Bagian 1 Deteksi Produk Obat Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Menggunakan Tanda Tangan Nukleotida Spesifik

Untuk informasi lebih lanjut silahkan hubungi:{0}}

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* dan Shi-lin Chen 3

1 Laboratorium Kunci Pemanfaatan Zat Bioaktif dan Sumber Daya Obat Herbal Tiongkok, Kementerian Pendidikan, Institut Pengembangan Tanaman Obat, Akademi Ilmu Kedokteran Tiongkok dan Perguruan Tinggi Kedokteran Serikat Peking, Beijing, Tiongkok, 2 Aliansi Penelitian NHP, Institut Keanekaragaman Hayati Ontario (BIO ), Universitas Guelph, Guelph, ON, Kanada,

3 Laboratorium Utama Beijing untuk Identifikasi dan Evaluasi Keamanan Pengobatan Tiongkok, Institut Materia Medica Tiongkok, Akademi Ilmu Kedokteran Tiongkok Tiongkok, Beijing, Tiongkok

Cistanche deserticola memiliki banyak efek, klik di sini untuk tahu lebih banyak

Cistanches Herbaadalah tanaman obat yang memiliki sifat detoksifikasi dan umum digunakan di Asia. Karena ketidakseimbangan antara penawaran dan permintaan, pezina sering ditambahkan untuk mendapatkan keuntungan. Namun, tidak ada pengawasan peraturan karena alat kontrol kualitas tidak cukup untuk mengidentifikasi produk yang diproses secara berat. Dengan demikian, alat molekuler baru berdasarkan tanda tangan nukleotida dan primer spesifik spesies dikembangkan. Wilayah ITS2 dari 251Cistanches Herbadan sampel pemalsuan diurutkan. Berdasarkan situs SNP, empat tanda tangan nukleotida dalam 30-37 bp dan enam primer spesifik spesies dikembangkan, dan mereka divalidasi oleh campuran eksperimental buatan yang terdiri dari enam spesies berbeda dan rasio berbeda. Metode ini juga diterapkan untuk mendeteksi 66Cistanches Herbaproduk di pasar, termasuk ekstrak dan obat paten Cina. Hasilnya menunjukkan kegunaan tanda tangan nukleotida dalam mengidentifikasi bahan pezina dalam campuran. Studi pasar mengungkapkan 36,4 persen pemalsuan: 19,7 persen melibatkan pemalsuan dengan Cynomorium songaricum atauBentengSinensis, dan 16,7 persen melibatkan substitusi dengan Cy. songaricum, Ci. sinensis, atau Boschniakia rossica. Hasil penelitian juga mengungkapkan bahwa Cy. songaricum adalah pezina yang paling umum di pasar. Oleh karena itu, kami merekomendasikan penggunaan tanda tangan nukleotida spesifik spesies untuk mengatur pemalsuan dan memverifikasi jaminan kualitas rantai pasokan produk obat, terutama untuk produk olahan yang DNA-nya terdegradasi.

Kata kunci: Cistanches Herba, obat paten Cina, tanda tangan nukleotida, DNA terdegradasi, kontrol kualitas obat

PENGANTAR

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) adalah obat yang tercatat dalam Farmakope terkenal di Asia (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Japan Pharmacopeial Convention, 2016); obat ini berasal dari batang sukulen keringDeserticola CistancheYC Ma atauCistanche tubulosatonik, karena tidak beracun dan dapat dikonsumsi dalam jangka waktu yang lama (Li et al., 2016). Lebih-lebih lagi,CistanchesHerba dianugerahkan dengan kehormatan bernama "Ginseng Gurun" karena nilai obatnya yang luar biasa, terutama dalam memperkuat fungsi seksual pria (Zhang dan Su, 2014; Gu et al., 2016). Ada lebih dari 100 obat paten Tiongkok yang tercatat di Komisi Farmakope Tiongkok (2015) dan dalam standar resmi lokal lainnya (Wang et al., 2012). Dengan meningkatnya populasi individu lanjut usia, ada permintaan yang cukup besar untukCistanches Herbadan produk obatnya. Namun, sumber bahan baku menjadi semakin langka. Faktanya, dua spesies asli dariCistanches Herbatelah ditambahkan ke Buku Data Merah Tanaman China sebagai tanaman liar yang dilindungi negara (kategori II) (Fu, 1991). Bahan obat di pasar terutama dibudidayakan di barat laut Cina.

