Bagian 1: echinacoside Menginduksi Kematian Sel Kanker Apoptosis Dengan Menghambat Enzim Pembersih Kolam Nukleotida MTh1

Kontak:{0}}

Abstrak:Penghambatan enzim sanitasi kolam nukleotida MTH1 menyebabkan kerusakan DNA oksidatif yang luas dan apoptosis pada sel kanker dan karenanya dapat digunakan sebagai strategi antikanker. Karena produk alami telah menjadi sumber yang kaya bahan kimia obat, dalam penelitian ini, kami menggunakan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh MTH1-sebagai hasil uji skrining vitro yang tinggi untuk mencari senyawa alami yang mampu menghambat MTH1.echinacosida, senyawa yang berasal dari tanaman obatBentengdan Echinacea, secara efektif menghambat aktivitas katalitik MTH1 dalam uji in vitro. Pengobatan berbagai lini sel kanker manusia denganechinacosidamenghasilkan peningkatan yang signifikan dalam tingkat seluler guanin teroksidasi (8-oksoguanin), sementara tingkat spesies oksigen reaktif seluler tetap tidak berubah, menunjukkan bahwaechinacosidajuga menghambat aktivitas MTH1 seluler. Akibatnya, pengobatan Echincoside menginduksi peningkatan segera dan dramatis dalam penanda kerusakan DNA dan peningkatan regulasi penghambat G1/S-CDK p21, yang diikuti oleh kematian sel apoptosis yang ditandai dan penghentian siklus sel pada kanker tetapi tidak pada sel nonkanker. Secara keseluruhan, studi ini mengidentifikasi senyawa alami sebagai penghambat MTH1 dan menyarankan bahwa produk alami dapat menjadi sumber penting agen antikanker.

Kata kunci: echinacosida, MTH1, 8-oxoG, kerusakan DNA, apoptosis, penghentian siklus sel

Bentengekstrak memilikianti kankerKeuntungan sehat

Klik di sini untuk Bagian 2

pengantar

Kumpulan nukleosida trifosfat (NTP) seluler dan mitokondria (NTP) dan deoxynucleoside triphosphate (dNTP) adalah target signifikan dari berbagai spesies oksigen reaktif (ROS).1–3 Karena spesifisitas DNA polimerase kurang sempurna,4,5 dNTP teroksidasi dapat dimasukkan ke dalam DNA yang baru disintesis untuk menyebabkan penyimpangan genetik jika tidak diperbaiki.6 Misalnya, basa teroksidasi utama dalam kumpulan nukleotida, 8-oxoguanine (8-oxoG), dapat berpasangan dengan sitosin dan adenin. Ketika dimasukkan ke dalam adenin yang berlawanan selama replikasi DNA, berpotensi menyebabkan transversi T: A=G: C,7 yang merupakan salah satu mutasi paling umum yang ditemukan pada kanker manusia.8,9 Meskipun sebagian besar dNTP bebas teroksidasi dihapus oleh enzim sanitasi kolam nukleotida, penelitian di masa lalu telah mengungkapkan bahwa kolam nukleotida masih merupakan sumber penting dari basa teroksidasi dalam molekul DNA dan kontributor signifikan terhadap kerusakan DNA oksidatif.3,10 enzim yang paling penting untuk sanitasi nukleotida kolam.15 Namun demikian, bahkan di bawah pengawasan oleh enzim sanitasi kolam nukleotida, sebagian besar dNTP teroksidasi dimasukkan ke dalam DNA, dan basa dalam molekul DNA juga dapat dioksidasi langsung oleh ROS.6 Sel kemudian mengandalkan strategi yang lebih rumit yang melibatkan berbagai Glikosilase DNA, seperti OGG1 dan MUTYH, dan proses perbaikan DNA, termasuk perbaikan eksisi dasar (BER) dan perbaikan ketidakcocokan (MMR), untuk memperbaiki basa bermasalah dalam molekul DNA.10,16,17 BER a nd MMR biasanya memperbaiki banyak basa teroksidasi dalam DNA per hari dan dengan demikian memainkan peran penting dalam melindungi integritas dan stabilitas genom.

