BAGIAN 1 Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight Extract Meningkatkan Kinerja Hindlimb Dan Melemahkan Ekspresi Myosin Heavy Chain IId/IIx pada Tikus yang Diimobilisasi

Untuk informasi lebih lanjut silahkan hubungi:{0}}

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Jepang 2Department of Japanese Oriental Medicine, Graduate School of Medicine and Pharmaceutical Sciences, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama {{5 }}, Jepang

Korespondensi harus ditujukan kepada Chihiro Tohda; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Diterima 14 Juni 2019; Direvisi 13 September 2019; Diterima 17 September 2019; Diterbitkan 22 Oktober 2019

Editor Akademik: Wen-yi Kang

Hak Cipta © 2019 Yoshiyuki Kimbara dkk. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun asalkan karya asli dikutip dengan benar.

Atrofi otot rangka ditemukan dalam banyak kondisi klinis, tetapi pengobatan farmakologis belum ditetapkan.Cistanche tubulosa(Schenk) Wight adalah obat herbal yang digunakan dalam pengobatan tradisional Jepang dan Cina. Dalam studi saat ini, kami menyelidiki efek dariC. ekstrak tubulosa(CTE) pada otot yang mengalami atrofi in vivo. Kami juga menyelidiki imobilisasi gips belakang pada tikus dan merancang tipe baru gips imobilisasi belakang, yang terdiri dari pita seperti spons dan tabung plastik tipis. Dengan menggunakan metode ini, 3 dari 4 kelompok tikus (n 11 untuk setiap kelompok) diimobilisasi di bagian belakang dan diberikan CTE atau kendaraan selama 13 hari. Prosedur palsu dilakukan pada tikus dari kelompok keempat yang diberikan kendaraan. Selanjutnya, otot trisep surae (TS) dipotong. Untuk menganalisis efek sistem cor baru dan pemberian CTE pada atrofi otot, kami mengevaluasi berat basah TS dan luas penampang myofiber (CSA). Kami juga menentukan tingkat ekspresi MyHC IId/IIx dengan western blotting, karena peningkatannya merupakan ciri dari atrofi otot yang tidak digunakan, menunjukkan pergeseran tipe myofiber yang lambat ke cepat. Selain itu, kami melakukan dua tes kinerja kaki belakang. Metode imobilisasi cor baru secara signifikan mengurangi berat basah TS dan myofiber CSA. Ini disertai dengan penurunan fungsi kaki belakang dan peningkatan ekspresi MyHC IId/IIx. Pemberian CTE tidak mengubah berat basah TS atau myofiber CSA; namun, itu menunjukkan tren perbaikan hilangnya fungsi kaki belakang dan penekanan peningkatan ekspresi MyHC IId/IIx pada tikus yang diimobilisasi. Metode imobilisasi gips belakang baru kami secara efektif menginduksi atrofi otot. CTE tidak mempengaruhi massa otot tetapi menekan pergeseran dari tipe myofiber lambat ke cepat pada tikus yang diimobilisasi, memperbaiki penurunan fungsi tungkai belakang.

Cistanche deserticola memiliki banyak efek, klik di sini untuk tahu lebih banyak

1. Perkenalan

Kondisi patofisiologi yang terkait dengan atrofi otot rangka termasuk sarkopenia [1], cachexia [2], dan atrofi otot rangka yang diinduksi glukokortikoid [3]. Atrofi otot rangka juga disebabkan oleh tidak digunakan dalam waktu lama [4], yang dapat disebabkan oleh tirah baring [5], penggunaan gips untuk pengobatan fraktur atau cedera ligamen [6], atau spacefight [7]. Karena berbagai penyakit dapat menyebabkan kondisi ini, kondisi ini mempengaruhi sebagian besar populasi.

Latihan yang memadai dan terapi nutrisi sangat penting untuk mengobati atrofi otot [8]. Selain itu, beberapa penelitian telah melaporkan bahwa tindakan pencegahan farmakologis, termasuk modulator reseptor androgen selektif, antibodi monoklonal manusia terhadap myostatin, dan agonis reseptor ghrelin selektif, efektif [9]; namun, pendekatan ini belum ditetapkan.

