduksi neurotoksin pada neuron kortikal tikus primer, sel neuroblastoma manusia SH-SY5Y, dan sel pheochromocytoma (PC12) [5-8]. Selanjutnya, echinacoside melemahkan kerusakan otak dan meningkatkan fungsi kognitif pada hewan model penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer, dan oklusi arteri serebral tengah [9-12]. Namun, mekanisme melalui manaechinacosidamenginduksi perlindungan saraf tidak sepenuhnya dipahami.

Neuroprotection adalah proses kompleks untuk mempertahankan struktur dan fungsi neuron pada serangan toksik. Pengurangan eksitotoksisitas glutamat dianggap sebagai mekanisme potensial yang terlibat dalam perlindungan saraf otak. Glutamat, neurotransmitter asam amino rangsang, memiliki peran penting dalam beberapa fungsi otak [13]. Namun, overaktivasi reseptor glutamat di bawah konsentrasi glutamat yang tinggi menyebabkan Ca2 plus kelebihan intraseluler, disfungsi mitokondria, produksi radikal bebas, dan kematian neuron [14,15]. Proses patologis ini terlibat dalam berbagai gangguan otak termasuk iskemia serebral, cedera otak traumatis, epilepsi, dan penyakit neurodegeneratif [16,17]. Oleh karena itu, inhibitor yang memblokir transmisi glutamatergik patofisiologis dianggap sebagai obat neuroprotektif yang potensial. Contoh penting dari ini adalah antagonis reseptor glutamat [18,19]; Namun, uji klinis untuk obat ini telah gagal karena kurang efektif dan tidak diinginkan, atau bahkan efek samping sitotoksik [20,21]. Selain blokade reseptor glutamat langsung, penghambatan pelepasan glutamat mungkin merupakan strategi yang efektif untuk perlindungan saraf. Beberapa neuroprotektan (misalnya, memantine dan riluzole) dapat mengurangi pelepasan glutamat di jaringan otak tikus [22-24].

Mempertimbangkan peran glutamat dalam eksitotoksisitas dan profil neuroprotektif dari echinacoside, penelitian ini menggunakan terminal saraf terisolasi (synaptosom) yang dimurnikan dari korteks serebral tikus untuk menyelidiki efek echinacoside pada pelepasan glutamat dan mengeksplorasi mekanisme potensial lebih lanjut. Persiapan terminal saraf terisolasi adalah model mapan untuk mempelajari regulasi presinaptik pelepasan neurotransmitter oleh obat-obatan tanpa adanya efek postsinaptik [25]. Dengan menggunakan model ini, kami mengevaluasi efek echinacoside pada pelepasan glutamat, potensial membran, masuknya Ca2 plus presinaptik, dan aktivitas protein kinase C. Menurut tinjauan literatur kami, ini adalah laporan pertama yang mendokumentasikan mekanisme di mana echinacosida menghambat pelepasan glutamat endogen pada tingkat prasinaps.

2. Hasil

2.1. echinacosidaMenghambat 4-Aminopyridine-Evoked Glutamat Release dari Terminal Saraf Serebrokortikal Tikus dengan Mengurangi Eksositosis Vesikular

Gambar 1 mengilustrasikan efek bergantung-konsentrasi dari echinacosida pada pelepasan glutamat yang dipicu oleh aminopiridin 4-dari sinaptosom serebrokortikal tikus yang dimurnikan. Dalam sinaptosom yang diinkubasi dengan 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopiridin membangkitkan pelepasan glutamat sebesar 7,4 ± {{1{{20}}}}.1 nmol/mg/5 menit, yang direduksi dengan 1, 5, 10, 30, dan 50 uM echinacosida menjadi 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0.1, atau 2,3 ​​± 0.4 nmol/mg/5 menit, masing-masing (F(5,24)=67.1, p=0. 000). Nilai IC50 untuk penghambatan pelepasan glutamat yang dipicu oleh echinacosida 4-aminopiridin, yang diturunkan dari kurva respons dosis, adalah 24 uM. Selain itu, pelepasan glutamat yang ditimbulkan oleh 1 mM 4-aminopiridin dalam larutan bebas Ca2 ekstraseluler yang mengandung 300 uM etilen glikol bis( -aminoetil eter)-N,N,N/,N/-asam tetraasetat (EGTA) adalah 2.1 0.2 nmol/mg/5 menit (F(2,12)=310.65, p=0.000),