Karena ketidakseimbangan yang cukup besar antara pasokan dan permintaan dariCistanchesHerba, banyak pezina telah memasuki pasar; pezina ini tidak sesuai dengan standar dan dapat mengancam keamanan obat. Bahan pezina yang diketahui termasuk batang sukulen kering dari Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang dalam bahasa Mandarin),Bentengsinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan, dan Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Pezina ini memiliki karakteristik morfologi yang mirip denganCistanchesHerba, mempersulit identifikasi taksonomi tradisional, terutama setelah bahan tersebut diolah menjadi produk obat. Identifikasi mikroskopis tidak tersedia karenaCistanchesjamutidak memiliki karakteristik mikroskopis definitif atau unik. Alat kimia analitik saat ini tidak cukup untuk mendeteksi pemalsuan Cistanches Herba karena senyawa serupa juga ada dalam zat pemalsuan Ci yang diketahui. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) dan Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Oleh karena itu, pengembangan metode molekuler yang cepat untuk otentikasi Cistanches Herba dan produknya sangat dibutuhkan untuk sistem kontrol kualitas yang tepat dalam obat paten Cina dan industri produk obat lainnya.

Chen dkk. pertama kali menyarankan spacer transkripsi internal 2 (ITS2) sebagai barcode universal untuk tanaman obat (Chen et al., 2010). Matahari dkk. memverifikasi wilayah ITS2 sebagai kode batang DNA yang lebih disukai untuk mengidentifikasiCistanchesHerba dan zat pengganggunya (Sun et al., 2012). Namun, ITS2 tidak dapat digunakan untuk membedakan obat paten China dari DNA yang terdegradasi. Baru-baru ini, semakin banyak penelitian menunjukkan bahwa "barcode mini" adalah metode yang berguna untuk memperkuat DNA yang terdegradasi (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Namun, tanda tangan nukleotida lebih tepat daripada barcode mini, karena pembentuknya mengacu pada satu atau lebih nukleotida yang unik untuk satu spesies dan dapat digunakan secara efektif oleh banyak teknik molekuler, seperti probe DNA, mikrofluida, dan amplifikasi isotermal yang dimediasi loop. de Boer dkk., 2015). Han dkk. mengembangkan tanda tangan nukleotida untuk Panax ginseng, Angelica Sinensis, dan Lonicera japonica dan berhasil mengidentifikasi obat paten Cina terkait (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

produk fungsional yang mengandungCistanchesjamu. Secara khusus, kami (1) mengembangkan empat tanda tangan nukleotida dan enam pasangan primer spesifik untuk membedakan asliCistanchesHerba dan bahan pengawet yang diketahui, (2) memvalidasi empat tanda nukleotida dalam percobaan termasuk campuran voucher taksonomi yang diketahui yang digunakan untuk menyiapkan produk Cistanches Herba yang mengandung bahan asli dan yang dipalsukan, dan (3) melakukan survei pasar terhadap 66CistanchesProduk herba melalui tanda tangan nukleotida mereka.

