Obacunone melemahkan Fibrosis Hati Dengan Meningkatkan Efek Anti-Oksidan GPx-4 Dan Penghambatan EMT

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Abstrak:Obacunone, triterpenoid limonin yang diekstrak dari Phellodendronchinense Schneid atau tanaman Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, memunculkan berbagai efek farmakologis seperti anti-inflamasi, anti-neoplastik, anti-oksidasi, dan anti-fibrosis paru-paru. Namun, efek anti-fibrotik dari oba-cone dan mekanisme dasar yang mendetail pada fibrosis hati masih belum jelas. Fibrosis hati adalah penyakit melemahkan yang mengancam kesehatan manusia. Transforming growth factor (TGF)- /P-Smad adalah jalur utama fibrosis yang ditandai dengan transformasi epitel-mesenkim (EMT) dan deposisi kolagen, disertai dengan radikal bebas oksigen yang berlebihan. Nrf-2 bertindak sebagai pengatur anti-oksidatif utama yang mendorong ekspresi berbagai gen terkait antioksidan. Glutathione peroxidase-4(GPx-4)adalah anggota dari keluarga glutathione peroxidase yang secara langsung menghambat oksidasi fosfolipid untuk mengurangi stres oksidatif. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengeksplorasi peran tulang punggung dalam model fibrosis hati tikus yang diinduksi oleh karbon tetraklorida (CCl4) dan dalam sel stelata hati (garis sel LX2) yang ditantang dengan TGF-. Obacunone menunjukkan efek perbaikan yang kuat pada fibrosis hati baik pada LX2 yang diaktifkan dan pada jaringan hati tikus dengan penurunan kadar -SMA, kolagen1, dan vimentin. Obacunone juga sangat menekan sinyal TGF-/P-Smad dan proses EMT. Sementara itu, obacunone memberikan efek anti-oksidasi yang kuat dengan mengurangi tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) di kedua model. Efek antioksidan tulang punggung dikaitkan dengan aktivasi GPx-4 dan Nrf-2. Selain itu, efek terapeutik tulang punggung pada sel LX2 secara signifikan dihilangkan secara in vitro ditambah dengan antagonis GPx-4 RSL3, secara paralel dengan peningkatan kadar ROS.vitamin c puritanDengan demikian, kami menunjukkan bahwa tulang punggung mampu melemahkan fibrosis hati melalui peningkatan sinyal GPx-4 dan penghambatan jalur TGF- /P-Smad dan proses EMT.

Kata kunci:tulang punggung; fibrosis hati; EMT; sel stellata hepatik; GPx-4;TGF- ;stres oksidatif

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

1. Perkenalan

Hepatitis kronis biasanya disebabkan oleh virus hepatitis, steatosis nonalkohol, hepatitis alkoholik, dan hepatitis autoimun. Cedera hati yang terus-menerus dapat berakhir dengan fibrosis hati, atau bahkan kanker hati, yang berdampak fatal bagi kesehatan manusia [1]. Fibrosis hati adalah jenis respon luka non-penyembuhan di bawah faktor cedera terus menerus yang ditandai dengan akumulasi berlebihan matriks ekstraseluler (ECM) dan pembentukan bekas luka [2]. Sel-sel stelata hati (HSC) biasanya dalam keadaan istirahat dalam kondisi normal, mereka menjadi aktif secara menyimpang di bawah cedera hati kronis dan ditampilkan dengan proliferasi dan sekresi ECM yang tinggi [3], dilambangkan sebagai myofibroblasts [4]. Memahami mekanisme aktivasi HSC sangat berharga untuk pengembangan terapi baru untuk mengobati fibrosis hati.

Transforming growth factor(TGF- ) mendorong respon inflamasi dengan merangsang ekspresi Interleukin-1 (IL-1) dan Interleukin-6(IL-6) dalam monosit [5]. Selain itu, ia menginduksi metastasis kanker melalui transformasi epitel-mesenkim (EMT) dan pelepasan kekebalan tumor [6-8]. EMT mengacu pada proses fisiologis dinamis di mana sel epitel kehilangan polaritasnya dan berubah menjadi sel mesenkim seperti fibroblas dan miofibroblas, sehingga mengarah pada perkembangan fibrosis [9]. Terjadinya EMT selalu dikaitkan dengan downregulasi E-cadherin dan upregulation penanda sel mesenkim, seperti N-cadherin dan keong [10]. Aktivasi TGF- -Smad adalah salah satu jalur intraseluler utama dalam EMT serta pembentukan myofibroblast [11].