dan komponen Ca2 plus -independen dari 4-aminopyridine-evoked glutamate release ini tidak terpengaruh oleh 20 uM echinacoside (1,8 ± 0.2 nmol/mg/5 menit; p {{1 0}}.58; Gambar 1). Dalam sinaptosom yang diobati dengan 0.1 uM bafilomisin A1, penghambat transporter vesikular [26], pelepasan glutamat yang dipicu oleh aminopiridin 4-berkurang secara signifikan (2,2 ± 0.2 nmol/mg/ 5 menit; F (2,12)=249.518, p=0.000). Dengan adanya bafilomisin A1, 20 uM echinacosida gagal secara signifikan menghambat pelepasan glutamat (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 menit; p=0.94; Gambar 1). Sebaliknya, 10 uM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, sebuah glutamat reuptake inhibitor) [27], meningkatkan 4-aminopyridine-evoked glutamate release menjadi 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 menit ( t(8)=-11.31, p=0.000). Bahkan dengan adanya DL-TBOA, 20 uM echinacoside menghambat 4- pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin secara signifikan (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 menit; F(2,12)=87.23, p=0.000; Gambar 1).

2.2 Echincoside Mengurangi Konsentrasi Ca2 plus Sitosol tetapi Tidak Mengubah Potensi Membran Sinaptosom

Depolarisasi sinaptosom yang disebabkan oleh 1 mM 4-aminopiridin meningkatkan konsentrasi Ca2 plus (p=0.000; Tabel 1). Penerapan 20 uM echinacosida tidak secara signifikan mempengaruhi konsentrasi Ca2 plus basal (t(8)=0.06, p=0.95) tetapi secara signifikan mengurangi 4-peningkatan yang diinduksi aminopiridin dalam Ca2 ditambah konsentrasi (t(10)=6.16, p=0.000). Selain itu, 1 mM 4-aminopiridin meningkat dalam fluoresensi 3',3',3'-dipropiltiadikarbosianin iodida [DiSC3(5)] (p=0.000). Penambahan 20 uM echinacoside tidak mengubah potensial membran istirahat (t(8)=0.976, p=0.36) atau secara signifikan mengubah 4-peningkatan yang dimediasi aminopiridin di DiSC3 (5) fluoresensi (t(8)=-0.014, p=0.99; Tabel 1).

2.3 Penurunan Ca2 plus Influks melalui Saluran Cav2.2 (Tipe-N) dan Cav2.1 (Tipe P/Q) Dapat Dikaitkan dengan Penghambatan 4-Aminopyridine-Evoked Glutamat Release oleh Echincoside

Gambar 2 menunjukkan bahwa 2 uM o-conotoxin MVIIC, sebuah N- dan P/Q-type Ca2 plus channel blocker, mengurangi 4-aminopyridine-evoked glutamate release dari 7,4 ± {{10}}. 2 hingga 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 menit (t(9)=25.35, p=0.000). Dengan adanya o-conotoxin MVIIC, efek 20 uM echinacosida pada 4-pembebasan glutamat yang dipicu aminopiridin tidak signifikan (1.8 2± ditambah 0,2 nmol/mg/5 menit; t(8)=1.06, hal=0.32). Dantrolene (10 uM), penghambat pelepasan Ca intraseluler dari endoplasma