Dalam sel yang berada di bawah tekanan oksidatif yang tinggi, peningkatan penggabungan nukleotida teroksidasi ke dalam DNA dapat membebani kapasitas perbaikan seluler dan memicu respons kerusakan DNA (DDR).18 Pensinyalan DDR yang persisten akan menyebabkan penghentian siklus sel, penuaan seluler dini, atauapoptosis, sehingga menetapkan penghalang untuk tumorigenesis.19 Namun, meskipun sel kanker menunjukkan ketegangan oksidatif yang sangat meningkat dan menghasilkan beban nukleotida teroksidasi yang berpotensi mematikan,20 mereka dapat bertahan dari penuaan terkait DDR atauapoptosis.21 Sejumlah besar penelitian telah menunjukkan bahwa MTH1, dengan secara efektif menghilangkan 8-oxodGTP dan 2-OH-dATP yang sangat berbahaya dalam sel tumor, memainkan peran kunci dalam perkembangan kanker.22 MTH1 adalah ditemukan diekspresikan secara berlebihan pada berbagai jenis kanker, 23-25 ​​dan 8-tingkat oxoG, dan tingkat lesi DNA oksidatif lebih rendah pada tumor daripada di jaringan normal sekitarnya.26-28 Secara fungsional, ekspresi berlebih MTH1 secara signifikan berkurang jumlah mutasi DNA yang terlihat pada fibroblas embrionik tikus yang kekurangan MMR10 dan memungkinkan sel untuk mengatasi penuaan dini dan apoptosis seluler yang diinduksi Ras onkogenik;29 sedangkan penekanan MTH1 mencegah perkembangan kanker pada tikus yang kekurangan OGG1-30 dan mempromosikan DDR yang diinduksi ROS dan penuaan seluler dalam sel yang ditransformasikan oleh Ras.3,29,31 Jadi, meskipun MTH1 memainkan peran protektif dengan mencegah mutasi yang diinduksi ROS pada sel sehat, studi ini menemukan bahwa MTH1 sangat diperlukan untuk kemunculan dan kelangsungan hidup dari sel kanker. Studi terbaru telah memberikan lebih banyak bukti untuk mendukung peran MTH1 dalam perkembangan kanker.31-34 Penekanan MTH1 oleh RNAi atau inhibitor molekul kecil di berbagai lini sel kanker menghasilkan peningkatan penggabungan 8-oxo d G ke dalam DNA genom. , menyebabkan kerusakan DNA yang luas, kematian sel apoptosis, dan kelangsungan hidup sel kanker berkurang.32,33 Dalam studi xenograft tikus, penghambatan MTH1 efisien menekan pertumbuhan eksplan kanker. Yang penting, menekan MTH1 tidak berdampak pada pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel normal, mungkin karena sel normal memiliki ROS yang lebih rendah dan karenanya kurang bergantung pada MTH1 untuk kelangsungan hidup.32,33 Temuan ini menunjukkan bahwa penghambatan MTH1 adalah strategi baru yang menjanjikan untuk melawan kanker.

Produk alami telah menjadi sumber yang kaya senyawa obat.35 Banyak terapi modern, termasuk obat anti-kanker, telah diturunkan dari sediaan herbal atau botani.36-39 Namun, sejumlah besar ramuan tradisional diusulkan untuk memiliki berbagai sifat terapeutik untuk tetap dipertahankan. untuk dikarakterisasi, sebagian besar karena kesulitan dalam mengendalikan komposisinya untuk secara jelas mendefinisikan kemanjuran dan mekanisme aksinya.40 Pendekatan baru yang memungkinkan pendeteksian senyawa aktif dan analisis mekanisme molekuler diperlukan. Dalam hal ini, penyaringan in vitro throughput tinggi yang dipandu target dapat berperan dalam menemukan senyawa obat yang ditentukan secara mekanis dari sumber daya alam. Dalam penelitian ini, kami menggunakan reaksi enzimatik yang dikatalisis MTH1-sebagai uji in vitro throughput tinggi untuk mencari senyawa alami yang dapat menghambat MTH1. Anehnya, pemutaran mengungkapkan bahwaechinacosida, produk alami yang paling dikenal karena aktivitas antioksidannya yang kuat, mampu menghambat MTH1.

echinacosidadi kaleng cistancheanti-apoptosis

Bahan dan metode

Bahan:

