BAGIAN 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide Menghambat Keropos Tulang yang diinduksi OVX pada Tikus Dan Osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL
Mar 02, 2022
Perkenalan
Osteoporosis—penyakit yang ditandai dengan penurunan massa tulang, struktur mikro jaringan tulang abnormal, peningkatan kerapuhan tulang, dan patah tulang (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006)— saat ini mempengaruhi lebih dari 200 juta orang di seluruh dunia dan menghadirkan beban medis dan sosial ekonomi yang substansial pada masyarakat modern (Strom et al., 2011). Pengobatan klinis osteoporosis terutama berfokus pada penggantian hormon, bisphosphonate, atau terapi denosumab. Metode ini efektif tetapi menimbulkan efek samping jangka panjang seperti potensi risiko kanker payudara dan fraktur tulang paha atipikal (Hitam, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011). Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengeksplorasi obat-obatan yang tidak hanya dapat menghambatOsteoporosistetapi juga memiliki lebih sedikit efek samping yang tidak diinginkan.
Cistanche deserticola(CD), makanan tonik dan obat-obatan yang banyak digunakan di Cina, yang dikenal sebagai "ginseng gurun", adalah batang sukulen kering dengan daun sisikC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) dan memiliki beragam dan efektifFarmakologiKegiatan, seperti regulasi kekebalan tubuh, anti-oksidasi, dan anti-Osteoporosisproperti (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Studi sebelumnya tentang zat aktif CD pada pengobatan osteoporosis terutama berfokus padafenylethanoidGlikosida(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Namun, CD juga mengandung komponen efektif lainnya seperti iridoid, lignan,polisakarida(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Aplikasi klinis pengobatan tradisional Tiongkok (TCM) terutama decocting air.Polisakaridaadalah komponen yang larut dalam air dan kemungkinan besar akan menjadi komponen farmakodinamik utama TCM. Polisakarida yang diekstrak dari TCM secara liar dilaporkan memiliki anti-Osteoporosisefek dan beberapa efek samping yang tidak diinginkan, yang umumnya telah digunakan di klinik (misalnya, polisakarida yang diekstrak dari Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018), dan Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwaCistanche deserticolaPolisakarida(CDP) yang diekstrak dari CD mungkin merupakan obat yang berpotensi aman untuk pengobatan osteoporosis.
Biasanya, resorpsi tulang dan pembentukan tulang mempertahankan keseimbangan dinamis selama remodeling tulang dalam koordinasi dengan beberapa jenis sel, termasuk osteoklas, osteoblas, sel lapisan tulang, dan osteosit (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Putusnya keseimbangan ini dapat mengakibatkan berbagai penyakit metabolisme tulang, sepertiOsteoporosis(Zhu et al., 2018) dan osteosklerosis (Ihde et al., 2011). Osteoklas, sebagai sel yang dibedakan akhir yang berasal dari garis keturunan mononuklear/makrofag, adalah satu-satunya sel dengan fungsi resorpsi tulang (Teitelbaum, 2000). Ada dua sitokin kunci yang berpartisipasi dalam diferensiasi dan pematangan osteoklas (Koga et al., 2004): faktor perangsang koloni makrofag (M-CSF) dan aktivator reseptor faktor nuklir κB (NF-κB) ligan (RANKL). M-CSF memediasi diferensiasi sel induk hematopoietik menjadi nenek moyang osteoklas dan mempromosikan diferensiasi osteoklas dengan mengatur ekspresi reseptor RANK (Takayanagi, 2007). Pengikatan RANKL dan RANK pada permukaan sel osteoklas menghasilkan hal-hal berikut: (1) perekrutan molekul adaptor pensinyalan seperti TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6); (2) aktivasi beberapa target hilir, termasuk NF- κB dan mitogen-activated protein kinases (MAPK); dan (3) upregulasi tingkat ekspresi faktor nuklir sel-T yang diaktifkan, sitoplasma 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktivasi jalur pensinyalan ini secara langsung mengatur ekspresi gen osteoklas, termasuk asam fosfatase 5 (Acp5) [pengkodean asam fosfatase resisten tartrat (TRAcP)], matriks metalloproteinase 9 (MMP9), dan cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Oleh karena itu, penghambatan jalur pensinyalan terkait diferensiasi osteoklas yang diinduksi RANKL adalah metode terapi potensial untuk osteoporosis.
Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menentukan efek pengobatan CDP pada ovariektomi (OVX)-inducedOsteoporosismodel mouse in vivo dan pada aktivitas osteoklas yang diinduksi RANKL secara in vitro, dengan fokus pada ekspresi gen spesifik osteoklas dan aktivasi NFATc1 dan jalur pensinyalan NF-κB dan MAPKs. Temuan kami dapat memberikan wawasan baru tentang potensi CDP sebagai obat yang aman dan efektif untuk mengobati osteoporosis.
Untuk informasi lebih lanjut silakan hubungi:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Bahan dan metode
2.1. Bahan kimia dan pengumpulan sampel
CD (no. 180801) dibeli dari Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Cina) dan diidentifikasi oleh Profesor Haibo Huang dari School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Cina. Tablet valerat Estradiol dibeli dari Bayer (Leverkusen, North-Rhine- Westphalia, Jerman). Media esensial minimal yang dimodifikasi alpha
(α-MEM) dan serum sapi janin (FBS) diperoleh dari Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penisilin/streptomisin dan kit pewarnaan TRAcP diperoleh dari Solarbio (Beijing, Cina). Mouse rekombinan M-CSF dan mouse rekombinan RANKL pro- sembuh dari R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Piring berlapis hidroksiapatit dibeli dari Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, AS). Antibodi utama untuk NFATc1 dan CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK, dan P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan- vers, MA, USA); dan β-aktin (CWBIO, Beijing, China) juga diperoleh. Reagen lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelas analitik, dan air dimurnikan oleh sistem pemurnian air Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
2.2. Ekstraksi CDP
CD itu digiling menjadi bubuk halus dan dicampur dengan petroleum eter tiga kali untuk mengalahkannya. Residu padat dikumpulkan dengan penyaringan dan kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Sipolisakaridadiekstraksi dari sampel yang telah diolah tiga kali dengan air selama 2 jam, terkonsentrasi, diendapkan dengan penambahan etanol anhidrat ke konsentrasi akhir 80% (v / v), dan disimpan pada 4 ◦C selama 24 jam. Endapan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 menit, dilarutkan dalam air suling, dan dimurnikan (penghilangan protein bebas) menggunakan metode Sevag (Zhao et al., 2019). Yang pulihpolisakaridadialisis, dikeringkan, dan disimpan sampai digunakan lebih lanjut. Selanjutnya, hasil komposisi kimia menunjukkan bahwa kandungan total gula, asam uronat, sulfat, dan protein CDP sebesar 67,63 0,98%, 21,05 0,49%, 1,90 0,24%, dan 8,81 0,36%.
Komposisi monosakarida dan analisis inframerah transformasi Fourier dari CDP ditunjukkan pada Gambar Tambahan 1 dan 2.
2.3. Model tikus osteoporosis yang diinduksi OVX
Semua percobaan hewan disetujui oleh Komite Etika Hewan dari Universitas Pengobatan Tiongkok Guangzhou (disetujui SYXK 2019-0202). Tiga puluh tikus C57BL/6 betina berusia tiga puluh 6 minggu dipasok oleh Pusat Hewan Percobaan universitas pengobatan Tiongkok Guangzhou. Setelah aklimatisasi selama 1 minggu, satu kelompok tikus diberi operasi palsu (kelompok Sham), sedangkan tikus yang tersisa menjadi sasaran operasi ovariektomi (kelompok OVX). Setelah operasi, tikus-tikus itu dibiarkan pulih selama 1 minggu. Kemudian, tikus yang berhasil dimodelkan secara acak dibagi menjadi 5 kelompok, dengan 6 tikus per kelompok:
(1) Kelompok palsu: diolah dengan air suling, (2) kelompok OVX: diolah dengan air suling, (3) kelompok OVX E2 (E2): diolah dengan 0,13 mg/kg tablet valerat estradiol, (4) kelompok dosis rendah CDP OVX (CDP-L): diobati dengan 300 mg/kg CDP, (5) kelompok dosis tinggi CDP OVX (CDP- H): diobati dengan 600 mg/kg CDP. Air suling, E2, atau CDP diberikan oleh gavage sekali sehari. Semua tikus dikorbankan setelah periode perawatan 12 minggu (Gbr. 1A). Rahim dikumpulkan dan ditimbang, dan tibia kiri dikumpulkan untuk pemeriksaan selanjutnya. Sampel darah utuh dikumpulkan dan disentrifugasi pada 5000 rpm untuk
15 menit pada 4 ◦C. Supernatan serum disedot dan disimpan di
—80 ◦C sampai analisis lebih lanjut.
