Bagian 1 Efek Antidepresan Ekstrak Cistanche Tubulosa Pada Tikus Stres Kronis yang Tidak Dapat Diprediksi Melalui Pemulihan Homeostasis Mikrobiota Usus

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 dan Xiaobo Li1*

1 Sekolah Farmasi, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Cina, 2 Laboratorium Kunci Negara Obat Alami dan Biomimetik, Sekolah Ilmu Farmasi, Universitas Peking, Beijing, Cina

Bukti yang berkembang menunjukkan bahwa gangguan neuropsikiatri, seperti depresi, terkait dengan mikrobioma usus melalui sumbu usus-otak.Cistanches Herbaterkenal untuk pengobatan defisiensi "ginjal-yang" dalam pengobatan tradisional Tiongkok (TCM) dan telah digunakan untuk pengobatan penyakit neurodegeneratif dalam beberapa tahun terakhir. Dalam penelitian ini, model depresi yang diinduksi stres kronis yang tidak dapat diprediksi (CUS) didirikan untuk mengeksplorasi dampak dariCistanche tubulosaekstrak (CTE) pada tes perilaku, neurotransmiter monoamine, dan faktor neurotropik di hipokampus dan usus besar, komposisi mikrobiota usus, dan produksi asam lemak rantai pendek (SCFA). Selain itu, analisis korelasi digunakan untuk mengevaluasi hubungan fungsional antara perubahan mikrobiota usus, perubahan neurotransmiter dan neurotropin di hipokampus dan usus besar, dan konsentrasi SCFA yang terganggu. CTE secara signifikan meningkatkan perilaku seperti depresi pada tikus di bawah CUS. Tingkat otak 5-hydroxytryptamine (5-HT) dan ekspresi faktor neurotropik yang diturunkan dari otak (BDNF) pada tikus CUS dipulihkan oleh CTE. Kelimpahan relatif mikrobiota usus dan konsentrasi asetat dan asam heksanoat juga dapat dimodulasi oleh pengobatan CTE. Kami selanjutnya menunjukkan bahwa penerapan CTE pada tikus CUS menyebabkan korelasi yang kuat antara komposisi mikrobiota usus yang terganggu, tingkat neurotransmiter hippocampus, dan produksi SCFA metabolit neuroaktif. Secara keseluruhan, hasil ini mengidentifikasi CTE sebagai pengobatan potensial untuk gejala depresi dengan memulihkan homeostasis mikrobiota usus untuk gangguan sumbu mikrobiota-usus-otak, membuka jalan baru di bidang neuropsikofarmakologi.

Kata kunci: Cistanche tubulosa, antidepresan, stres kronis yang tidak dapat diprediksi, mikrobiota usus, sumbu mikrobiota-usus-otak

Untuk informasi lebih lanjut silahkan hubungi:{0}}

Cistanche deserticola memiliki banyak efek, klik di sini untuk tahu lebih banyak

PENGANTAR

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong dalam bahasa Cina) secara resmi tercatat sebagai batang sukulen kering dariDeserticola Cistanche(YC Ma) danCistanche tubulosa(Schrenk) dalam Komisi Farmakope Tiongkok (2015). Ini adalah obat Cina tradisional (TCM) yang terkenal untuk mengobati defisiensi ginjal, impotensi, infertilitas wanita, keputihan yang tidak sehat, metroragia yang banyak,

dan konstipasi pikun (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015). Studi sebelumnya telah mengungkapkan beberapa konstituen kimia utama dariCistanches Herba, termasuk glikosida fenilethanoid (PhGs), iridoid dan glikosida iridoid, lignan, alditol, oligosakarida, dan polisakarida. Analisis farmakologis telah menunjukkan bahwa Cistanches Herba menunjukkan berbagai aktivitas neuroprotektif, imunomodulator, anti-inflamasi, dan hepatoprotektif (Jiang dan Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhGs telah dianggap sebagai komponen aktif utama dari Cistanches Herba yang memiliki berbagai aktivitas farmakologis, seperti neuroprotektif, imunomodulator, anti inflamasi, hepatoprotektif, anti-oksidatif, dll. (Jiang dan Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbaawalnya dicatat dalam Pengobatan Herbal Klasik ("Shennong Bencao Jing" dalam bahasa Cina), sebuah buku terkenal tentang tanaman obat yang ditulis antara sekitar tahun 200 dan 250 M, sebagai "ramuan tinggi" yang dapat mengatur "lima galur (jeroan) dan tujuh (makan berlebihan, marah, lembab, dingin, khawatir, angin dan hujan, dan ketakutan) gangguan" (Huang, 1982). Saat ini Cistanches Herba diterima secara luas sebagai tonik herbal untuk kelemahan umum (Fu et al., 2017).C. tubulosakapsul glikosida (Memoregain®) digunakan untuk pengobatan penyakit Alzheimer (Guo et al., 2013). Sebuah sistem dopaminergik disfungsional adalah salah satu patogenesis kunci dari hipotesis depresi monoamina (Duman et al., 1997; Krishnan dan Nestler, 2008). Echincoside (salah satu PhGs) dan PhGs dariCistanche salsatelah ditemukan untuk melindungi neuron dopaminergik terhadap neurotoksisitas dopamin (DA) yang disebabkan oleh 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) yang dapat meningkatkan DA tingkat di striatum tikus C57 (Tian dan Pu, 2005; Geng et al., 2007). Selain itu, catalpol dan geniposide adalah dua iridoid representatif di Cistanches Herba, dan mereka telah ditemukan untuk memperbaiki perilaku seperti depresi yang diinduksi stres tak terduga (CUS) kronis melalui pemulihan disfungsi sumbu hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA) dan catalpol dapat meningkatkan regulasi otak diturunkan ekspresi faktor neurotropik (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Selain itu, publikasi terbaru memberikan bukti segar bahwa rebusan Cistanches Herba secara signifikan mengurangi periode imobilitas dalam uji suspensi ekor tikus, yang secara kuat menunjukkan bahwa Cistanches Herba memiliki potensi kualitas seperti antidepresan (WangD. et al., 2017).