Senyawa herbal alami dibeli dari Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Republik Rakyat Cina. Nama, nomor katalog, nomor registrasi Chemical Abstracts Service (CAS), dan kemurnian masing-masing senyawa tercantum dalam Tabel S1. Larutan stok senyawa disiapkan dalam 100 persen dimetil sulfoksida (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), dan larutan kerja disiapkan dalam buffer uji atau media kultur sel lengkap. Larutan yang sama tanpa senyawa uji tetapi mengandung jumlah DMSO yang sama digunakan sebagai kontrol kendaraan. (S)-crizotinib dibeli dari Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

skrining in vitro

Uji enzimatik in vitro yang digunakan untuk menyaring senyawa herbal alami mengikuti prosedur yang dijelaskan oleh Gad et al.32 Secara singkat, pengenceran serial senyawa individu disiapkan dalam buffer uji yang terdiri dari 100 mM Tris- asetat (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg asetat, 0,005 persen Tween 20, dan 1 mM DTT. Selanjutnya, 0,5 nM manusia rekombinanMTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 M dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), dan 0,2 U/mL pirofosfatase anorganik (Thermo Fisher Scientific) ditambahkan, dan pelat diinkubasi pada pengocok piring selama 1 jam pada suhu kamar. Volume reaksi akhir adalah 100 L dalam pelat sumur 96-. Pada akhir reaksi, ditambahkan perunggu hijau (J&K Scientific, Beijing, Republik Rakyat Cina),41, dan pelat diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Absorbansi pada 630 nm diukur dengan pembaca lempeng mikro BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Nilai konsentrasi hambat (IC50) ditentukan dengan analisis regresi nonlinier menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism.

budaya sel

Manusia MG-63 osteosarcoma, SK-HEP-1hepatocarcinoma, kanker payudara MCF7, kanker kolorektal SW480, ginjal embrio HEK293, dan garis sel fibroblas NIH/3T3 tikus berasal dari American Type Culture Collection, dan manusia normal garis sel hati L-O2 dibeli dari KenGen Biotech, Nanjing, Republik Rakyat Cina. Sel-sel ini dipertahankan pada 37 derajat dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5 persen CO2, mengikuti instruksi yang diberikan oleh penyedia. Tidak ada pernyataan etika yang diperlukan dari dewan peninjau institusional untuk penggunaan jalur sel ini.

Pengukuran tingkat intraseluler {{{0}}oxo Intraseluler 8-oxoG diukur dengan pewarnaan dengan Cy3-avidin terkonjugasi.42 Sebanyak 1×104 sel diukur diunggulkan pada kaca penutup bundar di 12-piring sumur. Keesokan harinya, sel-sel diperlakukan dengan 0 M, 15 M, 30 M, 60 M, atau 80 M Echinacoside selama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam dan kemudian difiksasi dengan es -methanol dingin selama 20 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam Tris-buffered saline (TBS) dengan 0,1 persen Triton X-100 (Sigma-Aldrich) selama 15 menit. Sampel diblok di TBS dengan 0,1 persen Triton X-100 dan 15 persen serum janin sapi selama 1 jam pada suhu kamar dan kemudian diwarnai dengan Cy3-avidin terkonjugasi (0,5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) dalam larutan pemblokiran selama 1 jam pada suhu 37 derajat . Setelah dicuci dalam phosphate-buffered saline (PBS) 3 kali selama 5 menit, kaca penutup ditutup pada kaca slide pelindung serangga Media Pemasangan dengan 4′,6-diamidino-2-fenilindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA , AS). Gambar diambil dan dianalisis dengan mikroskop confocal Zeiss LCM 510.

Pengukuran tingkat ROS intraseluler Ros intraseluler diukur dengan flow cytometry menggunakan kit uji ROS berbasis sel (Beyotime Biotechnology, Haimen, People's Republic of China). Sel yang ditumbuhkan di piring enam sumur diperlakukan dengan 0 M, 15 M, 30 M, 60 M, atau 80 M Echincoside selama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam, dicuci dua kali dengan PBS, dan diinkubasi dengan 10 M dichlorofluorescein diacetate selama 30 menit pada 37 derajat. Sel-sel kemudian di-tripsinisasi dan dianalisis dengan flow cytometer FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Tingkat ROS intraseluler diekspresikan sebagai intensitas fluoresensi dichlorodihydrofluorescein rata-rata sel. Angka-angka yang ditampilkan adalah rata-rata dari tiga percobaan independen.