Kondisi atrofi otot yang dijelaskan di atas disertai dengan pergeseran profil tipe myofiber dan pengurangan massa otot. Tidak digunakannya otot yang disebabkan oleh hilangnya pengaruh saraf dan pelepasan mekanis menginduksi pergeseran tipe myofiber yang lambat ke cepat, dan perubahan profil isoform rantai berat myosin (MyHC), ditandai dengan peningkatan level ekspresi MyHC IId/IIx [11, 12]. Pergeseran tipe myofiber yang cepat ke lambat justru diinduksi oleh pemberian glukokortikoid, cachexia, sepsis, dan faktor lainnya [10].

Bentengadalah obat herbal yang berasal dariDeserticola CistancheYC Bu,C. tubulosa(Schenk) Wight, atau C. salsa (CA Mey) Beck, menurut farmakope Jepang [13]. Dalam pengobatan tradisional Jepang (Kampo) dan Cina, digunakan untuk mengobati "sindrom defisiensi ginjal", yang ditandai dengan infertilitas, kelemahan otot sistemik (terutama di punggung dan tungkai bawah), dan kelemahan tulang [14, 15]. Hal ini diketahui mengandung berbagai konstituen, termasuk acteoside, echincoside, dan isoacteoside [16]. Ekstrak ramuan ini, atau kandungan kimianya, telah menunjukkan efek kardio, hepato-, dan neuroprotektif; antipenuaan, antifatigue, vasodilatasi, dan efek afrodisiak; aktivitas antioksidan dan anti-inflamasi; dan kemampuan untuk meningkatkan memori dan pembelajaran [15, 16]. Namun demikian, khasiat ramuan ini untuk mencegah atau mengobati penyakit pengecilan otot belum dikonfirmasi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menyelidiki efek dariC. tubulosaekstrak (CTE) sebagai pengobatan untuk atrofi otot.

Untuk tujuan ini, kami menggunakan imobilisasi gips belakang untuk menginduksi atrofi otot pada tikus, dengan fokus, khususnya, pada bahan yang digunakan dalam gips. Berbagai sistem cor telah dilaporkan, termasuk plester gips Paris [17], gips fiberglass [18], tabung mikrosentrifugasi polipropilen [19], perangkat seperti pakaian penahan yang terbuat dari kapas dan jaring baja [20], pipet plastik dengan proksimal bantalan spons [21], gips yang terbuat dari pita perban non-elastis dan kawat baja berlapis vinil [22], penyisipan kawat yang dikombinasikan dengan pelat logam [23], dan penggunaan stapler kulit bedah [24]. Gips yang ideal harus minimal invasif dan nontraumatik untuk menghindari perubahan inflamasi karena inflamasi dapat menginduksi atrofi otot [25]. Selain itu, tes kinerja kaki belakang dengan gips harus dimungkinkan pada tahap akhir percobaan. Selain itu, pemeran harus mudah ditangani tanpa pengetahuan atau keterampilan khusus; itu harus ringan, murah, mudah dibeli, dan tidak memerlukan perangkat khusus untuk aplikasi dan penghapusan.

Model hewan yang berbeda dari pengecilan otot telah dilaporkan. Pembongkaran tungkai belakang telah sering digunakan [11, 12] tetapi memiliki beberapa masalah, termasuk nekrosis ekor, yang dapat menyebabkan inflamasi sistemik [25]; deviasi cairan tubuh ke sisi kaudal, mengakibatkan kelainan pada pembuluh darah tungkai belakang [26]; gayaberat mikro yang luar biasa pada tungkai belakang, yang dapat sangat mempengaruhi ekspresi protein, termasuk enzim mitokondria [27]. Semua faktor ini dapat mempengaruhi perjalanan pengecilan otot. Sebuah metode yang berbeda menginduksi atrofi otot dengan menghilangkan otot input saraf (misalnya, melalui transeksi saraf sciatic) [28]; karena otot tunduk pada faktor trofik dari neuron terminal [29], metode ini, yang mengarah pada status denervasi hampir total yang tidak biasa, dapat mengubah proses atrofi otot. Hewan yang mengalami gangguan sistemik yang menyebabkan atrofi otot, seperti diabetes mellitus [30], gagal ginjal [31], pemberian kortikosteroid [32], dan penuaan atau penuaan yang dipercepat [33, 34], dapat digunakan sebagai model manusia. penyakit; Namun, kondisi sistemik ini juga dapat mengganggu proses atrofi otot.