Bentengmemiliki banyak efek dan dapat meningkatkan fungsi ginjal

BAHAN DAN METODE

Pengumpulan dan Persiapan Sampel

Secara total, 251 sampel dikumpulkan dari Mongolia Dalam, Xinjiang, dan Ningxia, antara lain; sampel ini termasuk 214Cistanches Herbadan 37 pezina dan dirinci dalam Tabel Tambahan S1. Sampel voucher yang sesuai divalidasi oleh ahli taksonomi dan disimpan di Herbarium Institut Pengembangan Tanaman Obat, Akademi Ilmu Kedokteran China, Beijing, China. Sebanyak 35 batch bubuk, rempah-rempah, dan ekstrakCistanchesHerba dibeli dari toko online dan toko obat fisik di Beijing dan Chengdu (Tabel 1). Secara total, 31 batch obat paten Tiongkok mengandungCistanchesHerba dibeli dari toko obat yang berbeda (Tabel 2), dan komposisi obat paten Cina yang berbeda ditunjukkan pada Tabel Tambahan S3. Karakteristik morfologi yang berbeda dari bentuk dosis yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 1.

Sampel campuran: Serbuk Ci.gurun pasir, Ci.tubulosa, Ci. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica, dan O. coerulescens dicampur secara artifisial dalam kombinasi yang berbeda (dengan perbandingan 1:1) sebelum ekstraksi. Rincian sampel campuran ini ditunjukkan dalam legenda Gambar 3. Selain itu, bubuk dari empat bahan pezina dicampur dengan Ci asli. deserticola pada rasio berat yang berbeda: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 dan 60000:1 (Tabel 3). Dan kedua produk asli dicampur dalam proporsi yang sama.

Rebusan: Irisan Ci. deserticola dan Cy. songaricum digunakan untuk menyiapkan rebusan. Irisan (10 g) direbus dalam 300 mL air suling ganda selama 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, dan 240 menit dan kemudian digunakan untuk ekstraksi DNA.

Ekstraksi DNA, Amplifikasi Reaksi Rantai Polimerase (PCR), dan Sequencing

Spesimen, rebusan, dan sampel campuran: Sampel (40-50 mg) digiling menjadi bubuk halus melalui pabrik mixer laboratorium Retsch MM400 (Retsch Co., Jerman) pada frekuensi 30 Hz. DNA genomik kemudian diekstraksi dengan Kit DNA Genom Universal Tanaman (Tiangen Biotech Beijing Co., China) sesuai dengan instruksi pabrik. ITS2 diperkuat oleh primer universal 2F/3R (Chen et al., 2010).

secara paralel per batch. Bubuk obat paten Cina dicuci dengan 700 L buffer prewash [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM asam etilendiamintetraasetat (EDTA), pH 8,0;

700 mM NaCl; 2 persen polivinilpirolidon (PVP)-40; dan 0,4 persen -merkaptoetanol] beberapa kali sampai supernatan jernih dan tidak berwarna, setelah itu campuran disentrifugasi pada 7500 × g selama 5 menit pada suhu kamar. Endapan kemudian digunakan untuk mengekstrak DNA genom melalui Kit DNA Genom Universal Tanaman (Tiangen Biotech Beijing Co.) sesuai dengan instruksi pabrik. Pada akhirnya, DNA dari setiap batch dipekatkan ke dalam satu tabung. Enam pasangan primer spesifik spesies—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR, dan LDF/LDR—dirancang melalui Primer Premier

6.0 perangkat lunak (Premier Co., Kanada) untuk mengamplifikasi Cistanches Herba dan zat-zat pezinanya (detailnya ditunjukkan pada Tabel 4). PCR dilakukan dalam reaksi volume 50 L yang mengandung 1 L

KOD FX (Toyobo Co., Jepang), 25 L 2 × PCR buffer, 10 L dNTPs (2 mM), 1,5 L setiap primer (10 M), dan 4 L (∼50 ng) template DNA; volume yang tersisa terdiri dari air suling ganda. Reaksi dilakukan oleh