Pewarnaan imunofluoresen

Sel yang ditumbuhkan pada kaca penutup diperlakukan dengan Echinacosida {{0}} M, 15 M, 30 M, 60 M, atau 80 M selama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam dan kemudian dicuci sekali dengan PBS, difiksasi dengan 4 persen paraformaldehida dalam PBS selama 20 menit, dan diblokir di TBS dengan 0,1 persen Triton X-100 dan 15 persen serum janin sapi selama 1 jam pada suhu kamar. Sel tetap diwarnai selama 2 jam pada suhu kamar dengan antibodi primer terhadap 8-oxoG (mouse monoclonal anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (kelinci anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA), atau caspase aktif-3 (kelinci anti-caspase-3, Bioss, Beijing, Republik Rakyat Cina), diikuti dengan pewarnaan dengan Alexa 488-antimouse keledai terkonjugasi ( Abcam) atau antibodi sekunder anti-kelinci kambing terkonjugasi Cy3-(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah dicuci dalam PBS 3 kali selama 5 menit, kaca penutup ditutup rapat pada kaca objek dalam Media Pemasangan VECTASHIELD dengan DAPI (Vector Laboratories). Gambar diambil dengan mikroskop confocal Zeiss LCM 510.

uji pembentukan koloni

Sehari sebelum perawatan, sel-sel diunggulkan di piring enam sumur dengan konsentrasi 1 × 104 sel per sumur. Mereka kemudian diobati dengan 0 M, 60 M, atau 80 M Echincoside selama 7 hari. Setelah dicuci dengan PBS, sel difiksasi dengan metanol dingin dan diwarnai dengan larutan kristal violet (Sigma-Aldrich) (0,5 persen dalam 25 persen metanol). Gambar difoto setelah mengeringkan pelat semalaman. Kristal violet kristal dilarutkan dengan menambahkan 70 persen etanol, dan absorbansi pada 595 nm diukur dengan pembaca mikroplate BioRad 680. Data dianalisis menggunakan software GraphPad Prism.

uji MTT

Satu hari sebelum perawatan, sel-sel disemai di 96-piring sumur pada konsentrasi 1 × 104 sel per sumur, diikuti dengan perawatan dengan pengenceran serial Echincoside selama 24 jam atau 48 jam, atau dengan 60 M Echincoside selama 5 jam, 12 jam , atau 24 jam. Media telah dihapus, dan sel-sel dicuci dengan PBS, dan kemudian, 20 L 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{15} }larutan difenil tetrazolium bromida (MTT) (5 mg/mL dalam PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) ditambahkan ke setiap sumur. Pelat diinkubasi pada 37 derajat selama 4 jam. Pada akhirnya, larutan MTT dihilangkan dan 150 L DMSO ditambahkan ke setiap sumur. Pelat diinkubasi pada pengocok piring selama 10 menit, dan absorbansi pada 570 nm diukur dengan pembaca lempeng mikro BioRad 680. Setiap percobaan dilakukan dua kali dalam rangkap tiga. Data dianalisis menggunakan software GraphPad Prism. Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan analisis regresi nonlinier.

analisis siklus sel

Sel dalam pelat enam sumur diperlakukan dengan 0 M, 6{{10}} M, atau 80 M Echinacoside selama 24 jam, dipanen dengan tripsin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , dicuci dua kali dengan PBS, dan kemudian difiksasi dengan etanol dingin (70 persen) selama 2 jam pada -20 derajat. Sel tetap dicuci dua kali dalam PBS dingin dan disuspensikan kembali dalam 300 L PBS yang baru disiapkan dengan 0,1 persen Triton X-100, 0,2 mg/mL RNase A (Sigma-Aldrich) bebas DNase, 10 ug/mL propidium iodida ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Swiss). Setelah inkubasi pada suhu 37 derajat dalam gelap selama 20 menit, sel-sel disaring melalui jaring nilon Falcon (BD Biosciences), dimuat ke sitometer aliran FAC-SCalibur, dan dianalisis menggunakan perangkat lunak ModFit (BD Biosciences).