Jadi, kami memilih imobilisasi gips belakang untuk menginduksi atrofi otot, dan kami berusaha membuat metode baru untuk melakukannya pada tikus, di mana kami menyelidiki efek CTE pada atrofi otot.

BentengMakanan Suplemen MakananGinjalPenyakitdanmeningkatkanKekuatan

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan dan Ekstraksi Tanaman.

CTE diakuisisi dari Alps Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Hida, Gifu, Jepang).

Batang berdaging C. tubulosa dikumpulkan dari Shinjang Uyghur Aptonom Rayon, Republik Rakyat Cina. Sebanyak 193 kg serbuk campuran C. tubulosa direndam dalam 1.883 l etanol 30 persen. Campuran direfluks selama 2 jam pada 55-64 derajat. Hasil ekstrak 7,2 persen dan mengandung 3,36 persen acteoside dan 12,72 persen echincoside.

2.2. tikus.

Tikus jantan dewasa ddY (12 minggu) (SLC Jepang, Shizuoka, Jepang) ditempatkan secara terpisah di kandang plastik dan dipelihara pada siklus terang/gelap 12-h dalam vivarium yang diatur suhu (25 ± 2 derajat). Semua hewan diizinkan ad libitum akses ke air dan makanan (saham Labo MR; Nosan Corporation, Yokohama, Kanagawa, Jepang).

Semua eksperimen dan protokol hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Kampus Sugitani Universitas Toyama. Nomor persetujuan untuk eksperimen hewan adalah A2016INM-3. Semua upaya dilakukan untuk meminimalkan jumlah hewan yang digunakan.

2.3. Induksi Atrofi Otot Kaki Belakang dan Pemberian CTE.

Mencit dibagi menjadi 4 kelompok (n 11 per kelompok): pada hari ke-2, semua mencit dibius, dan rambutnya dicabut dari paha hingga pergelangan kaki dengan krim obat menghilangkan rambut (krim Epilat; Kracie, Tokyo, Jepang). Selanjutnya, 3 dari 4 kelompok gips ( plus ) kelompok gips sesuai dengan prosedur berikut, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1(a)-1(g):

Langkah 1. Potong pita penyegel busa karet EPDM (Cemedine Corporation, Tokyo, Jepang) menjadi strip 12 8 25 mm (Gambar 1(a)).

Langkah 2. Pegang kaki belakang di posisi plantar pergelangan kaki dan bungkus dengan sangat lembut di sendi pergelangan kaki dengan selotip (Gambar 1(b)).

Langkah 3. Potong tutup insulasi PVC lembut TIC-22 (Nichifu Corporation, Osaka, Jepang), dan tutupi pita segel cuff. Gunakan selotip dua sisi (PRO SELF selotip dua sisi yang dipotong J-1300; Nitoms Inc., Tokyo, Jepang) untuk membuatnya merekat (Gambar 1(c)).

Langkah 4. Kumpulkan ujung-ujung topi yang dipotong; potong pita perekat kinerja tinggi tahan air (pita listrik; Asahipen Corporation, Osaka, Jepang) hingga kira-kira. 4 48 mm dan kencangkan ujung yang terkumpul (Gambar 1(d)).

Langkah 5. Letakkan sepotong kecil (kira-kira 5 30 mm) pita aluminium foil (AL-30; Nichiban Corporation, Tokyo, Jepang) di sisi depan ujung atas tutup (Gambar 1 (e)).