Pengobatan tradisional Tiongkok menarik perhatian yang meningkat sebagai pengobatan depresi karena efek sampingnya yang relatif moderat (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Berbagai jenis TCM, seperti senyawa individu dari obat mentah (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg3, dan Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), bahan obat Cina tunggal (akar Panax ginseng, rimpang Acorus tatarinowii, dan Morinda officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016), dan ramuan TCM (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan, dan Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) telah dipelajari dan ditunjukkan secara mendalam untuk membalikkan atau mengurangi gejala seperti depresi. Misalnya, Kai-Xin-San ditemukan secara nyata meringankan gejala tikus depresi yang diinduksi CUS dengan meningkatkan jumlah neurotransmiter, faktor neurotropik, dan reseptor yang sesuai, dan mempromosikan ekspresi sinaptotagmin dan kepadatan tulang belakang dendritik (Yan et al. ., 2016).

Namun demikian, penelitian TCM sebelumnya mengandalkan hasil dalam tes perilaku seperti depresan dan fokus pada mekanisme aksi farmakologis konvensional. Hubungan antara kemanjuran antidepresan dari TCM yang diberikan secara oral dan mikrobiota usus tidak dipahami dengan baik. Bukti yang berkembang mendukung bahwa mikrobiota usus memainkan peran penting dalam mengatur fungsi otak, terutama depresi dan gangguan terkait stres lainnya (Foster dan Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Misalnya, stres kronis menghasilkan disregulasi struktur mikroba usus tikus, dengan penurunan rasio Firmicutes/Bacteroidetes, dan lebih khusus lagi, penurunan kelimpahan relatif Lactobacillus dan peningkatan Oscillibacter (Meng et al., 2017). Lebih lanjut, transplantasi tinja dari mikrobiota yang tidak teratur dari pasien depresi ke tikus bebas kuman memberikan fenotipe seperti depresi pada hewan-hewan ini, menunjukkan bahwa mikrobiota usus yang tidak teratur menyebabkan gejala perilaku dan fisiologis depresi dan kecemasan (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). Dalam percobaan hewan, beberapa modulator mikrobiota seperti probiotik dan prebiotik ditemukan meningkatkan perilaku seperti depresi pada tikus yang mengalami stres kronis dengan memperbaiki mikrobiota usus (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017 ).

Mengingat hubungan antara mikrobiota usus dan perkembangan penyakit, serta plastisitas struktur mikrobiota usus, kami memutuskan untuk menyelidiki efek mikrobiota usus untuk memediasi depresi menarik perhatian kami dan diselidiki (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Untuk mencapai hal ini, pengurutan gen 16S rRNA menggabungkan analisis Meta statistik (White et al., 2009) dilakukan untuk menganalisis komposisi mikrobiota usus. Dalam studi ini,C. tubulosadipilih untuk mengevaluasi efek seperti antidepresan karena memiliki tingkat PhG yang lebih tinggi dibandingkan denganC. deserticola. Model depresi yang diinduksi CUS tikus didirikan untuk mengeksplorasi dampak dariC. tubulosaekstrak (CTE, terdiri dari 48,6 persen PhG, 6,9 persen glikosida iridoid, dan 20,0 persen total sakarida) pada tes perilaku, neurotransmiter monoamine, dan faktor neurotropik di hipokampus dan usus besar, komposisi mikrobiota usus, dan produksi asam lemak rantai (SCFA). Selain itu, hubungan fungsional antara mikrobiota usus yang berubah mengubah neurotransmiter dan neurotrofin di hipokampus dan usus besar, dan konsentrasi SCFA yang terganggu dipelajari. Analisis korelasi digunakan untuk mendukung bukti bahwa CTE menargetkan mikrobiota usus untuk pengobatan depresi dengan memodulasi sumbu mikrobiota-usus-otak.

Bentengdapat meningkatkan kekebalan

BAHAN DAN METODE

Bahan:

Fluoxetine (FLX) dibeli dari Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Cina). Kit 5-hydroxytryptamine (5-HT), norepinephrine (NE), dan BDNF ELISA dibeli dari Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). Asetonitril tingkat HPLC dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Air deionisasi dibuat dari air suling menggunakan sistem pemurnian air Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, Amerika Serikat). Semua reagen dan bahan kimia lain yang digunakan adalah kelas analitis.