retikulum [28], pelepasan glutamat yang dipicu oleh 4-aminopiridin (5,6 ± 0.3 nmol/mg/5 menit; F(2,14) {{10}}. 95, hal=0.000). Namun, dengan adanya dantrolene, 20 uM echinacosida masih dapat menghambat pelepasan glutamat secara signifikan (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 menit; p=0.000). Hasil serupa diamati menggunakan 100 uM 7-kloro-5-(2-klorofeni)-1,5-dihidro-4,1-benzothiazepin -2(3H)-one (CGP37157), penghambat pertukaran Na plus /Ca2 plus mitokondria yang dapat ditembus membran. Dalam lima preparat sinaptosomal yang diperiksa, 20 uM echinacoside dikombinasikan dengan 100 uM CGP37157 mengurangi 4-penglepasan glutamat yang ditimbulkan aminopiridin sebesar 48,3 persen ± 5,2 persen (F(2,13) ​​= 136.79, p {{ 49}}.000), mirip dengan penghambatan oleh echinacosida saja (46,2 persen ± 2,3 persen ; p=0.89; Gambar 2).

2.4 echinacosidaMenghambat 4-Aminopyridine-Evoked Glutamat Release oleh Signaling melalui Protein Kinase C

Seperti diilustrasikan pada Gambar 3, 10 uM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimide (GF109203X), penghambat protein kinase C umum [29], mengurangi 4-pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17 }}). Dalam sinaptosom yang diberi perlakuan GF109203X, 20 uM echinacosida mengurangi 4-penglepasan glutamat yang dipicu aminopiridin hanya sebesar 5,5 persen ± 1,8 persen (p=0.89), kurang dari itu oleh echinacosida saja (42,4 persen ± 2,3 persen persen ; p=0.000). Hasil serupa diperoleh dengan 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3 ,4-c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976), suatu selektif untuk isoform Ca2 plus protein kinase C ( , I, II, y) [29]. Dengan adanya 3 uM Go6976, 20 uM echinacoside mengurangi pelepasan glutamat sebesar 11,9 persen ± 2,9 persen (p=0.59), menandakan pengurangan yang signifikan dibandingkan dengan yang hanya dilakukan oleh echinacosida (42,4 persen 2,3 persen ; p {{ 65}}.000; Gambar 3). Sebaliknya, 3 uM rottlerin, Ca2 plus -independen protein kinase C6 inhibitor [30], tidak secara signifikan mengubah 4-aminopiridin (1 mM) yang membangkitkan pelepasan glutamat (p=0.45). Namun demikian, dengan adanya rottlerin, 20 uM echinacosida secara efektif menyebabkan penghambatan rata-rata 37,1 persen ± 5,6 persen pelepasan (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), mirip dengan echincoside saja (p=0.41; Gambar 3). Selain itu, protein kinase inhibitor yang diaktifkan mitogen 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-1-benzopyran-4-satu) (PD98059 ) (50 uM) dan protein kinase A inhibitor N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89) (100 uM) tereduksi 4-aminopyridine-evoked glutamate release (hal=0.000). Bahkan dengan adanya PD98059 atau H89, 20 uM echinacoside secara efektif mengurangi pelepasan (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; Gambar 3).

Gambar 4 menunjukkan bahwa 1 mM 4-aminopiridin meningkatkan fosforilasi protein kinase C dalam sinaptosom (t(4)=-6.871, p=0.002). Ketika sinaptosom diberi perlakuan awal dengan 20 uM echinacoside selama 10 menit sebelum penambahan 4-aminopiridin, 4-aminopiridin menginduksi fosforilasi protein kinase C sangat menurun (F(2,6)=29.202 , p=0.001).