Stres oksidatif dianggap sebagai salah satu penyebab utama fibrosis dengan kelebihan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) [12]. Tingkat ROS yang tinggi menyebabkan kerusakan struktural pada biomolekul, seperti protein, lipid, dan DNA, yang pada akhirnya menyebabkan cedera sel dan memicu fibrosis [13]. Di bawah stres oksidatif, dimer Nrf-2-Keep-1 terdisosiasi, faktor pernapasan inti-2(Nrf-2) diangkut ke dalam nukleus, dan menginduksi ekspresi berbagai enzim antioksidan dengan mengikat dengan elemen respon antioksidan (ARE) mengurangi tingkat ROS [14]. Glutathione peroxidase-4 (GPx-4) ​​bertindak sebagai protein antioksidan dengan aktivitas glutathione peroxidase, yang terutama bertanggung jawab untuk penghambatan oksidasi fosfolipid dan produksi ROS dalam proses ferroptosis [15].sistancheStudi tikus telah menunjukkan bahwa fibrosis diperburuk setelah hilangnya Nrf-2 atau GPx-4 [16,17].

Cistanche dapat anti-penuaan

Saat ini, ada beberapa obat yang tersedia untuk pengobatan fibrosis hati, termasuk yang memiliki sifat anti-inflamasi [18], antioksidan [19], dan agonis reseptor teraktivasi proliferator (PPAR) peroksisom [20]. Dalam penelitian terbaru, Prof. Yu menemukan bahwa pasien dengan sirosis hati memiliki tingkat oksidasi lipid yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol yang sehat dalam spesimen klinis [21]. Beberapa obat antioksidan seperti resveratrol[19] dan asam ursolat |13] telah menunjukkan efek yang baik pada fibrosis. Bukti ini secara kumulatif menunjukkan bahwa anti-oksidasi adalah strategi yang menjanjikan untuk mengobati anti-fibrosis.

Pirfenidone (PFD) adalah obat piridin untuk fibrosis paru idiopatik (IPF), sementara itu juga memanifestasikan efek terapeutik yang baik pada fibrosis hati dalam beberapa penelitian [22,23]. Dengan demikian, PFD dipilih sebagai obat kontrol positif dalam penelitian ini. Obacunone(Oba) adalah senyawa limonoid alami yang diekstrak dari tanaman rutaceous seperti Phellodendri dan Dictamnus-dasicarpus [24], yang memiliki berbagai sifat biologis seperti antiinflamasi |25, antioksidan [26], dan antitumor [27]. Laporan terbaru mengungkapkan bahwa Oba adalah agonis Nrf-2 yang kuat, yang secara efektif mengurangi fibrosis paru dengan induksi CCL4 dan kerusakan oksidatif pada sel MDA-MB-231 yang disebabkan oleh H, O2. Lebih penting lagi, Oba tidak beracun untuk tikus [28]. Namun, tidak ada laporan tentang efek Oba pada fibrosis hati yang dilaporkan, terutama pada GPx-4 yang memediasi oksidasi anti-fosfolipid, sinyal TGF- -Smad, dan proses EMT. Di sini, kami bermaksud untuk mengeksplorasi efek Oba pada fibrosis hati dan menentukan mekanisme molekuler yang mendasarinya.

2. Hasil

2.1. Oba Menghambat TGF- -Aktivasi Lx yang Diinduksi-2

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Menariknya, dengan peningkatan konsentrasi Oba, efek penghambatan a-SMA tidak meningkat secara signifikan (Gambar 1B).apa itu cistanche?Jadi, kami memilih konsentrasi 20 M untuk percobaan berikut, dengan PFD sebagai kontrol positif. Oba secara efektif menghambat tingkat protein -SMA, kolagen-1, vimentin, dan faktor pertumbuhan jaringan ikat (CTGF) (Gambar 1C), di aHSCs[3,4]. Selain itu, Oba mengurangi tingkat ekspresi mRNA -SMA, kolagen-1, dan vimentin (Gambar 1D). Hasil imunofluoresensi selanjutnya memverifikasi bahwa sinyal pewarnaan positif -SMA jelas berkurang oleh Oba (relatif terhadap kelompok TGF-, karena jumlah sel darah merah berkurang setelah pengobatan dengan Oba) di Lx-2(Gambar 1E). Hasil ini menunjukkan bahwa Oba memberikan efek penghambatan yang baik pada aktivasi Lx-2.