pengendara sepeda termal (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); program termal tercantum dalam Tabel 4. Produk PCR diperiksa melalui elektroforesis gel agarosa 3 persen dan dimurnikan untuk pengurutan dua arah dengan sequencer ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) sesuai dengan metode pengurutan Sanger. Kemudian, sensitivitas keenam primer diuji melalui uji kuantitatif real-time PCR (qRT-PCR) dengan CFX96 Real-time System (Bio-rad Lab., USA). Ambang batas siklus dihitung secara otomatis oleh sistem melalui model "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". qRT-PCR dilakukan dalam reaksi volume 15 L yang mengandung 7,5 L SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Japan), 1.0 L masing-masing primer (10 M), dan 1,0 L template DNA dengan volume sisa yang terdiri dari air suling ganda. qRT-PCR dilakukan dengan tiga ulangan teknis berdasarkan kesalahan standar yang dihitung.

Analisis urutan: Urutan diedit dan dirakit secara manual melalui CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA).

Urutan ITS dari GenBank dijelaskan melalui model Hidden Markov (HMM) untuk mendapatkan urutan ITS2 (Keller et al., 2009). Urutan kemudian disejajarkan dengan perangkat lunak MEGA 5.0 melalui metode penyelarasan "Otot" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Bentengmemiliki banyak efek dan dapat meningkatkanginjalfungsi

HASIL

Pengembangan Tanda Tangan Nukleotida dan Pasangan Primer Spesifik Spesies untuk Herba Cistanches dan Adulterants

Tingkat keberhasilan amplifikasi dan pengurutan PCR dari 251 sampel adalah 100 persen ketika pasangan primer 2F/3R digunakan. Panjang sejajar dari Cy. sekuens songaricum ITS2 adalah 229 bp (Gambar Tambahan S1). Analisis sekuens dari spesies herbarium dan spesies yang terkait erat yang diambil dari GenBank (Tabel Tambahan S2) mengungkapkan dua situs polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) untuk Cy. songaricum. Atas dasar SNP, satu Cy. Songaricum-spesifik 30- tanda tangan nukleotida bp (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') dikembangkan (Gambar 2A). Hasil Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) di NCBI menunjukkan bahwa tanda tangan nukleotida ini unik untuk Cy. songaricum (Tabel 5). Dengan analisis serupa dari sekuens dari spesies yang berkerabat dekat, satu hingga dua SNP ditemukan dari Ci. sinensis, B. rossica, dan O. coerulescens. Atas dasar SNP, tanda tangan nukleotida untuk tiga pezina lainnya juga dikembangkan dengan cara yang sama, termasuk tanda tangan 34 bp (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) untuk Ci. Sinensis, tanda tangan 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') untuk B. rossica, dan tanda tangan 31 bp (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg) untuk {{26} coerulescens.} (Angka 2BD). Analisis BLAST di NCBI juga mengungkapkan bahwa tanda tangan nukleotida ini spesifik dan tidak ada pada spesies lain (Tabel 5).

Cistanches Herbadan zat pezinanya dapat diamplifikasi secara simultan dari campuran melalui pasangan primer universal 2F/3R. Dengan demikian, kami merancang primer spesifik spesies untuk amplifikasi tanda tangan nukleotida dengan menyelaraskan urutan ITS2. Empat pasangan primer spesifik—SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR, dan LDF/LDR—dirancang untuk memperkuat tanda tangan nukleotida Cy. songaricum, B.rossica, Ci. sinensis, dan O. coerulescens, masing-masing (Tabel 4). Panjang amplikon masing-masing adalah 123, 72, 131, dan 71 bp.

Selain itu, total 214 sekuens ITS2 dari bahan eksperimental Cistanches Herba dianalisis. Dua primer spesifik pendek—HMRCF/HMRCR dan GHRCF/GHRCR untuk Ci. deserticola dan Ci. tubulosa, masing-masing—dirancang untuk memperkuat daerah pendek dari sampel yang terdegradasi (Tabel 4). Panjang amplikon masing-masing adalah 132 dan 134 bp.