Batang keringC. tubulosadikumpulkan dari Kabupaten Hetian (Xinjiang, Cina). Sampel spesimen voucher diautentikasi oleh Prof. Xiaobo Li dan disimpan di herbarium School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China). Serbuk homogenC. tubulosabatang disuspensikan dalam sepuluh kali lipat etanol 70 persen, dan dipantulkan kembali dengan panas tiga kali, masing-masing selama 1 jam pada 100 derajat . Ekstrak disaring menggunakan kain kasa, diuapkan di bawah vakum pada 65 derajat dan diliofilisasi. Sampel dilarutkan kembali kemudian dipisahkan dengan resin makropori D101. Setelah adsorpsi, fraksi yang dielusi dengan air dibuang. CTE diperoleh setelah dielusi dengan etanol 40 persen, kemudian diuapkan di bawah vakum pada 65 derajat dan diliofilisasi.

Analisis Komposisi Kimia CTE

Kandungan relatif PhGs dalam CTE ditentukan dengan spektrofotometri UV pada 330 nm menggunakan echinacosida sebagai standar. Kandungan relatif iridoid dan glikosida iridoid diukur dengan spektrofotometri UV dengan metode panjang gelombang ganda untuk menghindari interferensi spektral dari PhGs (237 nm digunakan untuk kuantifikasi spektroskopi, titik isosbes 280 nm digunakan untuk panjang gelombang referensi), geniposide digunakan sebagai standar. Kandungan karbohidrat total CTE ditentukan dengan metode kolorimetri asam fenol-sulfat dengan glukosa sebagai standar (Chow dan Landhausser, 2004).

Konstituen kimia utama CTE dicirikan oleh UPLC-Q-TOF-MS. Analisis UPLC-Q-TOF-MS dilakukan pada sistem UPLC Waters ACQUITY (Waters Corp., Milford, MA, Amerika Serikat) dengan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 m, Waters Corp., Amerika Serikat) dengan elusi gradien menggunakan 0.1 persen asam format asetonitril (A) dan 0.1 persen asam format dalam air (B) pada laju alir 0,4 ml/menit. Profil gradien adalah: 0-5 min (A: 5-20 persen ), 5-7.5 menit (A: 20-30 persen ), 7.5-10 min ( A: 30-70 persen ), 10-11 menit (A: 70-100 persen ), dan ditahan selama 1,5 menit. Gradien didaur ulang kembali ke 5 persen dalam 0,5 menit dan ditahan selama 2,5 menit untuk putaran berikutnya. Volume injeksi adalah 3 [il. Suhu oven kolom diatur ke 35 derajat.

Spektrometri massa dilakukan dengan menggunakan spektrometer massa Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, Amerika Serikat). Ionisasi dilakukan dalam mode electrospray (ESI) negatif. Parameter MS adalah sebagai berikut: tegangan kapiler, 2.0 kV; tegangan kerucut, 20 V; suhu sumber, 120 derajat ; suhu desolvasi, 500 derajat ; aliran gas kerucut dan desolvasi, masing-masing 50 dan 1,000 L/jam. Untuk pengukuran massa yang akurat, leusin-enkephalin digunakan sebagai massa kunci untuk menghasilkan ion [MH]- (m/z 554.2615). Eksperimen MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) dalam dua fungsi pemindaian dilakukan sebagai berikut: fungsi 1 (energi rendah): m/z 50-1,000, waktu pemindaian 0,25 detik, penundaan antar pemindaian 0,02 detik , energi tumbukan 6 eV; fungsi 2 (energi tinggi): m/z 50-1,000, waktu pemindaian 0,25 detik, penundaan antar-pemindaian 0,02 detik, ramp energi tumbukan sebesar 20-45 eV. Data diolah menggunakan software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, United States).

Eksperimen Hewan

Tikus Sprague-Dawley jantan (200 20 g) diperoleh dari Perusahaan Teknologi Hewan Laboratorium Sungai Vital Beijing (Beijing, Cina), dan ditempatkan di Pusat Hewan Laboratorium Universitas Shanghai Jiao Tong (Shanghai, Cina). Hewan-hewan ditempatkan dalam kelompok di bawah suhu ruangan yang terkendali (25 2 derajat, 55 10 persen kelembaban relatif) dengan siklus terang-gelap 12:12 jam. Tikus diizinkan akses gratis ke makanan tikus laboratorium reguler dan air selama 1 minggu. Fasilitas dan protokol hewan telah disetujui oleh Komite Etika Hewan Universitas Jiao Tong Shanghai (Shanghai, Cina).

Setelah 1 minggu aklimatisasi, 40 tikus naif menjadi sasaran periode pelatihan sukrosa 72 jam dan pengujian dasar sukrosa. Tikus dibagi menjadi lima kelompok (n=8) berdasarkan preferensi sukrosa mereka dalam uji dasar sukrosa (Gambar Tambahan S1). Kelompok kontrol dan kelompok CUS diberi saline (10 ml/kg). Untuk tiga kelompok lainnya, CTE pada dosis tinggi (CTEH) (400 mg/kg), dosis rendah (CTEL) (200 mg/kg), dan FLX (10 mg/kg) diberikan secara intragastrik 1 jam sebelum prosedur CUS (08:00 hingga 9:00) selama 4 minggu.