2.2.Oba Menghambat Sinyal TGF- /Smad, Proses EMT, dan Efek Anti-Peradangan yang Diberikan

Untuk menentukan mekanisme molekuler yang mendasari efek anti-fibrosis di atas, tingkat ekspresi protein TGF-Receptor, P-Smad, dan -SMA diamati, yang secara signifikan dihambat oleh Oba di aHSCs (Gambar 2A). Selain itu, protein tingkat ekspresi N-cadherin dan siput berkurang, sedangkan tingkat ekspresi protein E-cadherin dipromosikan (Gambar 2B), menunjukkan bahwa jalur EMT juga diblokir [3]. Selain itu, kami menemukan bahwa Oba menginduksi penurunan tingkat IL-6(Gambar 2C).Cistanche anti penuaanUntuk mengevaluasi lebih lanjut efek Oba pada peradangan, pertama-tama kami merangsang sel-sel HepG-2 (sejenis garis sel karsinoma hepatoseluler manusia) dengan 20 nmol CCl4, diikuti dengan pengobatan dengan 20 uM Oba. Hasil ini menunjukkan bahwa Oba dapat mengurangi tingkat ekspresi mRNA dan protein IL-6 dalam CCl4-HepG yang distimulasi-2(Gambar 2D). Secara keseluruhan, oba menunjukkan beberapa efek anti-fibrosis dengan menghambat sinyal TGF- /Smad, dan proses EMT, serta antiinflamasi.

2.3. Efek Anti-Fibrosis Oba Bergantung pada Peningkatan Kapasitas Antioksidan dengan Mengaktifkan GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 M, viabilitas sel Lx-2 menurun secara signifikan; oleh karena itu, 0.75-μM RLS dipilih untuk mengintervensi ekspresi GPx-4. Hasil Western blot menunjukkan bahwa ketika RSL3 ditambahkan dalam aHSC, ekspresi protein GPx-4 berkurang dan penanda profibrotik termasuk -SMA dan vimentin semuanya terbalik secara signifikan, menunjukkan pentingnya GPx-4 dalam memediasi efek anti-fibrosis Oba (Gambar 3D). Sementara itu, Oba jelas mengurangi tingkat ROS aHSCs oleh detektor fluoresen ROS, dan efek ini tampaknya diblokir oleh RSL3 (Gambar). Data ini menunjukkan bahwa tingkat ROS fosfolipid yang lebih rendah yang dimediasi oleh GPx-4 adalah anti-fibrosis utama. sinyal Oba.

2.4. Oba Melemahkan CCl4-Fibrosis Hati Tikus yang Diinduksi

Fibrosis hati yang diinduksi CCl4-adalah salah satu model tikus yang paling umum digunakan untuk mempelajari fibrosis hati [3]. Pada tingkat histologis, Oba secara signifikan meringankan patologi hati, dibuktikan dengan deposisi kolagen yang diperbaiki yang ditunjukkan dengan pewarnaan Masson dan pewarnaan anti-SMA. (Gambar 4A-D). Kemudian ditentukan kadar serum alanine transaminase (ALT)/aspartate transaminase (AST) untuk menguji tingkat kerusakan hati, dibandingkan dengan mencit CCL4, kelompok Oba dosis rendah dan kelompok PFD secara signifikan menurunkan kadar ALT (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba Meningkatkan Ekspresi GPx-4, Mengurangi Peradangan, Ekspresi Protein Terkait EMT, dan Mengurangi Tingkat Oksidasi Lipid pada CCl4-Fibrosis Hati yang Diinduksi

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A, Oba menghambat ekspresi protein IL-6 dan terjadinya EMT pada hati fibrotik tikus dengan penurunan kadar siput dan N-cadherin tetapi kadar E-cadherin yang lebih tinggi. Selain itu, ekspresi protein Nrf-2 dan GPx-4 jelas meningkat setelah pengobatan dengan Oba dosis sedang dan tinggi (Gambar 5B).manfaat cistancheHasil Pewarnaan Imunohistokimia (IHC) menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok model, jumlah sel positif GPx-4 (coklat) dalam kelompok Oba dosis tinggi dan menengah meningkat secara signifikan (Gambar 5C, E). Kami selanjutnya menguji tingkat stres oksidatif pada hati tikus dan menemukan bahwa, dibandingkan dengan kontrol, intensitas fluoresensi ROS kelompok model tampaknya lebih tinggi. Di sisi lain, tingkat ROS menurun secara signifikan setelah pengobatan dengan Oba (Gambar 5D, F).