2.4. Analisis micro-computed tomography (micro-CT) dan histomorfometri tulang
Tibia kiri diperbaiki dengan 4% paraformaldehyde selama 48 jam dan kemudian ditempatkan dalam tabung centrifuge yang mengandung saline normal. Sampel tetap dipindai dengan instrumen micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgia) menggunakan pengaturan berikut: tegangan, 80 kV; sumber saat ini, 100 μA; Al, filter 0, 5 mm; pixel
ukuran, 9, 76 μm; dan langkah rotasi, 0,6◦. Beberapa parameter dari
tulang trabekular, termasuk kepadatan mineral tulang (BMD), fraksi volume tulang (BV/TV), permukaan tulang per volume total (BS/TV), bilangan trabekular (Tb. N), dan jarak trabekular (Tb. Sp) diukur menggunakan perangkat lunak CT-Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Gambar tiga dimensi dihasilkan menggunakan perangkat lunak CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).
Setelah analisis micro-CT, tibias kiri didekalsifikasi dalam larutan EDTA 14% dan tertanam ke dalam parafin untuk penampang. Sampel diiris menjadi bagian 5 μm menggunakan mikrotom sebelum percobaan pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) dan TRAcP. Bagian bernoda diperiksa dan didokumentasikan menggunakan lingkup mikro Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Jepang).
Cistanchedapat meningkatkan kepadatan tulang dan meredakan osteoporosis
2.5. Analisis serum
Konsentrasi kalsium (Ca) dan fosfor (P) ditentukan sesuai dengan instruksi kit yang dirancang oleh Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina). Tingkat TRAcP-5b dan RANKL dalam serum dianalisis menggunakan kit ELISA TRAcP-5b (CUSABIO, Wuhan, China) dan kit RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China), masing-masing.
2.6. Uji osteoklastogenesis in vitro
BBMM diisolasi dari tibia dan tulang paha tikus C57BL/6 betina berusia 6 minggu. Sel-sel yang diisolasi dikultur dalam media α-MEM yang mengandung 25 ng/mL M-CSF, 10% FBS, dan 1% penisilin/streptomisin. Setelah mencapai pertemuan, BBMM (1.104 sel/sumur) diunggulkan dalam pelat 96 sumur dan diolah dengan CDP dengan adanya 50 ng/mL RANKL. Media dan CDP diganti setiap 2 hari. Setelah 7 hari, sel-sel diperbaiki dengan paraformaldehyde 4% dan diwarnai untuk keberadaan TRAcP. Jumlah osteoklas, didefinisikan sebagai sel positif TRAcP dengan tiga atau lebih inti, dihitung dan didokumentasikan menggunakan mikroskop cahaya.
2.7. Uji proliferasi sel
BBMM (1 × 104 sel/sumur) diunggulkan dalam pelat 96 sumur dan diinkubasi dalam semalam. Setelah ini, sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi CDP yang berbeda (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, dan 40 μg / mL) selama 48 jam. Pertemuan sel terdeteksi dan dianalisis menggunakan IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, AS), sistem pencitraan sel hidup dinamis jangka panjang dan real-time.