Stres kronis tak terduga dikembangkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Willner, 1997; Xue et al., 2013), kecuali untuk kelompok kontrol non-stres, serangkaian stres diterapkan pada tikus: penerangan stroboskopik intensitas rendah semalam (120 kilatan / menit), white noise (100 dB) selama 1 jam, kekurangan air selama 24 jam, botol air kosong selama 1 jam (setelah kekurangan air), kekurangan makanan selama 24 jam, berenang paksa (5 menit), pengekangan fisik ({{11 }} jam), kandang kotor selama 24 jam (200 ml air dalam 100 g alas serbuk gergaji), jepitan ekor (1 menit), kemiringan kandang 45 derajat selama 24 jam, kejutan selama 30 menit, dan penerangan semalam (12 jam). Stresor diterapkan secara terus menerus dan acak selama 4 minggu, rinciannya dijelaskan dalam Tabel Tambahan S1. Makanan dan air tersedia secara bebas untuk tikus kontrol yang tidak stres, yang tetap tidak terganggu di ruangan lain, kecuali untuk periode 14 jam sebelum setiap tes sukrosa. Satu tikus mati selama prosedur CUS. Tes renang paksa (FST) dilakukan setelah

4 hari pemberian akut dan setelah 28 hari stres, uji preferensi sukrosa (SPT) (hari 29), uji lapangan terbuka (OFT) (hari 31), dan uji pemberian makan baru (NSFT) (hari 33) dilakukan. Garis besar desain untuk CUS dan tes perilaku ditunjukkan pada Gambar Tambahan S2.

Tes renang paksa dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Porsolt et al., 1978). Prosedur terdiri dari sesi pretest dan tes, menggunakan peralatan dan kondisi yang sama (diameter 20 cm, tinggi 45 cm, berisi 25 cm air dipertahankan pada 26 derajat). Selama sesi pretest, tikus dipaksa berenang selama 15 menit; 24 jam kemudian, tikus ditempatkan di peralatan yang sama selama 5 menit sesi tes berenang. Perilaku berenang di dalam

5 menit diamati dengan kamera video, dan durasi imobilitas diukur dan dianalisis.

Untuk SPT, tikus terlebih dahulu dilatih untuk mengkonsumsi larutan sukrosa 1 persen (v/v) selama 72 jam sebelum SPT. Tes dasar sukrosa sebelum prosedur CUS dan SPT pada akhir CUS dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Xue et al., 2013).

Uji lapangan terbuka dilakukan pada akhir prosedur CUS, peralatan dan metodenya sama seperti yang dirinci sebelumnya (Xue et al., 2013). Sistem pelacakan video (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) digunakan untuk merekam total jarak yang ditempuh.

Tes pemberian makan yang ditekan baru dinilai seperti yang dijelaskan sebelumnya (Xue et al., 2013) dan latensi untuk mulai makan dalam 5 menit dicatat dan dianalisis.

Pengukuran Neurotransmitter dan Faktor Neurotropik

Setelah tes perilaku, setidaknya empat pelet tinja diperoleh dari setiap tikus, ditempatkan dalam tabung kerucut steril, dan segera dibekukan pada -80OC untuk komunitas mikroba dan analisis SCFA. Setelah itu, tikus dikorbankan; hipokampus dan usus besar diisolasi dan segera ditimbang. Sampel jaringan dicuci dengan saline, dibekukan dalam nitrogen cair, dan disimpan dalam -80OC untuk penyimpanan. Setelah pencairan berurutan pada -20OC dan 4OC, sampel jaringan dihomogenisasi dalam saline dan disentrifugasi selama 25 menit pada 2.500 rpm/4OC. Supernatan yang dihasilkan dikumpulkan dan disimpan pada suhu 4OC sampai digunakan. Tingkat 5-HT di hippocampus dan usus besar, NE di hippocampus, dan BDNF di hippocampus ditentukan oleh kit ELISA komersial sesuai dengan protokol pabrikan (Hou et al., 2017).