2.5 Penghambatan Pelepasan Glutamat yang Dimediasi Echincoside Tidak Melibatkan Reseptor Asam Gamma-Aminobutirat Tipe A (GABAA)

Pada Gambar 5, efek echinacosida pada 4-aminopyridine-evoked glutamat release dengan tidak adanya atau adanya SR95531 (antagonis reseptor GABAA) dibandingkan. Selain itu, 100 uM SR95531 tidak secara signifikan mengubah 4-aminopyridine (1 mM) yang membangkitkan pelepasan glutamat. Dalam sinaptosom yang diberi perlakuan SR95531-, aplikasi 20 uM echinacosida menghasilkan penghambatan 43 persen pada 4-pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), yang tidak berbeda secara signifikan dari penghambatan yang dihasilkan oleh echinacosida saja (40 persen ; p=0.000). Hasil serupa diperoleh dengan antagonis reseptor GABAA lain, bicuculline (50 uM). Pelepasan yang diukur dengan adanya bicuculline dan echinacosida secara signifikan berbeda dari yang diperoleh dengan adanya bicuculline saja (p=0.000).

3. Diskusi

Dalam studi ini,echinacosida, senyawa aktif dalam HerbalBenteng, menghambat 4-aminopyridine-evoked glutamat release di terminal saraf korteks serebral tikus. Kemungkinan mekanisme yang mendasari untukechinacosidapenghambatan pelepasan glutamat yang dimediasi lebih lanjut diselidiki dan dibahas di sini.