Langkah 6. Potong pita plastik (pita isolasi listrik vinil no. 21; Nitto Denko Corporation, Osaka, Jepang) menjadi kira-kira. 19 × 40 mm, dan bungkus tutupnya (Gambar 1(f )).

Langkah 7. Lakukan prosedur yang sama pada kaki belakang kontralateral (Gambar 1(g)).

Periode imobilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah 13 hari, dan gips diganti jika satu atau lebih dari kondisi berikut terjadi: edema pedal parah, nekrosis kaki belakang, ulserasi kulit yang parah, gips yang longgar karena kerusakan, atau dislokasi gips dari pergelangan kaki. Pada kelompok yang tersisa, hanya pencabutan dilakukan (prosedur palsu), dan kendaraan (garam fisiologis) diberikan selama 13 hari dari hari setelah pencabutan (hari 2). Di antara 3 kelompok gips ( plus ), 2 diberikan CTE (50 dan 100 mg/kg/hari; kelompok gips ( plus )/CTE-50 dan kelompok gips ( plus )/CTE-100), dan satu diberikan kendaraan (gips (plus)/kelompok kendaraan), juga dari hari 2. CTE dilarutkan ke dalam salin fisiologis dan diberikan setiap hari melalui gavage oral selama 13 hari.

2.4. Evaluasi Fungsi Tungkai Belakang dan Kekuatan Otot Tungkai Belakang.

Pada hari ke-14, mencit kelompok gips (plus) dibius kembali setelah pemberian CTE, dan gips dilepas. Hari berikutnya (hari ke-15), semua tikus diuji fungsi tungkai belakang dan kekuatan ototnya, menggunakan dua tes berikut:

2.4.1. Pengukuran Kecepatan Berjalan.

Sebuah platform kayu persegi lebar 15 mm dipegang secara horizontal kira-kira 50 cm dari tanah. Tikus kemudian diletakkan di atas platform, dan kecepatan berjalan dinilai saat hewan melintasi platform dengan merekam secara manual menggunakan stopwatch waktu untuk berjalan sejauh 50 cm. Sebelumnya, setiap tikus telah dibiasakan ke platform dengan melintasinya dua kali sebagai sesi pelatihan.

2.4.2. Uji Kesalahan Kaki.

Untuk mengevaluasi kekuatan otot tungkai belakang, kami melakukan "uji kesalahan kaki", di mana setiap tikus ditempatkan pada platform lagi, dan jumlah slip kaki belakang dari platform ditabulasi. Tes ini adalah versi modifikasi dari uji batang statis, di mana batang udara difiksasi menggunakan G-clamp, dan tikus dibuat untuk melintasinya [35]. Pengujian foot-fault dilakukan tiga kali, dan jumlah rata-rata footfalls di tiga sesi dicatat. Ada interval istirahat setidaknya 15 menit antara sesi.

2.5. Analisis Histologis dan Morfometrik Otot Triceps Surae.

Setelah evaluasi fungsi tungkai belakang, tikus dibius dan di-eutanasia dengan perfusi salin fisiologis. Selanjutnya, otot trisep surae (TS) dipotong dari kedua sisi tungkai belakang; sampel dari tungkai belakang kiri difiksasi dalam 4 persen paraformaldehida dalam larutan PBS selama 24 jam, kemudian dipindahkan ke dalam larutan sukrosa 30 persen dalam PBS, dan diinkubasi untuk cryoprotection dan cryosectioning. Setelah ini, bagian setebal 12-μm dipotong sepanjang sumbu minor dari daerah perut tengah setiap otot menggunakan cryostat (Leica 3050S; sistem Leica, Nußloch, Jerman). Tujuh sampai sepuluh bagian berurutan dipasang pada slide kaca berlapis antistrip (MAS-GP Tipe A, Industri Kaca Matsunami, Osaka, Jepang), segera dikeringkan menggunakan pengering rambut, disimpan pada suhu 30 derajat, dan diwarnai dengan pewarnaan hematoxylin-eosin (pewarnaan HE , Laboratorium ScyTek, Logan, Utah, Amerika Serikat). Satu bagian representatif per hewan, di mana irisan sumbu pendek setiap myofiber terlihat jelas, dipilih, dan luas penampang (CSA) diukur menggunakan Image J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Amerika Serikat) .