Bentengbisa meringankanginjalpenyakit

Analisis Profil Komposisi Mikrobiota Usus

DNA total mikrobiota usus dari sampel tinja diekstraksi seperti yang dijelaskan sebelumnya (Wei et al., 20{{20}}4). Setiap sampel tinja (0.2 g) dicampur dalam 1 ml PBS, dan dihomogenkan dua kali, kemudian disentrifugasi pada 200 g selama 6 menit. Supernatan ditambahkan dengan 20 20 persen PVP dan disentrifugasi pada 300 g selama 6 menit. Supernatan yang dihasilkan kemudian disentrifugasi pada 12,000 g selama 6 menit dan pelet sel dipanen. Pelet sel dicuci dengan PBS dan kemudian disuspensikan kembali dalam 300 l lisat I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2., pH 8.0). Suspensi tersebut dicampur dengan 100 larutan lisozim (100 mg/ml) dan 20 1 persen RNase, dimandikan dengan suhu 37OC selama 30 menit, kemudian ditambahkan 300 l lisat II (100 mM NaCl, 500 mM basa Tris, pH 8,0) . Suspensi sel dicampur dengan lembut dengan 50 20 persen SDS, direndam dalam es selama 5 menit. DNA kemudian dimurnikan dengan ekstraksi sekuensial dengan 1 persen PVP, tris-equilibrated phenol dan chloroform-isoamil alcohol (vol/vol/vol/vol, 3.125:25:24:1), dan chloroform-isoamyl alcohol (vol/vol, 24 :1) diikuti dengan pengendapan pada -20OC selama 2 jam dengan dua volume etanol dan 50 [il 3 M NaAc. DNA dikumpulkan dengan sentrifugasi, dikeringkan di udara, dan dilarutkan dalam 100 il air deionisasi steril. Kemurnian asam nukleat diuji menggunakan Spektrofotometer NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Serikat). DNA genom total kemudian menjadi sasaran amplifikasi PCR menggunakan primer khusus untuk wilayah V3-V4 dari gen 16S rRNA: primer maju 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') dan primer terbalik 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). Amplikon PCR dimurnikan dengan manik-manik Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Amerika Serikat) dan diukur menggunakan PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Serikat). Setelah langkah kuantifikasi individu, amplikon dikumpulkan dalam jumlah yang sama, dan pengurutan pasangan ujung 2 x 300 bp dilakukan menggunakan platform Illumina MiSeq dengan MiSeq Reagent Kit v3 di Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Cina). Pembacaan akhir berpasangan dirakit menggunakan perangkat lunak FLASH (versi 1.2.7), pembacaan urutan mentah dipangkas kualitasnya menggunakan perangkat lunak QIIME (versi 1.8.0) untuk menghapus kode batang yang tidak cocok dan urutan di bawah ambang batas panjang. Setelah itu, urutan yang disaring dikelompokkan ke dalam unit taksonomi operasional (OTUs) dengan ambang 97 persen kesamaan urutan menggunakan QIIME dengan UCLUST. Keragaman beta dilakukan pada QIIME untuk analisis koordinat utama UniFrac (PCoA) tertimbang. Akhirnya, perangkat lunak Meta stats digunakan untuk membandingkan perbedaan komposisi taksonomi mikroba usus di antara kelompok yang berbeda.

Analisis Konsentrasi SCFA

Konsentrasi SCFA (termasuk asetat, propionat, butirat, isobutirat, asam valerat, asam isovalerat, dan asam heksanoat) dalam sampel tinja tikus ditentukan dengan kromatografi gas GC{{0}} (Shimadzu, Jepang), dipasang dengan kolom DB-FFAP (30 mx 0.25 mm x {{10}}.25 cm, Agilent, Amerika Serikat). Larutan standar asetat, propionat, butirat, isobutirat, asam valerat, asam isovalerat, dan asam heksanoat dibuat di1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01, dan 0,005 mg/ml dengan eter (termasuk 2- asam metil valerat 0,1 mg/ml sebagai standar internal). Setiap sampel tinja (0,2 g) dicampur dalam 0,8 ml air deionisasi dengan vortex dan sentrifugasi pada 5,000 rpm selama 20 menit pada 4OC, 450 il supernatan ditambahkan 50 il 50 persen H2SO4 dan 500 il standar internal larutan, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi pada 12,000 rpm selama 10 menit, kemudian campuran ditempatkan pada suhu 4OC selama 30 menit. Supernatan diambil untuk analisis GC. Analisis SCFA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Wang et al., 2016).

Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai sarana SEM. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Amerika Serikat) dengan ANOVA satu arah yang dilanjutkan dengan uji Dunnett atau uji-t Student. Data dikeluarkan dari analisis jika lebih besar dari dua standar deviasi dari mean. Nilai p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="" statistik.="" analisis="" korelasi="" pearson="" digunakan="" untuk="" mengevaluasi="" hubungan="" antara="" kelimpahan="" relatif="" mikrobiota="" usus,="" scfa,="" tingkat="" hipokampus="" 5-ht,="" ne,="" dan="" bdnf,="" dan="" usus="" besar="">

Bentengdapat meningkatkan kekebalan dan menurunkan tekanan darah

HASIL

Analisis Komposisi Kimia CTE

Komposisi kimia CTE pertama kali dianalisis secara komprehensif. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, PhGs adalah komponen utama CTE, dengan kandungan relatif 48,6 persen, iridoid dan glikosida iridoid adalah 6,9 persen, dan total sakarida adalah 20.0 persen. Ini

komponen CTE kemudian dikarakterisasi menggunakan UPLC-Q-TOF-MS. Sebanyak 27 konstituen terdeteksi dan diidentifikasi, termasuk 20 konstituen PhGs, lima iridoid dan glikosida iridoid, dan dua oligosakarida. Informasi terperinci termasuk waktu retensi, MS akurat, dan ion fragmen MS/MS tercantum dalam Informasi Pendukung (Tabel Tambahan S2). UPLC-Q-TOF-MS total ion chromatogram (TIC) dari CTE ditunjukkan pada Gambar Tambahan S3.

CTE Meningkatkan Perilaku Depresi pada Tikus CUS

Pada tikus CUS, total waktu imobilitas di FST dan latensi makan di NSFT secara signifikan menurun dengan pengobatan CTE, dan preferensi sukrosa di SPT dan jarak total yang tercakup dalam OFT meningkat.