3. Diskusi

Fibrosis adalah penyakit intim di dunia. Apapun etiologinya, termasuk infeksi virus, hepatitis alkoholik atau nonalkohol, dan respon autoimun, semuanya berakhir dengan fibrosis akibat cedera hati kronis [1]. Aktivasi HSC adalah peristiwa sentral yang mendasari fibrosis hati. HSC diaktifkan dengan produksi yang menyimpang dari berbagai faktor fibrogenik dan deposisi ECM [2,3]. Pensinyalan aktivasi Smad kanonik terkait TGF- -terkait, proses EMT serta peradangan kronis terkait IL-6-dilaporkan terlibat dalam proses di atas [3,4]. Untuk mengevaluasi efek anti-fibrosis Oba pada fibrosis hati, pertama-tama kami berfokus untuk menentukan efeknya pada aktivasi Lx-2 yang diinduksi oleh TGF- , dan kemudian memverifikasi efek anti-fibrosis in-vivo dengan menggunakan CCl4-menginduksi model tikus fibrosis hati pada akhirnya.

Oba adalah senyawa limonoid alami [24] dan efek biologisnya terutama meliputi fungsi anti-inflamasi [25], antioksidan [26], dan anti-tumor [27]. Baru-baru ini, ditemukan bahwa Oba adalah agonis Nrf-2 yang kuat dan efektif dan memberikan efek fibrosis antipulmoner pada tikus [28]. Namun, bukti masih kurang dalam efek anti-fibrosis hati dan mekanisme molekuler terkait. Di sini, ekspresi berlebih dari -SMA, kolagen 1, dan CTGF semuanya dihambat oleh Oba dalam model Lx-2 yang distimulasi dengan TGF- . Pensinyalan EMT yang ditingkatkan juga secara efektif ditekan oleh Oba.

Telah dikonfirmasi bahwa stres oksidatif merupakan kontributor penting untuk fibrosis [12]. Spesies oksigen reaktif (ROS) adalah istilah umum untuk molekul atau ion teroksidasi dengan aktivitas biologis dan produksi berlebih dari berbagai ROS di hepatosit dapat menyebabkan kematiannya dan menimbulkan fibrosis hati [13]. Sebaliknya, HSC yang beristirahat diaktifkan setelah cedera sel hati dan ROS yang berlebihan memperkuat lebih banyak aktivasi HSC dan berakhir dengan fibrosis hati [12]. Oleh karena itu, meredam stres oksidatif yang berlebihan menjadi pengobatan yang efektif untuk fibrosis.

Nrf-2 adalah pengatur kritis stres anti-oksidatif, Nrf terfosforilasi yang diaktifkan-2 ditranslokasikan ke dalam nukleus untuk mendorong regulasi protein antioksidan hilir, GST, HO1[15]. Banyak aktivator kimia alami Nrf2 dilaporkan memiliki efek anti-fibrosis, seperti tert-butylhydroquinone dan curcumin. Di antara semua protein anti-oksidan, glutathione peroxidase-4(GPx-4) adalah anggota dari keluarga glutathione peroxidase (GPx1-8) dan memfasilitasi keseimbangan redoks dengan mereduksi glutathione [ 30-32]. Terbukti bahwa ekspresi glutathione peroksidase-7 yang lebih tinggi menghambat penyakit perlemakan hati non-alkohol dengan menurunkan produksi ROS [33]. GPx-4 mereduksi fosfolipid peroksida pada membran lipid untuk melindungi sel dari cedera oksidatifJ15]. Kazuya Tsubouchi dkk. menemukan bahwa ekspresi GPx-4 berkurang pada jaringan fibrosis paru-paru tikus yang diinduksi oleh bleomycin, dan fibrosis lebih parah ketika gen GPx-4 dihilangkan. Selain itu, peroksidasi lipid dan jalur TGF-/P-Smad ditingkatkan secara signifikan pada fibroblas paru ketika gen GPx-4 habis [17]. Baru-baru ini, lebih banyak bukti yang mendukung bahwa ROS yang diturunkan dari fosfolipid terlibat dalam kematian sel khusus, yang disebut ferroptosis. Inhibitor GPx-4, RSL3, juga diterapkan sebagai penginduksi ferroptosis [21,34].