2.6. Blot Barat.

Total protein dari TS kanan diekstraksi dengan metode berikut. TS yang tepat dicincang menggunakan gunting dan segera dibekukan dalam nitrogen cair, disimpan pada suhu 30 derajat , dan kemudian dihomogenkan untuk membuat lisat jaringan. Otot-otot yang dicairkan diinkubasi sedingin es selama 30 menit dalam 2 mL larutan ekstrak protein mamalia M-PER (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA) dan kemudian dihomogenisasi. Homogenat kemudian disentrifugasi pada 4 derajat dan 4000 g selama 10 menit, dan supernatan dikumpulkan.

10 ug protein total di setiap lisat otot dimuat dan dipisahkan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE), diikuti dengan transfer listrik ke membran nitroselulosa (0.2 m, # 1620112, Laboratorium Bio-Rad, Hercules, California, Amerika Serikat). Ikatan non-spesifik diblokir dengan 5 persen susu kering tanpa lemak (susu bubuk skim, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jepang) dalam larutan salin Tris dengan 0,05 persen Tween 20 (TBS-T). Membran kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 derajat dengan antibodi primer yang dilarutkan dalam larutan penambah reaksi imun Can Get Signal 1 (Toyobo, Osaka, Jepang). Setelah diaduk dan dibilas dengan TBS-T, membran diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan antibodi sekunder terkonjugasi horseradish peroxidase- (HRP-) yang diencerkan dalam larutan penambah reaksi imun Can Get Signal 2 (Toyobo, Osaka, Jepang). Sinyal pada membran dideteksi melalui electrochemiluminescence menggunakan luminol. Analisis densitometri kemudian dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak CS Analyzer (Atto, Tokyo, Jepang). Antibodi dipilih dan diencerkan sebagai berikut: antibodi monoklonal anti-MyHC IId/IIx tikus (1 : 1000, klon A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, Amerika Serikat), anti-GAPDH tikus loading control antibodi monoklonal (1: 3500, G041 ABM, Vancouver, Kanada), dan antibodi sekunder poliklonal H&L antimouse kambing terkonjugasi HRP H&L (1: 2000, Abcam, Cambridge, Inggris).

2.7. Analisis Statistik.

Semua hasil dinyatakan sebagai mean ± standard error of mean (SEM). Signifikansi statistik dari perbandingan antar kelompok diverifikasi dengan ANOVA satu arah dan uji post hoc Dunnett atau uji HSD Tukey; uji Kruskal–Wallis dan uji post hoc Dunn; atau ANOVA dua arah dengan pengukuran berulang dan uji post hoc Dunnett. Tes Smirnov-Grubb digunakan untuk mengecualikan outlier. Untuk semua evaluasi statistik, nilai p kurang dari 0.05 dianggap signifikan secara statistik, dan semua analisis dilakukan menggunakan GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, California, Amerika Serikat).

BentengSuplemen Makanan Anti Penuaan dan Meningkatkan Kekuatan

3. Hasil

3.1. Kesehatan Hewan dan Pengaruh CTE terhadap Berat Badan.

Dalam tampilan visual, bagian belakang tikus yang diimobilisasi semuanya atrofi, dibandingkan dengan tikus yang digips ( )/kelompok kendaraan. Imobilisasi gips mengakibatkan penurunan berat badan yang signifikan pada akhir fase penelitian. Sebaliknya, perubahan berat badan tidak signifikan pada tikus gips ( ) / kelompok kendaraan. Kedua kelompok gips ( plus )/CTE tidak menunjukkan perubahan berat badan yang signifikan jika dibandingkan dengan kelompok gips ( plus )/kendaraan (Gambar 2).