Gambar 1A mengilustrasikan efek akut CTE pada waktu imobilitas di FST pada tikus CUS. Dibandingkan dengan kelompok model CUS, 3- hari pemberian oral akut CTE secara signifikan mengurangi total waktu imobilitas pada FST [one-way ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Analisis posthoc lebih lanjut mengungkapkan bahwa administrasi

TABEL 1|komposisi kimia ekstrak C. tubulosa CTE dengan kelompok dosis tinggi (uji Dunnett, p < 0.05)="" dan="" kelompok="" dosis="" rendah="" (uji="" dunnett,="" p="">< 0,05)="" menunjukkan="" penurunan="" yang="" nyata="" total="" waktu="" imobilitas="" di="">

Efek CTE pada preferensi sukrosa di SPT pada tikus CUS ditunjukkan pada Gambar 1B. Prosedur stres dua puluh delapan hari menyebabkan penurunan yang signifikan dalam preferensi sukrosa pada kelompok model CUS dibandingkan dengan tikus kontrol non-stres [one-way ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Uji Dunnett, p < 0,05],="" menunjukkan="" bahwa="" model="" cus="" berhasil="" dikembangkan.="" sebagai="" kontrol="" positif,="" kelompok="" flx="" secara="" signifikan="" meningkatkan="" preferensi="" sukrosa="" pada="" tikus="" cus="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" uji="" dunnett,="" p=""><0,05], menunjukkan="" validitas="" prediktif="" model="" cus.="" pemberian="" cte="" oral="" kronis="" pada="" kelompok="" dosis="" tinggi="" menunjukkan="" efek="" kunci="" pada="" preferensi="" sukrosa="" [anova="" satu="" arah,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" uji="" dunnett,="" p=""><0,01], yang="" mengembalikannya="" ke="" tingkat="" normal="" pada="" tikus="" cus.="" cte="" dengan="" kelompok="" dosis="" rendah="" menunjukkan="" kecenderungan="" meningkat="" tetapi="" efeknya="" tidak="" signifikan="" secara="" statistik="" (uji="" dunnett,="" p="">

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1C, jarak total yang tercakup dalam OFT juga digunakan untuk mengevaluasi efek CTE pada tikus CUS. Dibandingkan dengan tikus non-stres, kelompok model CUS menunjukkan jarak total yang jauh lebih pendek [ANOVA satu arah, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Uji Dunnett, p < 0.001]="" setelah="" paparan="" cus="" 4-minggu,="" dan="" perlakuan="" flx="" kontrol="" positif="" meningkatkan="" jarak="" total="" pada="" tikus="" cus="" [anova="" satu="" arah,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" uji="" dunnett,="" p="">< 0,05].="" pemberian="" cte="" oral="" harian="" dengan="" dosis="" tinggi="" dan="" dosis="" rendah="" menunjukkan="" efek="" yang="" nyata="" pada="" jarak="" total="" pada="" tikus="" cus="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" uji="" dunnett,="" p=""><0,01 untuk="" kelompok="" dosis="" tinggi,="" p=""><0,001 untuk="" kelompok="" dosis="" rendah].="" gambar="" tambahan="" s4="" menunjukkan="" peta="" jalur="" aktivitas="" di="">

Gambar 1D menunjukkan efek CTE pada latensi makan di NSFT pada tikus CUS. Prosedur stres dua puluh delapan hari menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam latensi untuk mulai makan pada kelompok model CUS dibandingkan dengan tikus kontrol yang tidak stres [ANOVA satu arah, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Uji Dunnett, p < 0,05],="" menunjukkan="" bahwa="" model="" cus="" berhasil="" dikembangkan.="" pemberian="" cte="" oral="" jangka="" panjang="" dengan="" dosis="" tinggi="" menunjukkan="" efek="" yang="" nyata="" pada="" latensi="" untuk="" mulai="" makan="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" cus="" (uji-t="" siswa,="" t="2,759," p=""><0,05), sedangkan="" cte="" dosis="" rendah="" menunjukkan="" tidak="">

CTE Memulihkan Tingkat Neurotransmitter dan Faktor Neurotropik pada Tikus CUS

Efek CTE pada {{{{10}}}}Tingkat HT dan NE di hipokampus tikus CUS ditunjukkan pada Gambar 2A,B. Prosedur stres empat minggu menyebabkan penurunan yang signifikan dari 5-HT [one-way ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Uji Dunnett, p < 0,001]="" dan="" ne="" [anova="" satu="" arah,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" uji="" dunnett,="" konsentrasi="" p=""><0,001] di="" hippocampus="" tikus="" cus="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" kontrol,="" dan="" antidepresan="" flx="" secara="" signifikan="" memulihkan="" 5-tingkat="" ht="" di="" hippocampus="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" uji="" dunnett,="" p="">< 0,001].="" setelah="" pemberian="" cte="" oral="" pada="" kelompok="" dosis="" tinggi,="" peningkatan="" yang="" signifikan="" pada="" 5-tingkat="" ht="" diamati="" [satu="">

ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Uji Dunnett, p < 0.001]="" sedangkan="" konsentrasi="" ne="" tidak="" berubah.="" demikian="" pula,="" ekspresi="" bdnf="" berkurang="" secara="" signifikan="" pada="" kelompok="" model="" cus="" dibandingkan="" dengan="" tikus="" non-stres="" (student's="" t-test,="" t="4.171," p=""><0,01) (gambar="" 2c).="" baik="" pemberian="" cte="" oral="" jangka="" panjang="" dengan="" dosis="" tinggi="" (student's="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" dan="" flx="" (student's="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" meningkatkan="" ekspresi="" bdnf="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" model="" cus.="" cte="" dengan="" dosis="" rendah="" tidak="" menunjukkan="" pengaruh="" yang="" signifikan="" terhadap="" ekspresi="">

{{0}}Tingkat HT di usus besar tikus CUS berbeda dari di hipokampus, dan prosedur stres 4-minggu tidak berdampak pada usus besar 5-HT (Gambar 2D ). Sebaliknya, pemberian CTE oral dengan dosis tinggi merangsang 5-tingkat HT di usus besar bila dibandingkan dengan kelompok model CUS (Uji-t Siswa, t=2.173, p <0,05). cte="" dengan="" dosis="" rendah="" tidak="" menunjukkan="" efek="" pada="" tingkat="" 5-ht="" usus="">

CTE Mengatur Komposisi Mikroba Usus Tikus CUS

Pengaruh CTE pada komposisi mikroba usus tikus CUS dievaluasi dengan metode berbasis sekuensing gen 16S rRNA. Ditemukan bahwa 28 hari pemberian oral CTE mengubah komposisi mikroba usus tikus CUS dan memengaruhi berbagai

tingkat taksonomi mikroba di antara kelompok tikus (tingkat kelas 1, tingkat ordo 1, tingkat keluarga 1, tingkat genus 8, dan tingkat spesies 2). Ini menunjukkan bahwa komunitas mikroba usus dapat berperan dalam efek anti-depresan CTE. Informasi terperinci dari taksa mikroba usus yang berubah secara signifikan pada tingkat taksonomi yang berbeda ditunjukkan pada Tabel 2.

Urutan MiSeq menghasilkan total 2.132.980 pembacaan mentah, mengikuti proses kontrol kualitas, denoising, dan penghapusan chimera. Selanjutnya, bacaan dikelompokkan ke dalam OTU, yang ditugaskan ke taksa dari tingkat filum hingga spesies. Kajian analisis keragaman beta dilakukan untuk mengetahui kesamaan pola komunitas bakteri di antara kelima kelompok tikus. PCoA berdasarkan jarak UniFrac tertimbang mikrobiota usus dari lima kelompok tikus studi ditunjukkan pada Gambar 3A. Analisis keragaman beta oleh PCoA menunjukkan pemisahan yang jelas dari komunitas mikroba dari kelompok kontrol dan kelompok model CUS, sedangkan CTE dengan kelompok dosis tinggi cenderung lebih dekat ke kelompok kontrol dibandingkan dengan kelompok CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 persen. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan S5A, B, prosedur stres 4 minggu menyebabkan tren yang tidak signifikan menuju peningkatan tingkat Firmicutes dan penurunan Bacteroidetes yang tidak signifikan pada kelompok model CUS dibandingkan dengan kelompok kontrol. Setelah pemberian harian CTE dengan dosis tinggi dan dosis rendah, kelimpahan relatif Firmicutes dan Bacteroidetes kembali ke tingkat yang sama dari kelompok kontrol, meskipun tanpa signifikansi statistik. Dan meskipun perubahan serupa diamati untuk rasio Firmicutes / Bacteroidetes di antara kelompok tikus, tidak ada perbedaan statistik yang ditunjukkan (Gambar Tambahan S5C). Tren yang tidak signifikan terhadap penurunan tingkat filum Cyanobacteria ditemukan pada kelompok model CUS dibandingkan dengan tikus kontrol yang tidak stres; sedangkan pemberian CTE dengan dosis tinggi menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam kelimpahan relatif Cyanobacteria dibandingkan dengan kelompok CUS (Gambar Tambahan S5D).

Pada tingkat genus, Bacteroides dan Ruminococcus adalah dua taksa mikroba paling melimpah yang menyumbang sekitar 30 persen kelimpahan relatif di kelima kelompok tikus. Prosedur stres empat minggu menyebabkan penurunan yang signifikan dalam kelimpahan relatif Bacteroides dan peningkatan signifikan Ruminococcus pada kelompok model CUS dibandingkan dengan tikus kontrol yang tidak stres (Gambar 4A, B). Pemberian CTE jangka panjang menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam kelimpahan Bacteroides serta penurunan yang signifikan dari Ruminococcus dibandingkan dengan tikus CUS. Selain itu, enam genera Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus, dan Brachybacterium menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antara kelompok model CUS dan kelompok kontrol (Gambar 4C-H). Setelah 28 hari pengobatan CTE, kelimpahan relatif dari enam genera yang disebutkan di atas masing-masing diubah ke tingkat yang serupa dengan kelompok kontrol.

Kelimpahan Deinococcus yang rendah pada tingkat taksonomi yang berbeda termasuk tingkat kelas (Deinococci), tingkat ordo (Deinococcales), tingkat famili (Deinococcaceae), dan tingkat genus (Deinococcus) terdeteksi pada kelompok tikus CUS, sedangkan gagal terdeteksi pada kontrol kelompok dan kelompok administrasi (Gambar 5A-D).