Dalam percobaan kami, kami menemukan bahwa Oba mengerahkan kapasitas antioksidan dengan mengatur Nrf-2 dan GPx-4 dan menurunkan Nox-2. Khususnya, efek anti-fibrosis Oba melemah secara signifikan, ketika gen GPx-4 dihambat oleh RSL3, inhibitor GPx-4. Secara konsisten, tingkat ROS yang berkurang dengan pengobatan Oba juga tercerahkan. Pengamatan in vitro ini sangat mendukung bahwa ROS anti-fosfolipid yang dimediasi GPx-4-sangat penting untuk efek perlindungan Oba.

Untuk memvalidasi hasil pengobatan anti-fibrosis Oba dalam sel LX2 di atas, fibrosis hati tikus yang diinduksi CCl4-diperiksa juga. CCl4 adalah sejenis racun hepatotropik, degradasi yang dimediasi enzim mikrosomal P450 menghasilkan radikal bebas yang sangat reaktif untuk menghancurkan integritas membran sel, pada gilirannya, memicu serangkaian disfungsi hati dan cedera, yang akhirnya berkembang menjadi fibrosis hati [35]. Dalam percobaan kami, Oba menunjukkan efek kuratif yang baik pada fibrosis hati yang diinduksi CCl. Ini mengurangi kerusakan hati dengan tingkat AST yang lebih rendah, area bundel serat kolagen menjadi lebih kecil, dan ekspresi protein a-SMA, CTGF, Kolagen-1, siput, N-cadherin, dan IL{{10 }} semuanya dikurangi. Sementara pensinyalan anti-oksidan, ekspresi protein Nrf-2, dan GPx-4 semuanya meningkat juga, tingkat ROS yang lebih tinggi menurun. Hasil ini lebih lanjut mengkonfirmasi efek anti-fibrosis in vitro oleh Oba dan pensinyalan terkait, terutama penghambatan EMT dan efek anti-oksidan oleh Nrf-2 dan GPx-4.

Singkatnya, kami menyimpulkan bahwa Oba mengurangi TGF- -menginduksi aktivasi HSC dan CCl4-menginduksi fibrosis hati melalui berbagai mekanisme. Pertama, Oba menghambat jalur klasik TGF-/Smad, EMT, dan produksi IL-6. Kedua, menunjukkan kapasitas antioksidan yang sangat baik dengan meningkatkan ekspresi Nrf-2 dan GPx-4. ROS anti-fosfolipid yang dimediasi oleh GPx-4terutama berkontribusi terhadap efek anti-fibrosisnya. Oleh karena itu, Oba dapat menjadi calon bupati kimia untuk pencegahan dan pengobatan fibrosis.

Oba menunjukkan beberapa efek penyembuhan pada fibrosis hati yang diinduksi CCl4-pada tikus C57. Oba dapat menurunkan ekspresi biomarker protein fibrosis, seperti: -SMA, CTGF, dll. Sementara itu, Oba mengurangi ekspresi protein I-6, E-cadherin, dll. menunjukkan tanda-tanda hasil yang lebih baik ke rendah-Oba dan tinggi-Oba dalam hal ekspresi relatif dari protein ini, meskipun, secara statistik tidak signifikan. Namun, ini menunjukkan bahwa dosis optimal dapat menjadi faktor penting dalam proses ini, dan kami akan mengeksplorasi fenomena ini dalam percobaan berikutnya. Selain itu, kami menemukan bahwa ROS yang lebih rendah dan derajat fibrosis hati dengan ekspresi Nrf-2 dan GPx-4 yang mengatur naik. Jadi, kami percaya bahwa Oba dapat meredakan fibrosis hati dengan mengatur Nrf-2 dan GPx-4. Namun, PFD mungkin memiliki tindakan terapeutik yang lebih baik daripada Oba baik secara in vivo maupun vitro. Namun, Oba lebih baik daripada PFD pada efek anti-oksidan, kondusif untuk meningkatkan kemungkinan menemukan obat baru untuk efek anti-hati-fibrogenik dari sisi anti-oksidan, dan memberikan sedikit kontribusi bagi kesehatan manusia.

