BAGIAN 1 Acteoside Menekan Osteoklastogenesis yang Dimediasi RANKL Dengan Menghambat Induksi C-Fos Dan Jalur NF-KB Dan Melemahkan Produksi ROS

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Sea Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Lembaga Penelitian Kedokteran Klinis Universitas Nasional Chonbuk, Institut Penelitian Biomedis Rumah Sakit Universitas Nasional Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Korea Selatan, 2 Departemen Ortodontik, Institut Biosains Oral dan Sekolah Kedokteran Gigi, Universitas Nasional Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Selatan Korea, 3 Departemen Ilmu Bahan Bioaktif, Pusat Penelitian Bahan Bioaktif, Universitas Nasional Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Korea Selatan

Abstrak

Sejumlah penelitian telah melaporkan bahwa sitokin inflamasi adalah mediator penting untuk osteoklastogenesis, sehingga menyebabkan resorpsi tulang yang berlebihan dan osteoporosis.Akteosida, senyawa aktif utama dariRehmannia glutinosa, yang digunakan secara luas dalam pengobatan Oriental tradisional, memiliki potensi anti-inflamasi dan antioksidan. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwaakteosidasecara nyata menghambat diferensiasi dan pembentukan osteoklas dari makrofag sumsum tulang (BMM) dan makrofag RAW264.7 yang dirangsang oleh aktivator reseptor ligan faktor-kappaB (NF-kB) nuklir (RANKL). Pretreatment acteoside juga mencegah resorpsi tulang oleh osteoklas dewasa dengan cara yang bergantung pada dosis.Akteosida(10 mM) melemahkan aktivasi p38 kinase yang dirangsang oleh RANKL, kinase yang diatur sinyal ekstraseluler, dan c-Jun N-terminal kinase, dan juga menekan aktivasi NF-kB dengan menghambat fosforilasi subunit p65 dan inhibitor kBa. Selain itu, peningkatan yang diperantarai RANKL dalam ekspresi c-Fos dan faktor inti sel T teraktivasi, sitoplasma 1 (NFATc1), dan dalam produksi faktor nekrosis tumor-a, interleukin (IL)-1b , dan IL-6 tampaknya dihambat oleh pretreatment acteoside. Selanjutnya, lisanakteosidamengurangi keropos tulang yang diinduksi ovariektomi dan produksi sitokin inflamasi untuk mengontrol tingkat. Data kami menunjukkan bahwaakteosidamenghambat diferensiasi dan pematangan osteoklas dari prekursor osteoklastik dengan menekan aktivasi RANKL yang diinduksi oleh protein kinase teraktivasi-mitogen dan faktor-faktor transkripsi seperti NF-kB, c-Fos, dan NFATc1. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwaakteosidadapat bertindak sebagai agen anti-resorptif untuk mengurangi keropos tulang dengan menghalangi aktivasi osteoklas.

Untuk informasi lebih lanjut silahkan hubungi:{0}}

pengantar

Tulang terus-menerus dirombak oleh aktivitas osteoklas dan osteoblas yang seimbang [1]. Osteoklas muncul dari sel prekursor hematopoietik dari garis keturunan monosit/makrofag, sedangkan osteoblas berasal dari garis keturunan mesenkim [2]. Aktivasi osteoklas yang abnormal atau berkurangnya osteoblastogenesis dapat mengganggu homeostasis tulang, yang pada akhirnya menyebabkan penyakit seperti osteoporosis, artritis, dan kanker tulang [3,4]. Osteoporosis adalah penyakit tulang umum yang menyebabkan peningkatan risiko patah tulang. Bentuk paling umum dari osteoporosis disebabkan oleh defisiensi estrogen pada wanita menopause. Obat-obatan seperti kortikosteroid dan anti-epilepsi juga dapat menyebabkan ketidakseimbangan antara resorpsi dan pembentukan tulang, yang dapat mengakibatkan osteoporosis [5]. Banyak inhibitor anti-resorptif termasuk bifosfonat, kalsitonin, estrogen, dan modulator reseptor estrogen selektif telah digunakan untuk mengobati osteoporosis. Inhibitor ini mempertahankan massa tulang dengan menghambat fungsi osteoklas [6]. Terapi penggantian estrogen adalah pengobatan yang paling populer untuk mencegah dan mengobati osteoporosis pascamenopause. Namun, terapi penggantian estrogen jangka panjang dapat meningkatkan risiko kanker endometrium dan payudara. Oleh karena itu, banyak peneliti memfokuskan upaya mereka pada pengembangan agen anti-resorptif baru yang tidak memiliki efek samping [7-10]. Karena osteoklas berfungsi dalam resorpsi tulang, secara khusus menghambat osteoklas telah dianggap sebagai target utama dalam banyak penelitian. Osteoklas adalah sel raksasa berinti banyak yang dibentuk oleh progenitor mononuklear dari keluarga monosit/makrofag melalui proliferasi berurutan, diferensiasi, dan fusi sel prekursor hematopoietik [11]. Faktor perangsang koloni makrofag (M-CSF) dan aktivator reseptor ligan faktor nuklir (NF)-kB (RANK) (RANKL) adalah faktor penting untuk diferensiasi osteoklas[12]. Selain itu, beberapa sitokin inflamasi, seperti faktor nekrosis tumor (TNF) dan interleukin (IL)-1b, berkontribusi pada osteoklastogenesis dengan memodulasi induksi RANKL, osteoprotegerin, dan M-CSF [7,13]. Pengikatan RANKL ke reseptor RANK permukaan sel menghasilkan RANKL/RANK/TNFR

faktor terkait (TRAF) kompleks yang secara berurutan mengaktifkan NFkB dan mitogen-activated protein kinase (MAPKs), termasuk cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase, dan extracellular signal-related kinase (ERK) [14]. Aktivasi ini memainkan peran kunci dalam memediasi diferensiasi, aktivasi, dan kelangsungan hidup osteoklas. RANKL juga mengaktifkan ekspresi faktor-faktor transkripsi seperti faktor inti sel-T teraktivasi, sitoplasma 1 (NFATc1) dan-Fos, yang penting untuk perkembangan osteoklas [ 7,9]. Oleh karena itu, pensinyalan RANKL dianggap sebagai target utama agen anti-resorptif yang menekan aktivasi osteoklas dan tanpa tulang.Akteosidaadalah senyawa aktif utama Rehmannia glutinosa, yang digunakan secara luas dalam pengobatan Oriental tradisional [15,16].Akteosidaadalah antioksidan kuat dan memiliki aktivitas anti-hepatotoksik, anti-inflamasi, dan anti-nosiseptif [17-20]. Kami sebelumnya menemukan bahwaakteosidamenurunkan aktivitas tirosinase dan biosintesis melanin dengan mengatur pensinyalan ERK [21], melindungi terhadap kerusakan gingiva yang dimediasi spesies oksigen reaktif (ROS) [22], dan menekan kerusakan sel yang dimediasi mikotoksin [23]. Efek ini terkait erat denganakteosidakemampuan untuk menghilangkan ROS dan mengatur pensinyalan yang dimediasi MAPK. Secara khusus, ROS disarankan untuk memediasi jalur pensinyalan yang diinduksi RANKL dan kejadian seluler dalam osteoklas. Perawatan awal dengan antioksidan menghambat aktivasi NF-kB, ERK, dan IkBa yang diinduksi RANKL, sehingga menekan osteoklastogenesis [24]. Temuan ini sangat menyarankan bahwa, selain aktivitas anti-inflamasi, dan aktivitas antioksidan sangat penting untuk agen anti-resorptif, dengan demikianakteosidadapat menekan osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL. Dalam penelitian ini, kami mengeksplorasi apakahakteosidamemiliki efek terapeutik pada keropos tulang. Kami memeriksa efek dariakteosidapada diferensiasi osteoklas dan resorpsi tulang dan mekanisme seluler terkait menggunakan sistem eksperimental in vitro dan in vivo.

akteosida

Bahan dan metode

Pernyataan etika

Praktik perawatan dan penggunaan hewan telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Nasional Chonbuk dalam Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium (Izin No. CBU 2010-0007). Semua percobaan dalam penelitian ini dilakukan sesuai dengan pedoman dari Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas.

Tikus, Bahan Kimia, dan Barang Laboratorium

Tikus ICR betina berumur empat minggu dibeli dari OrientBio Inc. (Seoul, Korea) dan ditempatkan pada 2261uC dan kelembaban 5565 persen pada siklus terang/gelap 12 jam dengan akses gratis ke makanan dan air. Acteoside (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Gbr. S1) diisolasi dari daun Rehmannia glutinosa. Acteoside dilarutkan dalam phosphate-buffered saline (PBS) sebelum digunakan. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, dan M-CSF dibeli dari sistem R & D (Minneapolis, MN, USA). Antibodi khusus untuk c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, dan b-aktin diperoleh dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antibodi untuk p-p38 dan p38 dibeli dari Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). CalciumAssay dan Osteocalcin (OC) EIA Kit dibeli dari BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) dan Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), masing-masing, untuk menentukan parameter biokimia serum. Kit uji asam fosfatase tahan tartrat tikus (TRAP) (Sistem Immunodiagnostik, Scottsdale, AZ, USA) juga digunakan untuk mengukur kadar TRAP5b serum. Kecuali ditentukan lain, bahan kimia tambahan diperoleh dari Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), dan peralatan laboratorium berasal dari SPL Life Sciences (Pochun, Korea Selatan).

Kultur Sel

Sel sumsum tulang diperoleh dari tibiae dan femora tikus ICR betina berusia 6 minggu menurut metode yang dijelaskan sebelumnya [25]. Suspensi sumsum tulang diinkubasi dalam cawan kultur a100-mm dengan adanya 50 ng/ml M-CSF. Setelah 3 hari, sel-sel patuh digunakan sebagai makrofag sumsum tulang (BMM) untuk menginduksi diferensiasi osteoklastik. Beberapa sel sumsum tulang juga diinkubasi selama 48 jam tanpa M-CSF, dan sel-sel yang melekat dikultur dalam media pembeda osteoblas, seperti yang dijelaskan di tempat lain [25]. Sel-sel makrofag RAW264.7 dikultur dalam medium Eagle's (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi (FBS), 2 mM L glutamin, dan antibiotik. Sel-sel ini digunakan sebagai garis sel pendamping untuk BMM untuk mengeksplorasi efek akteosida pada osteoklastogenesis.

Diferensiasi Osteoklastik dan Pewarnaan TRAP

BMM diberi perlakuan awal dengan berbagai konsentrasi (0–50 mM) acteoside selama 2 jam sebelum distimulasi dengan 100 ng/ml RANKL. Media kultur diganti dengan media segar pada hari ke-2 dan ke-5. Setelah 7 hari inkubasi, kultur difiksasi dalam 4 persen paraformaldehida buffer PBS dan diwarnai dengan TRAP menggunakan kit sigma Aldrich sesuai dengan instruksi pabrik. Sel-sel TRAP-positif dihitung menggunakan mikroskop optik, dan sel-sel yang mengandung 3 inti atau lebih dianggap sebagai osteoklas. Sel-sel RAW 264,7 juga diekspos pada 100 ng/ml RANKL setelah pra-perawatan dengan acteoside selama 2 jam, dan setelah 7 hari inkubasi, sel-sel diproses untuk pewarnaan TRAP.

Pengukuran Viabilitas Sel

Viabilitas sel ditentukan dengan menggunakan reagen tetrazolium salt (WST)-8 yang larut dalam air. Singkatnya, sel BMM atau RAW264.7 yang dikultur dalam media pertumbuhan yang mengandung 10 persen FBS dan antibiotik diobati dengan 10 mM acteoside atau senyawa fenolik seperti quercetin, luteolin, apigenin, atau epigallocatechin-3-gallate (EGCG). Reagen WST-8 ditambahkan ke dalam kultur setelah 48 jam inkubasi. Setelah inkubasi selama 4 jam tambahan, absorbansi spesifik WST-8-diukur pada 450 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Uji Resorpsi Tulang

BMM (16105 sel/ml) disuspensikan dalam a-MEM yang mengandung 50 ng/ml M-CSF dan 100 ng/ml RANKL, kemudian dibagi melintasi pelat sumur24-yang dilapisi dengan nanokristal kalsium fosfat (OAAS{{6} }; Substrat Uji Aktivitas Osteoklas, Oscotec Inc., Choongnam, Korea Selatan) pada kepadatan 26104 sel/cm2 dengan dan tanpa akteosida. Setelah inkubasi selama 7 hari, sel-sel dikeluarkan dari piring dengan 5 persen natrium hipoklorit, dan pembentukan lubang diamati di bawah mikroskop optik. Area yang diserap juga diukur dengan penganalisis gambar dan dinyatakan sebagai persentase dari nilai kontrol.

Analisis Western Blot

Seluruh protein lisat disiapkan dalam buffer lisis seperti yang dijelaskan di tempat lain [26]. Protein sitosolik dan inti disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [25]. Jumlah ekstrak protein yang sama dipisahkan oleh 12-15 persen SDS-PAGE dan dioleskan ke membran polivinil difluorida. Bercak diperiksa dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4uC sebelum inkubasi dengan antibodi sekunder dalam buffer pemblokiran selama 1 jam. Bercak dikembangkan dengan chemiluminescence yang ditingkatkan (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) dan terkena film sinar-X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

Uji Aktivitas MAPK

Sel diberi perlakuan awal dengan acteoside selama 2 jam dan kemudian distimulasi dengan RANKL selama -30 menit tambahan. Aktivitas MAPK ditentukan menggunakan kit uji imunometrik, seperti kit uji p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), kit uji enzim p-ERK (Assay Designs), dan kit ELISA sandwich p-SAPK/JNK ( Teknologi Pensinyalan Sel, MA, AS). Semua prosedur mengikuti instruksi pabrik, dan absorbansi diukur dengan pembaca pelat mikro.

Uji Pergeseran Mobilitas Elektroforesis (EMSA)

Reaksi pengikatan DNA-protein dilakukan selama 30 menit pada suhu kamar, dengan 10-15 mg protein dalam 20 ml buffer yang mengandung 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 persen gliserol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM dari oligonukleotida berlabel dCTP [a-32P], dan fragmen Klenow dari DNA polimerase. Sampel dipisahkan pada 6 persen gel poliakrilamida, yang dikeringkan dan terkena film sinar-X (Eastman Kodak Co.) selama 12-24 jam pada 270uC. Urutan primer oligonukleotida spesifik untuk NF-adalah 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 dan 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

Uji NF-kB Luciferase

Makrofag RAW264.7 di 24-piring sumur ditransfeksi dengan0.8 mg kB-luciferase vektor reporter menggunakan 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Pada 24 jam setelah transfeksi, sel-sel dirangsang dengan RANKL dengan adanya dan tidak adanyaakteosidaselama 24 jam. Sel disuspensikan kembali dalam buffer lisis reporter 100 ml (Promega, Madison, WI, USA). Jumlah sampel protein yang sama ditempatkan ke dalam 96-mikroplate sumur dan dicampur dengan substrat luciferase. Luminescence diukur dengan menggunakan microplate luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany). Dalam percobaan ini, peptida inhibitor NF-B permeabel (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) digunakan sebagai inhibitor kB positif.

Pengukuran Sitokin

Sel-sel BMM atau RAW264.7 dirangsang dengan RANKL dengan adanya acteoside dalam 24-pelat kultur sumur. Setelah 48 jam inkubasi, supernatan kultur dikumpulkan dan dinilai dengan ELISA menggunakan kit OptEIATM spesifik TNF-a-, IL-1b- dan IL-6-sesuai dengan instruksi pabrik.

Real-Time Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

Ekspresi mRNA dari penanda osteoklastik, seperti c-Fos, NFATc1, dan TNF-a, ditentukan oleh RT-PCR waktu nyata. Singkatnya, RNA total diekstraksi dari makrofag dengan Trizolreagen sesuai dengan instruksi pabrik (Invitrogen). cDNA disintesis dengan 1 mg RNA total menggunakan SuperScriptReverse Transcriptase II dan primer (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) digunakan untuk mendeteksi akumulasi produk PCR selama siklus dengan sistem deteksi urutan ABI 7500 (AppliedBiosystems). Setelah denaturasi pada 95uC selama 10 menit, PCR

Pengukuran ROS Intraseluler

Larutan stok 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Jerman) disiapkan dalam DMSO dan disimpan pada 220uC dalam gelap. Singkatnya, BMM (106 sel/ml dalam 6-pelat sumur) dikultur dengan 50 ng/MLM-CSF selama 24 jam dan kemudian diperlakukan dengan berbagai konsentrasi (0-10 mM) acteoside 2 jam sebelum stimulasi dengan 100 ng/mlRANKL. Setelah 1 jam inkubasi bersama, sel-sel ini kemudian diinkubasi dengan 25 mM DCFH-DA selama 30 menit. Fluoresensi hijau 29,79-dichlorofluorescein (DCF) direkam pada 515 nm (FL 1) menggunakan sistem FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), dan 10,000 peristiwa dihitung per sampel.

Induksi Ovariektomi-Induced Osteoporosis

Tikus ICR betina (berusia 6 minggu) digunakan untuk penelitian ini. Tikus menerima operasi palsu (Sham, n=10) atau operasi ovariektomi (OVX, n=20) di bawah anestesi. Satu minggu setelah operasi, tikus OVX secara acak dibagi menjadi 2 kelompok masing-masing 10 tikus: OVX bilateral dan OVX bilateral yang dilengkapi dengan 200 ml PBS yang mengandung 1 mM acteoside secara oral (kelompok AC). Lisanakteosidadiberikan sekali setiap 3 hari selama 8 minggu setelah operasi, dan jumlah PBS yang sama diberikan pada kelompok Sham dan OVX. Setelah 1 hari pemberian terakhir, mencit dikorbankan dan kemudian parameter biokimia dalam serum dan struktur tulang dimensi 3- dianalisis.

Penentuan Parameter Biokimia Serum

Sampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung dan serum dikumpulkan dengan sentrifugasi. Sampel serum disimpan pada 280uC untuk analisis parameter biokimia. Kadar serum IL-1b dan IL-6 diperkirakan dengan menggunakan kit ELISA seperti dijelaskan di atas, sedangkan aktivitas alkaline phosphatase (ALP) ditentukan dengan menggunakan uji kolorimetri biokimia yang mengukur jumlah p -nitrofenol diproduksi dari substrat p-nitrofenol fosfat, seperti yang dijelaskan di tempat lain [27]. Untuk memperkirakan biomarker pembentukan dan resorpsi tulang, kadar serum OC, kalsium, dan TRAP5b juga ditentukan menurut instruksi pabrik.

Analisis Struktur Tulang dan Parameter Morfometrik

Femora mencit (kelompok Sham, OVX, dan AC) dibedah dan diisi dengan salin fisiologis untuk pengujian mekanis. Kekuatan mekanik tulang paha diukur seperti yang dijelaskan di tempat lain [28]. Beban patahan dicatat sebagai gaya puncak dalam newton pada titik di tengah patahnya tulang paha kanan. Selain itu, tulang paha ringan dari setiap hewan dianalisis secara histomorfometrik menggunakan sistem tomografi mikrokomputer (CT mikro) (sistem sinar-X mikrofokus SkyScan 1076, Kontich, Belgia). Singkatnya, tulang-tulang dalam penyimpanan formaldehida 4 persen dikeringkan secara dangkal di atas tisu kertas sebelum dibungkus dengan ''cling-film'' plastik atau dalam parafilm, untuk mencegah pengeringan selama pemindaian. Setiap tulang yang dibungkus plastik ditempatkan dalam tabung busa plastik/polistirena yang dipasang secara vertikal horizontal di ruang sampel pemindai 1076 untuk pencitraan mikro-CT. Pemindaian dilakukan menggunakan tegangan sumber 100 kV dan arus sumber 140 mA dengan resolusi 35 mm. Model tiga dimensi tulang trabekular femur direkonstruksi menggunakan SkyScan CT Analyzer versi 1.11. Parameter struktural seperti kepadatan mineral tulang trabekular (BMD, g/cm3), persen volume tulang (bone volume (BV)/volume jaringan (TV), persen ), ketebalan (Tb.Th, mm), pemisahan (Tb.Sp , mm), dan angka (Tb.N, 1/mm) kemudian diukur.

Uji Diferensiasi dan Mineralisasi Osteogenik

Sel sumsum tulang yang dikultur dalam {{{{10}}}}piring kultur sumur diperlakukan dengan DAG (10 nM deksametason, 50 mM asam askorbat, dan 20 mM b-gliserofosfat) dengan adanya 10 mM acteoside. Setelah 2 minggu diferensiasi, sel-sel difiksasi dengan etanol 70 persen (vol/vol) dingin selama 1 jam dan diwarnai dengan air suling Sin alizarin merah 0,2 persen selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah sel-sel dihilangkan dan dikeringkan dengan udara, pelat kultur sel dievaluasi dengan mikroskop cahaya menggunakan mikroskop terbalik (Nikon TS100, Jepang). Untuk mengukur jumlah pewarna merah, noda dielusi dengan 10 persen asetil piridinium klorida dengan mengocok selama 20 menit dan absorbansi diukur pada 560 nm. Jumlah kalsium yang disimpan dalam lapisan sel juga diukur menggunakan Kit Kalsium (Wako Chemical Inc. Osaka, Jepang) sesuai dengan instruksi pabrik. Selain itu, ekspresi penanda mRNA spesifik tulang, seperti faktor transkripsi terkait kerdil-2(Runx2), osterix, sialoprotein tulang (BSP), dan OC ditentukan oleh RT-PCR waktu nyata. Primer oligonukleotida dari penanda ini dirancang dengan ukuran produk kurang dari 200 bp menggunakan Perangkat Lunak PrimerExpress 3.0 (Biosistem Terapan) seperti yang dijelaskan di tempat lain [27].

Analisis statistik

Kecuali dinyatakan lain, semua data dinyatakan sebagai mean6 standar deviasi (SD) dari 3 atau lebih eksperimen independen. ANOVA satu arah digunakan untuk beberapa perbandingan menggunakan perangkat lunak SPSS versi 12.0. Nilai p ,0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Acteoside Menghambat Pembentukan Osteoklas oleh Makrofag dengan Cara yang Tergantung Dosis

Untuk memverifikasi efek acteoside pada diferensiasi BMM menjadi osteoklas, sel-sel dikultur dengan berbagai konsentrasi (0–20 mM) acteoside selama 7 hari dengan adanya 50 ng/ml M CSF dan 100 ng/ml RANKL . Acteoside mengurangi jumlah osteoklas dengan cara yang bergantung pada dosis. Ketika sel-sel diberi perlakuan awal dengan 10 mM acteoside selama 2 jam, jumlah osteoklas menurun sebesar 43 persen dibandingkan dengan sel-sel yang dilengkapi dengan M-CSFand RANKL (Gbr. 1A). Gambar 1B menunjukkan diferensiasi osteoklas yang dimediasi RANKL dan penghambatannya dengan pengobatan kombinasi dengan akteosida. Konsisten dengan hasil ini, pra-perawatan acteoside menurunkan diferensiasi sel-sel RAW264.7 yang dirangsang oleh RANKL dan pembentukan osteoklas (Gbr. 1C dan D). Ketika potensi anti osteoklas dari acteoside pada BMMs dibandingkan dengan potensi anti-osteoklas dari beberapa senyawa fenolik pada konsentrasi yang sama (10 mM), luteolin menunjukkan aktivitas tertinggi (Gbr. 2A). Namun, luteolin, quercetin, atau apigenin sendiri menurunkan viabilitas sel (Gbr. 2B). Semua senyawa menghambat diferensiasi osteoklastik oleh makrofag RAW264.7 dengan aktivitas relatif berikut: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=acteoside (Gbr. 2C). Luteolin, quercetin, atau apigenin sendiri juga menunjukkan penurunan viabilitas sel (Gbr. 2D). Sebaliknya, pengobatan quercetin hanya menyebabkan penurunan viabilitas yang signifikan pada kedua sel BMM dan RAW264.7, ketika sel-sel ini terpapar 10 mM dari setiap senyawa selama 2 hari dengan 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, atau keduanya (data tidak ditampilkan). Ketika konsentrasi senyawa ini diperlukan untuk menghambat 50 persen

pembentukan osteoklas dalam BMM (IC50) dihitung menggunakan kurva konsentrasi-aktivitas, IC50 dari acteoside, quercetin, luteolin, apigenin, dan EGCG masing-masing adalah 5,1, 2,3, 2,6, 4,8, dan 6,6 mM (Gbr. 2E). Hasil ini mirip dengan kasus dimana makrofag RAW264.7 diperiksa. Data ini menunjukkan bahwa luteolin dan quercetin memiliki aktivitas anti-klastogenik yang lebih tinggi daripada acteoside. Sebaliknya, quercetin pada IC50 juga memiliki efek toksik ringan pada sel (data tidak ditampilkan).

AkteosidaMenghambat Resorpsi Tulang oleh Makrofag Acteoside juga mencegah resorpsi tulang yang diperantarai RANKL dengan cara yang bergantung pada dosis, sebagaimana diukur dengan sistem model in vitro (Gbr. 3A). Resorpsi tulang secara signifikan dihambat ketika BMM diinkubasi dengan 1 mM acteoside (Gbr. 3B). Perlakuan akteosida 10 mM hampir sepenuhnya melemahkan pembentukan lubang yang diinduksi RANKL oleh BMM. Demikian pula, acteoside menurunkan resorpsi tulang dalam sel RAW264.7 yang dirangsang oleh RANKL (Gbr. S2A dan B). Kemampuan dariakteosidauntuk menghambat resorpsi tulang tergantung pada waktu pengobatan relatif terhadap stimulasi RANKL. Acteoside(10 mM) ditambahkan 4 hari setelah stimulasi RANKL tidak mengurangi pembentukan pit pada BMM, sedangkan itu menekan jumlah osteoklas yang terbentuk (Gbr. 3C). Hasil yang berbeda ini sebagian disebabkan oleh area pit yang sudah terbentuk setelah 4 hari pembentukan stimulasi RANKL (Gbr. 3D).

AkteosidaTurun-Mengatur Jalur Pensinyalan RANKL Awal

RANKL menginduksi aktivasi 3 MAPK dan NF-kB yang terkenal dalam prekursor osteoklas, dan aktivasi ini diperlukan untuk diferensiasi awal osteoklas. Untuk memahami kemungkinan mekanisme dimana acteoside menghambat osteoklastogenesis, kami menyelidiki efek acteoside pada MAPKs dan aktivasi NF-B dalam makrofag. Sel BMM dan RAW264.7 diberi perlakuan awal dengan 10 mM acteoside selama 2 jam dan kemudian distimulasi dengan 100 ng/ml RANKL selama 30 menit. Fosforilasi MAPK diperiksa dengan Western blotting dan analisis imunometrik. RANKL menginduksi fosforilasi p38, ERK, dan JNK dalam sel BMM (Gbr. 4A) dan RAW264.7 (Gbr. 4B). Acteoside mencegah peningkatan p-p38, p-ERK, dan p-JNK yang diinduksi RANKL ini. Hasil ini didukung oleh analisis imunometrik, yang pra-perawatan dengan 10 mM acteoside secara signifikan menghambat tingkat MAPK terfosforilasi dalam makrofag ini (Gbr. 4C). Perlakuan RANKL meningkatkan pengikatan DNA dari NF-kB, sedangkan acteoside menghambat aktivasi pengikatan NF-kB-DNA yang diinduksi oleh RANKL (Gbr. 5A). Penghambatan ini lebih menonjol di BMM daripada di sel RAW264.7. Acteoside juga mengurangi fosforilasi p65 dan IkBa yang dirangsang oleh RANKL dalam sel BMM dan RAW264.7 (Gbr. 5B dan C). Menambahkan 10 mMacteoside hampir sepenuhnya menghambat degradasi dan aktivasi IkBa di BMM (Gbr. 5B). Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut bahwa aktivasi NF kB terlibat dalam aksi acteoside, konstruksi promotor-luciferase kB ditransfusikan secara sementara ke dalam sel RAW264.7. Sel-sel yang diinkubasi dengan 100 ng/ml RANKL memiliki 3-aktivitas promotor kB lipat lebih tinggi, yang secara signifikan dilemahkan oleh 10 mM acteoside (Gbr. 5D).

Acteoside Menekan Produksi sitokin inflamasi dan Ekspresi TNF-a, c-Fos dan NFATc1 dalam Makrofag Terstimulasi RANKL

TNF-a, IL-1b, dan IL-6 penting dalam pembentukan dan fungsi osteoklas, yang dimediasi oleh pensinyalan NF-kB dalam makrofag yang distimulasi RANKL. RANKL merangsang produksi sitokin-sitokin ini, dan produksi ini berkurang secara nyata sebesar 10 mM sebelum perlakuan akteosida dalam BMM (Gbr. 6A). Demikian pula, acteoside melemahkan produksi sitokin yang diinduksi RANKL, kecuali IL-6, dalam makrofag RAW264.7 (Gbr. S3). Untuk memahami mekanisme molekuler aksi akteosida dalam osteoklastogenesis, kami meneliti lebih lanjut efek akteosida pada ekspresi TNF-a, c-Fos, dan NFATc1. RANKL mengatur ekspresi mRNA dari faktor-faktor ini dalam sel BMM dan RAW264.7 (Gbr. 6B dan C). Pretreatment dengan 10 mM acteoside secara signifikan menghambat ekspresi yang diinduksi RANKL dari faktor-faktor ini di keduanya

Sel BMM dan RAW264.7. Pretreatment acteoside juga sangat mengurangi tingkat protein c-Fos dan NFATc1 dalam BMM yang dirangsang RANKL (Gbr. 6D). Hasil ini menunjukkan bahwaakteosidamenurunkan regulasi mediator penginduksi RANKL pembentukan osteoklas pada tingkat gen dan protein.

Acteoside Mengurangi Generasi ROS Intraseluler dalam BMM dengan Cara yang Tergantung Dosis

Karena diketahui bahwa produksi ROS intraseluler berkorelasi dengan osteoklastogenesis terstimulasi RANKL, kami menyelidiki apakah acteoside menghambat produksi ROS selama diferensiasi osteoklas yang dimediasi RANKL menggunakan pewarna sensitif oksidasi yang permeabel, DCFH-DA. Analisis flow cytometry menunjukkan bahwa sinyal fluoresensi rata-rata spesifik untuk DCF dalam BMM tampaknya bergeser ke kanan setelah stimulasi dengan RANKL, dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati (Gbr. 7A). Pergeseran ini mirip dengan kasus dimana makrofag RAW264.7 diamati setelah stimulasi RANKL (data tidak ditampilkan). Mengobati BMM dengan acteoside mengurangi intensitas sinyal DCF dengan cara yang bergantung pada dosis. Pretreatment dengan 10 mM acteoside hampir sepenuhnya mengurangi tingkat ROS intraseluler yang dihasilkan selama diferensiasi osteoklas ke tingkat kontrol yang tidak diobati (Gbr. 7B).

Pemberian Acteoside Oral Menghambat Perubahan Penanda Biokimia Osteoporosis dan Pengeroposan Tulang pada Tikus Ovariektomi

Untuk mengeksplorasi efek akteosida pada pengeroposan tulang, kami menyiapkan model hewan osteoporosis dengan ovariektomi. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat badan antara OVX dan Shammice selama periode percobaan (data tidak ditampilkan). Kelompok tersebut memiliki kadar serum IL-1b dan IL-6 yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok Sham (Gbr. 8). Peningkatan sitokin inflamasi yang diinduksi ovariektomi ini dilemahkan oleh pemberian akteosida oral (kelompok AC). Tingkat serum penanda pergantian tulang seperti ALP, kalsium, TRAP5b, dan OC meningkat secara signifikan pada kelompok OVX. Dari penanda osteoporosis ini, peningkatan kadar kalsium, TRAP5b, dan OC pada tikus OVX tampaknya dihambat oleh pengobatan acteoside, sedangkan kadar serum ALP tidak diubah oleh pengobatan. Rata-rata beban fraktur maksimum ke tengah poros femoralis kanan secara signifikan lebih rendah pada kelompok OVX dibandingkan pada kelompok Sham (Gbr. 9A). Pengobatan acteoside meningkatkan cadangan fraktur maksimum dengan kelompok Sham. Ketika tulang kortikal femur dibedah dan diamati dengan mikroskop optik, fitur osteoporosis yang ditunjukkan pada kelompok OVX hampir sepenuhnya menghilang pada tikus AC (Gbr. 9B). Untuk memverifikasi efek acteoside pada model osteoporosis yang diinduksi OVX, parameter BMD dan morfologi tulang di trabekular femur proksimal ringan dianalisis dengan mikro-CT. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 9C, perubahan arsitektur trabekular femoralis ditemukan pada tikus OVX, sedangkan perubahan ini berkurang dengan pengobatan dengan acteoside. Hasil dari analisis mikro-CT mengungkapkan bahwa BMD, ukuran kekuatan tulang, berkurang secara dramatis pada tikus OVX (Gbr. 9D). Dibandingkan dengan kelompok Sham, tikus OVX juga menunjukkan perubahan signifikan pada BV/TV, Tb. Sp, dan Tb. N, tapi tidak Tb.Th. Pengobatan acteoside oral tikus OVX secara signifikan mencegah perubahan BMD serta BV/TV dan Tb.N.