Validasi Metode Tanda Tangan Nukleotida dan Primer Spesifik Berbasis Campuran dan Rebusan Buatan

Efisiensi amplifikasi dari pasangan primer baru divalidasi dari campuran. Produk PCR diperoleh melalui setiap pasangan primer untuk setiap spesies yang ditargetkan, seperti yang ditunjukkan

Nilai cq B. rossica atau O. coerulescens dapat diperoleh walaupun proporsi sampel adalah 30000:1 atau 40000:1, dan hasil amplifikasi Ci. sinensis, Ci.tubulosa, dan Ci deserticola dapat dideteksi jika rasionya adalah 20000:1. Tetapi tidak ada hasil yang dapat dideteksi untuk Cy. songaricum ketika itu merupakan proporsi 20000:1.

Untuk memverifikasi apakah metode tanda tangan nukleotida berfungsi dengan bahan olahan, rebusan Ci. deserticola dan Cy. songaricum disiapkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa barcode pendek dari Ci. deserticola dapat diperkuat, bahkan setelah sampel direbus selama 210 menit. Selain itu, tanda tangan nukleotida Cy. songaricum dapat diamplifikasi setelah sampel direbus selama 150 menit, sementara tidak ada produk PCR yang terdeteksi setelah sampel direbus selama 210 atau 240 menit (Gambar 4). Hasil sekuensing menunjukkan bahwa tanda tangan nukleotida pendek berhasil diperoleh dari rebusan.

Survei Pasar Pemalsuan melalui Tanda Tangan Nukleotida dan Primer Spesifik

Metode di atas diterapkan untuk mendeteksiCistanchesProduk herbal di pasaran. Tiga puluh lima batchCistanchesIrisan, bubuk, dan ekstrak herba diamplifikasi dan diurutkan dengan menggunakan enam primer spesifik yang dirancang (hasil elektroforesis gel agarosa ditunjukkan pada Gambar Tambahan S2 dan urutannya tercantum dalam Lembar Data Tambahan 1). Analisis urutan melalui tanda tangan nukleotida mereka mengungkapkan bahwa lima kumpulan irisan itu asli. Satu batch irisan dan satu batch bubuk diganti dengan Cy. songaricum dan satu ekstrak diganti dengan Ci. sinensis. Enam batch bubuk lainnya adalah campuran: lima dipalsukan dengan Cy. songaricum dan Ci. sinensis dan satu dipalsukan dengan Cy. songaricum (Tabel 1). Selain itu, satu batch irisan diganti dengan Salvia miltiorrhiza.

Cistanches Herba dalam obat paten Cina mengalami berbagai proses yang membuat otentikasi menjadi sulit. Kemampuan enam pasangan primer untuk memperkuat daerah tanda tangan nukleotida spesifik spesies dari obat paten Cina diuji (hasil elektroforesis gel agarosa ditunjukkan pada Gambar Tambahan S2). Sebagian besar obat paten Cina mengandung komponen dari berbagai jenis spesies. Misalnya, pil Shihu Yeguang (ZCY34) mengandung 25 bahan, termasuk Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu), dan Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Dari bahan-bahan tersebut, Cistanches Herba dapat diamplifikasi secara khusus melalui pasangan primer GHRCF/GHRCR. Urutan langsung produk PCR mengungkapkan jejak yang sangat bersih. Namun, pita yang terlihat tidak dapat diperoleh dengan pasangan primer HMRCF/HMRCR.

Contoh lain adalah pil Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Ada delapan bahan selainCistanchesHerba dalam obat paten Cina ini, tetapi tidak ada pita yang terlihat yang diperoleh baik oleh GHRCF/GHRCR atau HMRCF/HMRCR, yang berarti tidak adaCistanches Herbahadir. Namun, wilayah pezina Cy. songaricum berhasil diamplifikasi oleh pasangan primer spesifik SYF1/SYR1. Hasil sekuensing menunjukkan tanda tangan nukleotida pendek dari Cy. songaricum berhasil diperoleh.

Bentengmemiliki banyak fungsi dan memilikiantiinflamasiefek