2.8. Uji resorpsi hidroksiapatit
BBMM (1.104 sel/sumur) diunggulkan dalam pelat berlapis hidroksiapatit, diolah dengan CDP pada konsentrasi yang ditunjukkan (0, 5, dan 10 μg/mL), dan dikultur dalam α-MEM lengkap yang berisi 25 ng/mL M-CSF dan 50 ng/mL RANKL. Setelah 7 hari, sel-sel dicuci dengan larutan pemutih 10% untuk menghilangkan komponen sel. Gambar area resorpsi hidroksiapatit ditangkap menggunakan IncuCyte ZOOM® dan dianalisis menggunakan perangkat lunak ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).
2.9. Isolasi RNA dan analisis real-time reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)
BBMM (1.105 sel/sumur) diunggulkan dalam pelat 6 sumur dan dirangsang dengan RANKL dan M-CSF dengan adanya CDP pada konsentrasi yang berbeda (0, 5, dan 10 μg/mL) selama 5 hari. Total RNA diisolasi dari sel atau jaringan tulang tikus menggunakan reagen TRIzol (Sigma- Aldrich). DNA komplementer disintesis dari RNA total 2 μg menggunakan kit transkripsase terbalik (TransGen Biotech, Beijing, Cina). Reaksi RT-qPCR disiapkan menggunakan PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) dan terdeteksi oleh sistem ABI 7500 (Applied
Biosistem, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, AS). Parameter bersepeda untuk PCR ditetapkan sebagai berikut: 95 ◦C selama 5 menit, diikuti oleh 40 siklus 95 ◦C untuk 15 detik, dan 60 ◦C selama 30 detik. Primer spesifik yang digunakan ditunjukkan pada Tabel 1, dan jumlah setiap gen target dinormalisasi menjadi GAPDH (pengendalian internal).
2.10. Analisis noda barat
BBMM (5.105 sel/sumur) diunggulkan dalam pelat 6 sumur. Untuk percobaan kursus waktu yang singkat, sel-sel diinkubasi sebelumnya dengan konsentrasi CDP yang berbeda (0, 5, dan 10 μg / mL) selama 1 jam, dan kemudian diobati dengan 50 ng / mL RANKL selama 30 menit. Untuk waktu yang lama, sel-sel dirangsang dengan 50 ng / mL RANKL pada hari ke 3, 5, dan 7 di hadapan CDP (0, 5, dan 10 μg / mL). Total protein diekstraksi menggunakan buffer lisis RIPA (CWBIO). Protein dipisahkan oleh 10% SDS-PAGE dan ditransfer ke membran PVDF. Membran diblokir dengan susu skim 5% pada suhu kamar selama 2 jam, diinkubasi dengan primer
antibodi semalaman pada 4 ◦C, dan kemudian dengan sekunder yang sesuai
antibodi selama 1,5 jam. Membran dikembangkan menggunakan reagen ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), dan gambar diambil menggunakan Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China).
Cistanchedapat meningkatkan kepadatan tulang
2.11. Deteksi translokasi NFATc1 menggunakan tes imunofluoresensi
BBMM diunggulkan ke dalam coverlip 12-sumur, dirangsang dengan RANKL dan M-CSF, dan diobati dengan CDP 10 μg/mL selama 5 hari. Sel-sel diperbaiki dengan 4% paraformaldehyde selama 15 menit, dicuci tiga kali dengan PBS, dan permeabilized dengan 0,1% Triton X-100 selama 10 menit. Sel-sel dicampur dengan serum kambing 10% (CWBIO) dan diinkubasi selama 2 jam. Selanjutnya, sel-sel diinkubasi dengan antibodi primer semalam pada 4 ◦C dan kemudian dengan antibodi sekunder anti-tikus kambing Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, AS) dalam gelap selama 1 jam. Coverlip dicuci dengan PBS, dipasang di Prolong Gold Antifade Reagent dengan 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar), dan
diperiksa menggunakan Zeiss LSM 800 dengan mikroskop confocal Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman).
2.12. Analisis statistik
Semua data eksperimen dianalisis menggunakan perangkat lunak statistik SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Data untuk studi hewan dan sel diekspresikan sebagai sarana ± SEM dan berarti ± SD, masing-masing. Hasilnya menggunakan analisis varians satu arah atau uji-t Siswa. Nilai p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">
Cistanchedapat mengurangiapoptosisdan meningkatkan tulangKepadatan