4. Bahan dan Metode

4.1. Bahan Kimia dan Reagen

Oba (no.B20553, kemurnian Lebih besar atau sama dengan 98 persen ) dan RSL3 (no. S81241, kemurnian Lebih besar dari atau sama dengan 98 persen) dibeli dari YUANYE Bio-Technology Co., Ltd.(Shanghai, China) dan dibubarkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) (no.R21950; YUANYE) dengan konsentrasi masing-masing 72,64 mg/mL dan 6mmol. Setelah sterilisasi filter, larutan yang dihasilkan diawetkan pada -20 derajat C. Larutan ditambahkan ke media kultur untuk mencapai konsentrasi DMSO akhir<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Kultur Sel dan Desain Eksperimental

Garis sel bintang hati manusia Lx-2 dan garis sel kanker hati manusia Hepg-2 (semuanya bersumber dari Departemen Farmasi, Universitas Kedokteran Militer Keempat, Cina) dibiakkan dalam Media Elang Modifikasi Dulbecco ( DMEM) dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi dan 1 persen penisilin (Thermo Fisher Scientific) dan streptomisin (Thermo Fisher Scientific), dan kemudian dipertahankan pada suhu 37C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5 persen CO2 dan 95 persen udara. Untuk mengevaluasi pengaruh Oba pada viabilitas sel Lx-2, Lx-2 diplank dengan 1×10* sel/sumur dalam piringan 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam sebelum penambahan dari Oba. Kemudian, Lx-2 diperlakukan dengan konsentrasi Oba yang berbeda (10,20, 40,80, dan 160 wM dan dikultur selama 24,48, atau 72 jam. Viabilitas sel diuji dengan CCK8. Untuk mengevaluasi efek Oba pada aktivasi Lx-2, Lx-2 dikultur dengan media bebas serum selama 12 jam, diikuti dengan stimulasi dengan TGF- (10ng/mL,24 jam) dan pengobatan dengan Oba atau PFD. Untuk mengevaluasi efek Oba pada peradangan, Hepg-2 distimulasi oleh CCl4 (20 nm,8 jam) dan diobati dengan 20 M Oba. Pada akhir kultur, sel-sel dikumpulkan dan dikenai Western blotting dan analisis qPCR real-time.

4.3. Hewan dan Desain Eksperimental

Tikus jantan C57 dengan berat 20± 0,5 g (Pusat Hewan Laboratorium Universitas Kedokteran Militer Keempat) ditempatkan di bawah kondisi suhu 25 derajat ± 2 derajat yang sesuai dan siklus terang/gelap 12-jam dengan akses gratis ke air dan makanan. Setiap percobaan dalam penelitian ini dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Universitas Kedokteran Militer Keempat tentang Perawatan Hewan. Tikus c57 didistribusikan secara acak ke dalam 6 kelompok (n=6 di setiap kelompok) sebagai berikut: i) kelompok kontrol palsu, i) kelompok model, ii) kelompok Oba tinggi (CCl4 ditambah 6mg/kg Oba),io )kelompok Oba sedang(CCl4 ditambah 3 mg/kg Oba）, kelompok Oba rendah CCl4 ditambah 1,5 mg/kg Oba）, dan vi） kelompok PFD CCl4＋ PFD）. Kelompok model diberi perlakuan CCl4 (30 persen CCl4/minyak zaitun,5 mL/kg injeksi intraperitoneal) tiga kali seminggu selama 6-minggu untuk menginduksi fibrosis hati.Kelompok lain diberi makan dengan dosis Oba atau PFD yang berbeda dan volume yang sama dari infeksi CCil4 intraperitoneal untuk periode 6-minggu. Volume minyak zaitun yang sama sebagai pengganti CCl4 diberikan ke C57 oleh ipas a sham control. Setiap percobaan dalam artikel ini dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Universitas Kedokteran Militer Keempat untuk Hewan Peduli.

4.4.Western Blotting

Hati C57 atau sel yang dikultur dihomogenkan atau dilisiskan dalam buffer RIPA dengan menggunakan alat pemecah jaringan atau pengikisan sel (Layanan, KZ-2). Konsentrasi protein diukur menggunakan BCA Protein Assay Kit. Lisat disentrifugasi (4 derajat, 12,000 rpm, 5 menit), dan supernatan dikumpulkan. Langkah-langkah operasi diikuti seperti yang dilaporkan sebelumnya [14]. Sampel dipindai di bawah sistem Pencitraan dan Analisis Chemiluminescent (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Analisis qPCR Waktu Nyata

Hati C57 atau sel yang dikultur dihomogenkan atau dilisiskan dalam reagen Trizol dengan bantuan alat pemecah jaringan untuk mengekstrak RNA total. Total RNA ditranskripsi balik menjadi cDNA dengan menggunakan Kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand. -aktin digunakan untuk referensi internal. RT-qPCR dilakukan pada 7500 Real-time qPCR System (Applied Biosystems) dengan reagen SYBR Premix Ex Taq. Primer gen manusia yang digunakan tercantum dalam Tabel 1.

Artikel ini disarikan dari Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules