Oligosakarida Memperbaiki Cedera Ginjal Akut Dengan Mengurangi Kelompok Diferensiasi 44-Memediasi Respons Imun pada Sel Tubular Ginjal

Abstrak:Cedera ginjal akut (AKI)adalah episode tiba-tibakerusakan ginjalyang biasa terjadi pada pasien yang dirawat di rumah sakit. Sampai saat ini, belum ada pengobatan ideal yang dikembangkan untuk menguranginyatingkat keparahan AKI. Oligo-fukoidan(FC) mengganggu kelompok diferensiasi protein permukaan sel tubulus ginjal 44 (CD44) untuk mencegah fibrosis interstitial ginjal; Namun, pengaruh oligosakarida terhadap AKI masih belum diketahui. Dalam penelitian ini, FC, galakto-oligosakarida (GOS), dan fructo-oligosakarida (FOS) dipilih untuk menyelidiki pengaruh oligosakarida pada AKI. Ketiga oligosakarida tersebut telah terbukti diserap sebagian oleh usus. Kami menemukan bahwa oligosakarida yang bergantung pada dosis mengurangi antigenisitas CD44 dan menekan ekspresi CD44, fosfo-JNK, MCP-1, IL-1 , dan TNF- yang diinduksi hipoksia di NRK-52E sel tubulus ginjal. Sementara itu, transfeksi siRNA CD44 dan inhibitor JNK SP600125 mengurangi ekspresi fosfo-JNK dan sitokin yang diinduksi hipoksia. Ligan CD44, hyaluronan, menangkal pengaruh oligosakarida pada CD44 dan fosfo-JNK. Pada 2 hari pasca operasi untuk cedera reperfusi iskemia, oligosakarida mengurangi peradangan ginjal, kreatin serum, MCP-1, IL-1 , dan TNF- pada tikus AKI. Pada 7 hari pasca operasi, pemulihan ginjal meningkat. Hasil ini menunjukkan bahwa FC, GOS, dan FOS menghambat kaskade CD44/JNK dan sitokin dalam sel tubulus ginjal yang diinduksi hipoksia, sehingga memperbaiki AKI dan peradangan ginjal pada tikus AKI. Karena itu,suplementasi oligosakaridaadalah strategi perawatan kesehatan potensial untuk pasien dengan AKI.

HERBAL BARU UNTUK PENYAKIT GINJAL

Kata kunci: cedera ginjal akut; kelompok diferensiasi 44; frukto-oligosakarida; galaktooligosakarida; oligo-fukoidan; peradangan

1. Pendahuluan

Cedera ginjal akut(AKI) ditandai dengan penurunan mendadak laju filtrasi glomerulus dan akibatnya peningkatan kreatinin serum. Kerusakan ini biasa terjadi pada pasien yang dirawat di rumah sakit dan unit perawatan intensif, terutama lansia. Iskemia, sepsis, dan nefrotoksisitas adalah penyebab utama AKI yang sering terjadi bersamaan sehingga mempersulit diagnosis dan pengobatan [1]. AKI yang parah menempatkan pasien yang dipulangkan pada risiko efek samping, seperti penyakit ginjal kronis, penyakit kardiovaskular, kanker, dan infeksi [2]. AKI berkembang pesat, dan tidak ada pengobatan efektif yang tersedia untuk menghindari atau mengurangi keparahannya. Asupan nutrisi spesifik dapat mengurangi cedera tubulus ginjal pada AKI [3]. Oleh karena itu, mempelajari pengaruh nutrisi spesifik terhadap AKI akan membantu memperbaiki AKI dan risiko yang dihadapi oleh pasien yang sudah pulang.

Peradangan dan rekrutmen leukositadalah mediator utama AKI. Ginjal, terutama sel tubulus ginjal, menghasilkansitokin inflamasiselama AKI, seperti IL-1, IL-6, protein chemoattractant monosit-1 (MCP-1), dan tumor necrosis factor- (TNF- ) [4,5] . Sitokin ini selanjutnya menginduksi peradangan sistemik dan rekrutmen leukosit. Meskipun beberapa subset leukosit memberikan efek perlindungan pada AKI (seperti sel T-regulator), sebagian besar neutrofil, monosit, dan sel dendritik berbahaya bagi pemulihan AKI [6]. Peradangan sistemik juga merugikan pemulihan AKI karena tingginya tingkat sitokin [7]. Di antara sitokin yang disekresikan oleh ginjal, MCP-1 terutama bertanggung jawab untuk perekrutan leukosit, merespons berbagai sitokin, termasuk IL-1 dan TNF- [8,9], dan memainkan peran penting dalam patogenesis cedera ginjal yang berbeda [10]. Dalam sel tubular proksimal manusia HK-2, ekspresi MCP-1 yang diinduksi hipoksia dimediasi oleh jalur c-Jun NH2- terminal kinase (JNK) [11]. Jalur p38 juga terlibat dalam ekspresi MCP-1 yang diinduksi albumin dalam sel epitel tubulus ginjal [12]. Oleh karena itu, regulasi jalur JNK dan p38 dapat mempengaruhi inflamasi dan rekrutmen leukosit pada AKI.

Oligosakarida adalah polimer sakarida yang mengandung 3-10 monosakarida yang tidak dapat dicerna dan merupakan komponen utama dari total prebiotik yang tersedia sebagai bahan tambahan makanan [13]. Kebanyakan frukto-oligosakarida (FOS) yang tertelan dalam tubuh manusia sepenuhnya difermentasi oleh flora kolon, dan sebagian kecilnya diperoleh kembali dalam urin [14]. Galacto-oligosakarida (GOSs) dapat diserap dalam darah dan kemudian diekskresikan dalam urin [15]. Situasi yang sama berlaku untuk fukoidan pada alga laut coklat [16]. Oligosakarida yang diserap dapat mempengaruhi reaksi biokimia dan pengenalan sel [17]. Penelitian kami sebelumnya mengungkapkan bahwa oligo-fucoidan (FC) mengganggu interaksi antara protein permukaan sel tubulus ginjal CD44 dan ligan ekstraselulernya, sehingga mencegah fibrosis interstisial ginjal [18]. Interaksi antara CD44 dan ligan ekstraselulernya mendorong jalur pensinyalan JNK [19]. Oleh karena itu, konsumsi oligosakarida setiap hari dapat mengurangi peradangan ginjal pada pasien AKI. Namun, pengaruh polimer ini terhadap AKI masih belum diketahui. Penelitian ini menyelidiki efek FC, FOS, dan GOS pada sel tubulus ginjal yang diobati dengan hipoksia dan tikus AKI dengan cedera reperfusi iskemia (IRI). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketiga oligosakarida menekan respons imun ginjal yang dimediasi CD44-dan mengurangi keparahan pasca-AKI. Oleh karena itu, penggunaan polimer ini sebagai suplemen nutrisi menghadirkan strategi pengobatan AKI yang baru

2. Bahan dan Metode

2.1. Bahan

FOS (rata-rata derajat polimerisasi <10), GOS (rata-rata derajat polimerisasi <8), dan FC (rata-rata derajat polimerisasi <5) diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Cat. No. OG32134), dan Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan). Oligosakarida dilarutkan dalam H2O sulingan ganda dan disaring menggunakan filter steril 0,22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman). Hyaluronan (HA) dan semua bahan kimia tingkat reagen lainnya diperoleh dari Sigma. Antibodi terhadap JNK (sc-7345), fosfo-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), dan TNF- (sc-52746) dibeli dari Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Antibodi terhadap p38 (9212) dan fosfo-p38 (9211) diperoleh dari Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antibodi terhadap Ly6G (ab25377) dan F4/80 (ab100790) dibeli dari Abcam (Cambridge, UK). Antibodi terhadap HIF-1 (NB100-105) dibeli dari Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).

2.2. Kultur Sel

Sel tubulus ginjal proksimal tikus (NRK-52E) dan garis makrofag tikus RAW264.7 dibeli dari Institut Penelitian dan Pengembangan Industri Makanan (Hsinchu, Taiwan); dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan larutan antibiotik/antijamur dan 10% serum janin anak sapi; dan disimpan pada suhu 37 ◦C dan kelembaban 95% dalam inkubator CO2. Setelah mencapai pertemuan 70%, sel-sel dikultur dalam media bebas serum dan diinkubasi semalaman sebelum percobaan. Untuk percobaan hipoksia, sel NRK-52E dan Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, USA) disimpan ke dalam toples persegi panjang (Mitsubishi Gas Chemical America), dan seluruh pengaturan ditempatkan di 37 ◦C inkubator selama 4 jam. Sel-sel tersebut kemudian dikultur semalaman dalam kondisi normal.

2.3. Analisis Western Blot

Singkatnya, 15 µg protein lisat NRK-52E diaplikasikan pada setiap jalur, dan hasilnya dianalisis dengan Western blot. Tingkat pita protein relatif diukur dari lima percobaan independen oleh perangkat lunak Quantiscan dari Biosoft (Cambridge, UK).

2.4. Transfeksi RNA Interferensi Singkat (si) pada CD44

SiRNA CD44 tikus (4390771) dibeli dari Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Setelah tumbuh hingga pertemuan 70%, sel-sel ditransfeksi dengan siRNA menggunakan reagen transfeksi Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) sesuai instruksi pabrik.

2.5. Uji Proliferasi Sel

Setelah sel NRK-52E hipoksia dikultur selama 24 jam, media yang sama digunakan untuk mengkultur sel RAW264.7 dalam 96-well plate (2000 sel/sumur). Setelah 24 jam inkubasi, proliferasi sel RAW264.7 dianalisis dengan menggunakan SRB Assay Kit (Abcam, Cat. No. ab235935) sesuai dengan instruksi pabrik.

2.6. Tes Antigenisitas CD44

CD44 tikus rekombinan diperoleh dari R&D Systems (Minneapolis, MN, USA, Cat. No. 6577-CD) dan digunakan untuk menghasilkan reaksi pengikatan dengan HA sesuai instruksi pabrik. Singkatnya, 20 ng/mL CD44 rekombinan tikus dicampur dengan konsentrasi FC, FOS, atau GOS yang berbeda selama 10 menit untuk menyelidiki pengaruh oligosakarida pada antigenisitas CD44. Campuran dianalisis menggunakan kit ELISA CD44 (Abcam, Cat. No. ab213928) sesuai dengan instruksi pabrik.

2.7. Hewan Eksperimental dan IRI Ginjal

Tikus 129S1 / SvImJ jantan berumur delapan minggu dibeli dari Lasco Technology (Taipei, Taiwan). Semua percobaan hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Eksperimental Universitas Kedokteran Taipei (persetujuan No. LAC-2019-0511) dan dibentuk oleh Panduan NIH untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium. Untuk induksi IRI, tikus (dengan berat 21-23 g) dilakukan penjepitan pedikel ginjal bilateral selama 30 menit dengan melakukan sayatan panggul [20]. Tikus dibius dengan anestesi inhalan dengan isofluran sebelum operasi. Tikus yang dioperasi palsu menjalani operasi serupa, kecuali penjepitan pedikel ginjal. Semua tikus diberi oligosakarida melalui oral gavage dari 1 hari sebelum hingga 2 hari setelah operasi IRI. Tikus percobaan dibagi menjadi lima kelompok berikut dengan n=8 untuk hasil pada hari ke 3 dan hari ke 7: (1) kelompok sham; (2) kelompok AKI; (3) Kelompok AKI yang diberi pakan FC (10 mg/kg/hari); (4) kelompok AKI yang diberi FOS (10 mg/kg/hari); dan (5) kelompok AKI yang diberi GOS (10 mg/kg/hari). Tikus dikorbankan 3 atau 7 hari setelah operasi, dan darah dikumpulkan dan dianalisis menggunakan alat analisa biokimia dan peralatan ELISA. Tingkat kreatinin serum masing-masing tikus dianalisis untuk menilai perkembangan AKI. Morfologi ginjal diperiksa dengan pewarnaan periodik acid-Schiff (PAS) dan pewarnaan imunohistokimia (IHC) pada bagian parafin 2 µm yang difiksasi dengan formalin.

2.8. Pewarnaan Imunohistokimia

Jaringan ginjal difiksasi dengan paraformaldehyde buffer 4%, tertanam dalam parafin, dan dipotong menjadi bagian 2 μm untuk pewarnaan dengan kit HRP DAB Sistem Deteksi Quanto UltraVision (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) dan hibridisasi dengan antibodi utama sesuai instruksi pabrik. .

2.9. Pewarnaan PAS

Bagian ginjal diwarnai dengan PAS Stain Kit (Abcam, Cat. No. ab150680) sesuai dengan instruksi pabrik.

2.10. Uji ELISA

Media kultur sel NRK-52E dan sampel serum tikus percobaan dikumpulkan dan dianalisis menggunakan kit ELISA MCP-1 (Abcam, Cat. No. ab208979) dan IL-1 Kit ELISA (Abcam, Cat. No. ab197742). Sampel serum juga dianalisis menggunakan kit TNF-ELISA (Sistem R&D, Cat. No. MTA00B) dan kit ELISA terkait neutrofil gelatinase-related lipocalin (NGAL) (Sistem R&D, Cat. No. MLCN20) oleh instruksi pabriknya.

2.11. Tes Statistik

Perbedaan signifikan antara kedua kelompok ditentukan dengan menggunakan uji-t Student. Perbedaan dianggap signifikan untuk nilai p<0.05

3. Hasil

3.1. Oligosakarida Menghambat Peningkatan CD44 dan Sitokin pada Sel NRK-52E Hipoksia

Ekspresi CD44 dalam sel NRK-52E yang diobati dengan FC, FOS, dan GOS pertama kali dipantau untuk mengevaluasi pengaruh oligosakarida pada sel tubulus ginjal. Ekspresi CD44 yang diinduksi hipoksia dihambat oleh ketiga oligosakarida dalam kisaran 0.05–0.5 mg/mL (Gambar 1A). Oleh karena itu, dosis oligosakarida 0,1 mg/mL digunakan dalam percobaan sel berikut. Dalam sistem yang disiapkan, pengobatan hipoksia secara luar biasa menginduksi ekspresi penanda hipoksia HIF-1 dalam sel NRK-52E, yang menunjukkan bahwa sel berada dalam keadaan hipoksia (Gambar 1B). Hipoksia meningkatkan regulasi tingkat JNK, MCP-1, IL-1 terfosforilasi, dan TNF- tetapi tidak pada sel yang diobati dengan oligosakarida (Gambar 1B, C). Ekspresi JNK meningkat pada sel hipoksia tetapi tidak pada sel yang diobati dengan FC atau FOS. GOS tidak mempengaruhi ekspresi JNK dalam sel hipoksia tetapi menekan peningkatan regulasi JNK terfosforilasi. Oleh karena itu, oligosakarida dapat menghambat transduksi sinyal JNK yang diinduksi hipoksia dan ekspresi sitokin dalam sel tubulus ginjal. Meskipun FC dan GOS meningkatkan regulasi fosfosforilasi p38 dalam sel hipoksia, ekspresi protein ini tidak meningkat dalam sel hipoksia. Temuan ini menunjukkan bahwa p38 tidak memainkan peran kunci dalam respons yang diinduksi hipoksia pada sel NRK-52E.

3.2. CD44 dan JNK Memainkan Peran Penting dalam Peningkatan Sitokin pada Sel NRK-52E Hipoksia

Ekspresi CD44, JNK terfosforilasi, dan sitokin dalam sel tubulus ginjal semuanya dipengaruhi oleh oligosakarida, namun hubungannya masih harus dijelaskan. Untuk menyelidiki peran CD44 dalam transduksi sinyal JNK dan ekspresi sitokin dalam sel hipoksia, sel NRK-52E ditransfeksi dengan siRNA CD44 dengan dosis berbeda. SiRNA CD44 pada pukul 50 dan 100 malam secara efisien memblokir peningkatan ekspresi CD44 hipoksia dan secara signifikan menghambat peningkatan kadar JNK, MCP- 1, IL-1 terfosforilasi, dan TNF- yang diinduksi hipoksia (Gambar 2A). Pengaruh pemblokiran CD44 pada ekspresi JNK berhubungan dengan dosis siRNA. Ekspresi JNK dalam sel hipoksia diinduksi oleh siRNA CD44 pada 50 pM tetapi dihambat pada 100 pM. Kedua dosis tersebut menekan peningkatan regulasi JNK terfosforilasi. Inhibitor selektif untuk JNK, SP600125, secara signifikan mengurangi ekspresi MCP-1, IL-1 , dan TNF- dalam sel NRK-52E hipoksia (Gambar 2B). Hasil ini menunjukkan bahwa efek penghambatan transfeksi siRNA CD44 pada sitokin yang diinduksi hipoksia disebabkan oleh penurunan JNK terfosforilasi.

Gambar 1. Efek penghambatan oligosakarida pada transduksi sinyal CD44 pada sel NRK-52E hipoksia. Sel-sel tersebut diberi perlakuan awal dengan FC, FOS, atau GOS selama 30 menit dan kemudian dilakukan kultur hipoksia. Ekspresi protein dianalisis dengan Western blotting. (A) Efek oligosakarida yang bergantung pada dosis pada ekspresi CD44. (B) Pengaruh oligosakarida pada sinyal terkait CD44-. Konsentrasi oligosakarida ditetapkan sebesar 0,1 mg/mL. Peningkatan relatif pada pita protein juga disajikan dalam bentuk diagram batang (C). Hasil dinyatakan sebagai mean ± SD (n=4).

Gambar 2. Peran CD44 dan JNK dalam respon inflamasi yang diinduksi hipoksia pada sel NRK-52E. Ekspresi protein dianalisis dengan Western blot. (A) Efek penghambatan transfeksi siRNA CD44 pada JNK dan sitokin terfosforilasi. (B) Efek penghambatan SP600125 pada sitokin. Sel-sel diberi perlakuan awal dengan 20 µM SP600125 selama 30 menit sebelum pengobatan hipoksia. Peningkatan relatif pada pita protein juga disajikan dalam bentuk diagram batang. Hasil dinyatakan sebagai mean ± SD (n=4).

3.3. Sekresi Sitokin yang Diinduksi Hipoksia dalam Sel Tubular Ginjal Mendorong Proliferasi Makrofag

Peradangan merupakan mediator cedera ginjal pada AKI. Oleh karena itu, pengaruh wahana oligosaccha pada leukosit diperiksa. Gambar 3A menunjukkan bahwa FC, FOS, dan GOS tidak mempengaruhi proliferasi sel makrofag RAW264.7. Proliferasi sel RAW264.7 didorong oleh media kultur 24-jam untuk sel NRK-52E hipoksia (Gambar 3B) tetapi tidak oleh media untuk sel NRK-52E hipoksia yang diobati dengan oligosakarida. Yang pertama memiliki tingkat MCP-1 dan IL-1 yang lebih tinggi dibandingkan yang kedua (Gambar 3C, D). Ketiga oligosakarida secara signifikan mengurangi MCP-1 dan IL-1 dalam media kultur sel NRK-52E hipoksia. Oleh karena itu, FC, FOS, dan GOS dapat mengurangi ekspresi dan sekresi sitokin dalam sel tubulus ginjal yang hipoksia dan, akibatnya, mengurangi peradangan yang disebabkan oleh kerusakan sel tubulus ginjal.