3.1 Mekanisme yang Mendasari Inhibisi Pelepasan Glutamat yang Dimediasi Echincoside

Pelepasan glutamat yang ditimbulkan oleh 4-aminopiridin terdiri dari dua komponen: komponen yang bergantung pada Ca2 plus yang relevan secara fisiologis, yang dihasilkan melalui eksositosis vesikel sinaptik yang mengandung glutamat; dan komponen Ca2 plus-independen, yang berasal dari depolarisasi berkepanjangan yang menyebabkan pergeseran keadaan tunak transporter glutamat yang diperantarai oleh potensial membran ke arah luar, sehingga mempengaruhi efluks glutamat sitosolik [31]. Di sini, kami mengamati bahwa echinacoside tidak secara signifikan menghambat 4- pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin dengan adanya media bebas Ca2 plus (pelepasan independen Ca2 plus). Lebih lanjut, penghambatan pelepasan glutamat yang dipicu oleh echinacoside yang dimediasi oleh echinacosida 4- secara efektif dicegah oleh bafilomisin A1 (yang menghabiskan kandungan glutamat dari vesikel sinaptik), tetapi tidak oleh DL-TBOA (yang secara nonselektif menghambat semua asam amino rangsang subtipe pengangkut). Hasil ini menunjukkan bahwa echinacosida mempengaruhi eksositosis yang bergantung pada Ca2 plus dari pelepasan glutamat tanpa mempengaruhi efluks sitosolik Ca2 plus-independen dari glutamat melalui pembalikan transporter glutamat membran plasma terminal saraf. Di terminal sinaptik, penghambatan saluran Na plus atau aktivasi saluran K plus menstabilkan rangsangan membran dan akibatnya mengurangi masuknya Ca2 plus yang ditimbulkan dan pelepasan neurotransmitter [32,33]. Oleh karena itu, mekanisme potensial yang mendasari penghambatan pelepasan glutamat yang dimediasi echinacosida melibatkan pengurangan rangsangan sinaptosom. Namun, kemungkinan ini tidak dapat dipertahankan berdasarkan dua pengamatan: (1) 4-depolarisasi potensial membran yang ditimbulkan aminopiridin, diukur dengan pewarna sensitif potensial membran DiSC3(5) tidak terpengaruh oleh penambahan echinacoside; dan (2) echinacoside tidak mempengaruhi 4-aminopyridine-evoked Ca2 plus pelepasan glutamat independen, komponen pelepasan yang hanya bergantung pada potensial membran [31]. Jika efeknya tidak disebabkan oleh supresi eksitabilitas sinaptosom, efeknya dapat dimanifestasikan melalui penurunan aktivitas saluran Ca2 plus Cav2.2 (tipe N) dan Cav2.1 (tipe P/Q) ditambah dengan eksositosis glutamat di terminal saraf [34-36]. Dengan menggunakan fura-2, kami menunjukkan bahwa echinacosida secara signifikan mengurangi 4-peningkatan konsentrasi Ca2 plus yang ditimbulkan aminopiridin. Selain itu, data kami menunjukkan bahwa efek penghambatan echinacoside pada 4-pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin menurun dari 42,4 persen 2,3 persen menjadi 12,1 persen 3,9 persen setelah terpapar penghambat Cav2.2 (tipe-N) dan Cav2 .1 (tipe P/Q) Ca2 plus saluran. Lebih lanjut, kami mengamati bahwa echinacoside terus menghambat secara signifikan 4- pelepasan glutamat yang dipicu aminopiridin dengan adanya penghambat pelepasan Ca2 plus intraseluler. Hasil ini menunjukkan bahwa supresi simultan dari Cav2.2 (tipe-N) dan Cav2.1 (tipe-P/Q) Ca2 plus aktivitas saluran adalah mekanisme potensial yang mendasari penghambatan pelepasan glutamat yang dimediasi oleh echinacoside. Namun, aktivasi gabungan Cav2.2 (tipe-N) dan Cav2.1 (tipe-P/Q) Ca2 plus aktivitas saluran tidak dapat memblokir aksi echinacosida sepenuhnya. Oleh karena itu, jenis saluran Ca2 plus lain yang tidak teridentifikasi atau jalur prasinaptik lainnya mungkin terlibat dalam penghambatan. Misalnya, reseptor GABAA hadir pada tingkat prasinaptik, dan aktivasinya telah terbukti menghambat masuknya Ca2 plus dan pelepasan glutamat [37]. Dalam penelitian ini, antagonis reseptor GABAA SR95531 dan bicuculline tidak memblokir penghambatan pelepasan glutamat yang dimediasi echinacosida, menunjukkan bahwa reseptor GABAA tidak terlibat dalam pengurangan aktivitas saluran Ca2 plus yang bergantung pada tegangan dan dalam penghambatan pelepasan glutamat selanjutnya. Ca2 plus masuk melalui saluran Ca2 plus yang bergantung pada tegangan mengaktifkan beberapa protein kinase yang terkait dengan pelepasan glutamat di terminal saraf termasuk protein kinase yang diaktifkan mitogen, protein kinase C, dan protein kinase A. Di sini, kami menunjukkan bahwa penghambat protein kinase C secara efisien menentang echinase. -dimediasi penghambatan pelepasan glutamat; namun demikian, penghambat protein kinase yang diaktifkan oleh mitogen PD98059 atau penghambat protein kinase A H89 tidak efektif. Lebih lanjut, {} fosforilasi protein kinase C yang diinduksi aminopiridin menurun di sinaptosom setelah perlakuan awal dengan echinacosida pada konsentrasi yang efektif untuk menghambat pelepasan glutamat. Oleh karena itu, jalur pensinyalan dari penghambatan pelepasan glutamat yang dimediasi echinacosida mungkin melibatkan protein kinase C. Protein kinase C adalah sistem pensinyalan intraseluler penting yang hadir pada tingkat prasinaptik dan memiliki peran penting dalam eksositosis neurotransmitter. Sebagai contoh, beberapa protein sinaptik yang terlibat dalam trafiking atau rekrutmen vesikel sinaptik dan eksositosis, seperti substrat C kinase kaya alanin yang terfosforilasi oleh protein kinase C [38,39]. Proses fosforilasi ini dapat ditingkatkan dengan masuknya Ca2+ yang dirangsang depolarisasi, yang memfasilitasi pelepasan glutamat [40]. Oleh karena itu, kami dapat berspekulasi bahwa efek penghambatan echinacosida pada entri Ca2 plus yang diamati di sini dapat mengurangi aktivitas protein kinase C dan akibatnya pelepasan glutamat.

Pls klik di sini untuk Bagian 2