Komplikasi parah pada bagian belakang tikus yang tidak dapat bergerak, seperti nekrosis kulit atau gangren, tidak diamati dan juga tidak ada perilaku abnormal di vivarium. Namun, komplikasi ringan, termasuk edema kaki, ulserasi kulit superfisial, dan rubor pada tungkai belakang, terlihat pada semua tikus yang diimobilisasi (Gambar 1(h)). Melonggarnya dan dislokasi gips, yang menyebabkan penggantian gips, juga diamati dalam banyak kasus.

3.2. Pengaruh CTE pada Kekuatan Otot dan Performa Otot.

Kelompok gips ( plus )/kendaraan menunjukkan peningkatan jumlah slip kaki belakang yang signifikan dalam uji kesalahan kaki (Gambar 3(a)), dan kecepatan berjalan secara signifikan lebih lambat dibandingkan dengan kelompok gips ( )/kendaraan (Gambar 3(b). )).

Perawatan CTE menghasilkan kecenderungan yang bergantung pada dosis terhadap penurunan hindlimb slip. Pada kelompok gips ( plus )/CTE-100, perlakuan cenderung mengurangi (p 0.0604) hindlimb slip bila dibandingkan dengan kelompok gips ( plus )/kendaraan (Gambar 3(a)). Untuk kecepatan gait, baik kelompok cast ( plus )/CTE-50 dan cast ( plus )/CTE-100 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam kecepatan gait dibandingkan dengan cast ( plus )/ kelompok kendaraan, meskipun ada adalah tren ketergantungan dosis yang kecil dan tidak signifikan menuju kecepatan yang lebih cepat (Gambar 3(b)).

3.3. Berat Basah TS dan Myofiber CSA.

Berat basah TS secara signifikan menurun dengan imobilisasi gips bila dibandingkan dengan gips ( ) / kelompok kendaraan (Gambar 4 (a)). Pemberian CTE tidak mempengaruhi berat basah TS.

CSA myofiber rata-rata pada setiap kelompok juga dianalisis. Pada kelompok gips ( plus )/kendaraan, ditemukan penurunan yang signifikan pada myofiber CSA dibandingkan dengan kelompok gips ( )/kendaraan (Gambar 4(b)). Myofiber CSA diklasifikasikan lebih lanjut dan dianalisis dengan distribusi frekuensi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4(c). Kelas CSA yang paling sering terjadi pada kelompok gips ( )/kendaraan lebih besar daripada di kelompok gips ( plus )/kendaraan; persentase serat tipis di kelas CSA 1350- 2250 m2, atau cenderung, secara signifikan lebih tinggi pada kelompok gips ( )/kendaraan daripada di kelompok gips ( plus )/kendaraan, dan tren yang berlawanan tampak jelas pada kelompok gips ( )/kendaraan grup CSA 0 900 m2 (Gambar 4(c)). Distribusi CSA tidak dipengaruhi oleh pemberian CTE pada dua kelompok gips ( plus )/CTE, dibandingkan dengan kelompok gips ( plus )/kendaraan (Gambar 4(c)). Gambar myofiber representatif ditunjukkan pada Gambar 4 (d).

3.4. Pengaruh CTE pada Tingkat Ekspresi MyHC IId/IIx di TS.

Western blotting dilakukan dalam enam sampel yang representatif dari masing-masing kelompok (Gambar 5(a)). Sampel-sampel ini dipilih berdasarkan turunannya dari hewan yang menunjukkan kinerja uji kesalahan kaki yang paling dekat dengan nilai rata-rata untuk masing-masing kelompok.

Pada kelompok gips ( plus )/kendaraan, MyHC IId/IIx meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok gips ( )/kendaraan. Peningkatan ini bergantung pada dosis yang ditekan oleh pemberian CTE. Pada kelompok pemeran ( plus )/CTE-100, ekspresi MyHC IId/IIx cenderung menurun dibandingkan dengan kelompok pemeran ( plus )/kendaraan (p 0.0810) (Gambar 5(b)) . Ekspresi GAPDH, yang digunakan sebagai kontrol internal, tidak berbeda secara signifikan antar kelompok (Gambar 5(c)).

Bentengtubulosa memiliki banyak efek