Pada tingkat spesies, Weissella beninensis jauh lebih rendah pada kelompok CUS daripada kelompok kontrol, dan peningkatan yang signifikan dalam kelimpahan relatif diamati setelah pemberian CTE dengan dosis tinggi (Gambar 5E). Sebaliknya, pemberian CTE membalikkan peningkatan signifikan dalam kelimpahan relatif Brachybacterium conglomerate yang diamati pada tikus CUS (Gambar 5F).

SCFA termodulasi CTE pada Tikus CUS

Konsentrasi SCFA (termasuk asetat, propionat, butirat, isobutirat, asam valerat, asam isovalerat, dan asam heksanoat) dalam sampel tinja tikus dianalisis dengan GC dan ditunjukkan pada Gambar 6. Kadar asetat [ANOVA satu arah, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Uji Dunnett, p < 0.05]="" dan="" asam="" heksanoat="" [anova="" satu="" arah,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" uji="" dunnett,="" p=""><0,05] meningkat="" secara="" signifikan="" pada="" tikus="" kelompok="" model="" cus="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" kontrol.="" setelah="" pemberian="" cte="" jangka="" panjang="" dengan="" dosis="" tinggi,="" asetat="" (student's="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0.05)="" dan="" asam="" heksanoat="" [one-way="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" uji="" dunnett,="" konsentrasi="" p=""><0,05] sebagian="" besar="" menurun="" bila="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" cus,="" menunjukkan="" cte="" mungkin="" mengerahkan="" aktivitas="" anti-depresannya="" melalui="" modulasi="" scfa="" metabolit="" neuroaktif="" yang="" tidak="" teratur.="" pemberian="" cte="" dengan="" kelompok="" dosis="" rendah="" menunjukkan="" tren="" penurunan="" tetapi="" tidak="" ada="" efek="" yang="" luar="" biasa="" pada="" konsentrasi="" asam="" asetat="" dan="">

Analisis Korelasi Mikrobiota Usus, Neurotransmitter dan Neurotropin di Hippocampus, 5-HT di Colon, dan SCFA

Untuk mengeksplorasi hubungan fungsional mikrobiota usus yang berubah di tingkat genus, neurotransmiter dan neurotropin yang berubah di hipokampus dan usus besar, dan konsentrasi SCFA yang mengganggu, koefisien korelasi Pearson dikembangkan (Meng et al., 2017). Korelasi antara mereka (r > 0.4 atau r < -0.4,="" p=""><0,05) ditunjukkan="" pada="" gambar="" 7.="" koefisien="" menunjukkan="" korelasi="" yang="" kuat="" antara="" komposisi="" mikrobiota="" usus="" yang="" berubah="" di="" tingkat="" genus,="" konsentrasi="" tujuh="" jenis="" scfa,="" dan="" neurotransmiter="" monoamina="" terkait="" depresi="" (5-ht="" dan="" ne).="" kelimpahan="" ruminococcus="" menunjukkan="" korelasi="" negatif="" yang="" signifikan="" dengan="" konsentrasi="" 5-ht="" di="" hipokampus,="" yang="" berarti="" bahwa="" prosedur="" cus="" menyebabkan="" peningkatan="" kelimpahan="" relatif="" ruminococcus="" dan="" penurunan="" konsentrasi="" 5-ht.="" setelah="" pengobatan="" dengan="" cte,="" kelimpahan="" relatif="" ruminococcus="" berkurang="" ke="" tingkat="" kelompok="" kontrol,="" dan="" tingkat="" 5-ht="" ditemukan="" telah="" meningkat.="" selanjutnya,="" kelimpahan="" relatif="" bacteroides="" berkorelasi="" positif="" dengan="" tingkat="" 5-ht="" di="" hipokampus,="" dan="" berhubungan="" negatif="" dengan="" konsentrasi="" butirat,="" isobutirat,="" asam="" valerat,="" asam="" isovalerat,="" dan="" asam="" heksanoat;="" kelimpahan="" parabacteroides="" menunjukkan="" korelasi="" positif="" yang="" signifikan="" dengan="" tingkat="" 5-ht="" di="" hipokampus="" dan="" konsentrasi="" propionat,="" sementara="" itu="" menunjukkan="" korelasi="" negatif="" dengan="" konsentrasi="" isobutirat="" dan="" asam="" isovalerat;="" hubungan="" positif="" yang="" signifikan="" antara="" kelimpahan="" relatif="" butyricimonas="" dan="" tingkat="" ne="" di="" hippocampus="" juga="" diamati,="" dan="" kelimpahan="" relatif="" deinococcus="" berkorelasi="" positif="" dengan="" konsentrasi="" asetat.="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" cte="" mungkin="" mengerahkan="" aktivitas="" anti-depresannya="" dengan="" mengubah="" komposisi="" mikrobiota="" usus,="" mengganggu="" kadar="" neurotransmiter="" hipokampus,="" dan="" memulihkan="" metabolit="" neuroaktif="" scfa.="" data="" rinci="" analisis="" korelasi="" ditunjukkan="" pada="" tabel="" tambahan="">