Analisis fragmentasi DNA

Sel yang ditumbuhkan dalam pelat enam sumur diperlakukan dengan 0 M, 60 M, atau 80 M Echinacoside selama 24 jam dan difiksasi dalam paraformaldehid 4 persen dingin (Sigma-Aldrich) selama 20 menit. Setelah dicuci dengan PBS, sel disegel dalam Media Pemasangan VECTASHIELD dengan DAPI (Vector Laboratories). Morfologi nuklir difoto dengan mikroskop fluorescent Olympus. Untuk mendeteksi fragmentasi DNA pada gel agarosa, DNA diekstraksi menggunakan kit mikro DNA QIAamp (Qiagen NV, Venlo, Belanda), dan elektroforesis dilakukan pada 2 persen gel agarosa yang mengandung 0,1 ug/mL etidium bromida.

Analisis apoptosis dengan flow cytometry Sel-sel apoptosis diperiksa menggunakan kit deteksi Apoptosis Annexin V-FITC (Bestbio, Shanghai, Republik Rakyat Cina), mengikuti instruksi pabrik. Sel yang ditumbuhkan di 96-piring sumur diperlakukan dengan 0 M, 15 M, 30 M, 60 M, 80 M, atau 160 M Echincoside selama 2 jam, 5 jam, 12 jam, atau 24 jam, dicuci dua kali dengan PBS, dan kemudian disuspensikan kembali dalam buffer pengikat. Selanjutnya, 5 L annexin V-FITC dan 5 L PI (Roche) ditambahkan secara berurutan, dan sel diinkubasi selama 15 menit dalam gelap pada suhu kamar. Sel-sel tersebut dimuat ke cytometer aliran FACSCalibur (BD Biosciences), dan data dianalisis menggunakan perangkat lunak Cell Quest (BD Biosciences).

Analisis Western blot

Sel yang ditumbuhkan di piring enam sumur diperlakukan dengan 0 M, 6{{10}} M, atau 80 M Echinacoside selama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam, dicuci dua kali dengan PBS dan dikerok dari pelat menggunakan 100 L buffer radioimmunopresipitasi (150 mM NaCl, 1,0 persen IGEPAL CA-630, 0,5 persen natrium deoksikolat, 0,1 persen natrium dodesil sulfat , dan 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) yang mengandung 1 mM fenilmetana sulfonil fluorida. Sampel disentrifugasi pada 12,000× g selama 20 menit pada 4 derajat. Konsentrasi protein dalam supernatan ditentukan oleh reagen Bradford (Dingguo, Changchun, Republik Rakyat Cina). Sampel didenaturasi pada suhu 95 derajat selama 10 menit dan dipisahkan pada gel elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 12 persen. Setelah elektroforesis, protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (Millipore), diikuti dengan pemblokiran dalam larutan garam buffer Tris dengan Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 persen Tween 20) yang mengandung 5 persen (b/v) susu tanpa lemak selama 1 jam pada suhu kamar. Bercak diperiksa dengan antibodi primer terhadap p21 (Abcam), poli (ADP-ribosa) polimerase (Bioss), atau caspase teraktivasi-3 (Bioss), diikuti oleh antibodi sekunder terkonjugasi lobak peroksidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Sinyal dikembangkan menggunakan kit deteksi Western blotting chemiluminescence yang disempurnakan (Transgen Biotech, Changchun, Republik Rakyat Cina). Percobaan diulang tiga kali.

echinacosidadi kaleng cistancheanti-apoptosisdananti-oksidasi

Pengukuran mitokondria

potensial membran

Potensi membran mitokondria diukur menggunakan pewarna JC{{0}} (Bioteknologi), mengikuti instruksi pabrik. Sel yang ditumbuhkan dalam pelat enam sumur diperlakukan dengan 0 M, 60 M, atau 80 M Echinacosida selama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam, dicuci dua kali dalam PBS dan kemudian diinkubasi dengan JC-1 selama 20 menit. Gambar diambil menggunakan mikroskop fluorescent Olympus.

Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Software GraphPad Prism. Signifikansi dihitung menggunakan analisis varians satu arah, dan P0.05 dianggap signifikan secara statistik. Hasil dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi.

echinacosidadi kaleng cistancheanti-apoptosisdan meningkatkan kekebalan