NGF Memodulasi Metabolisme Kolesterol Dan Merangsang Sekresi ApoE di Sel Glial Memberikan Perlindungan Saraf Terhadap Stres Oksidatif Bagian 2

2.6. Sekresi ApoE yang Dimediasi NGF oleh U373 Melindungi Sel Neuronal dari Penghinaan Oksidatif

Akumulasi bukti menyoroti bahwa ApoE meningkatkan ketahanan saraf terhadap gangguan oksidatif, sehingga mencegah apoptosis dan degenerasi saraf [17,18,37]. Dalam konteks ini, kami mengevaluasi apakah sekresi ApoE yang diinduksi NGF oleh sel U373 dapat melindungi neuron N1E-115 dari stres oksidatif. N1E-115 yang terdiferensiasi sepenuhnya diberi perlakuan awal dengan rotenon, yang menginduksi stres oksidatif dengan menghambat kompleks mitokondria I.

Apoptosis adalah proses penghancuran diri, dan ini merupakan cara penting bagi sel untuk mempertahankan homeostasis tubuh melalui penghancuran diri terprogram dalam keadaan tertentu. Apoptosis memainkan peran berbeda dalam berbagai tahap kehidupan.

Penelitian terbaru menunjukkan bahwa ada hubungan tertentu antara apoptosis dan memori. Kita telah mengetahui bahwa memori adalah proses saraf kompleks di otak, yang melibatkan koneksi dan koordinasi antara berbagai wilayah otak. Apoptosis mungkin berperan dalam proses saraf ini.

Di satu sisi, apoptosis dapat menstabilkan struktur jaringan neuron dengan membersihkan neuron dan sinapsis yang tidak perlu, membuat koneksi neuron menjadi lebih halus, sehingga meningkatkan kualitas dan efisiensi memori. Di sisi lain, apoptosis yang berlebihan juga dapat menyebabkan penurunan jumlah sel otak, yang berdampak negatif pada penyimpanan dan penangkapan ingatan.

Oleh karena itu, sambil mempertahankan tingkat apoptosis yang tepat, kita dapat meningkatkan daya ingat melalui serangkaian perilaku dan keterampilan, seperti membaca, belajar, berolahraga, dan menyesuaikan pola pikir kita. Perilaku dan keterampilan ini dapat mendorong pertumbuhan dan koneksi sel-sel otak serta meningkatkan kualitas dan efisiensi memori dengan merangsang koneksi dan koordinasi antar neuron otak.

Kesimpulannya, hubungan antara apoptosis dan memori sangatlah kompleks. Hanya dengan mempertahankan apoptosis yang tepat kita dapat menstimulasi otak dan meningkatkan daya ingat melalui serangkaian perilaku dan keterampilan. Dari sudut pandang ini, kita perlu meningkatkan daya ingat kita. Cistanche deserticola secara signifikan dapat membantu kita meningkatkan daya ingat, karena Cistanche deserticola juga dapat mengatur keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan kadar asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Zat-zat ini penting untuk daya ingat. Ini sangat penting untuk belajar dan belajar. Selain itu, daging dari daging juga dapat meningkatkan fluiditas darah dan meningkatkan transportasi oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrisi dan energi yang cukup, sehingga meningkatkan vitalitas dan daya tahan otak.

Klik suplemen tahu untuk meningkatkan daya ingat

Setelah 16 jam paparan rotenone, neuron N1E-115 dikultur dalam media segar (Ctrl), media terkondisi dari sel U373 (U373-Ctrl), media terkondisi dari U373 yang diberi perlakuan awal dengan NGF selama 48 jam (U373-NGF), atau media terkondisi dari U373 berperedam ApoE yang diberi perlakuan awal dengan NGF selama 48 jam (U373-NGF ApoE siRNA). Perlakuan awal dengan rotenone sangat menurunkan jumlah N1E-115 yang dibiakkan dalam media kontrol, yang menunjukkan bahwa pemberian pestisida ini sangat berdampak pada kelangsungan hidup N1E-115.

Sitotoksisitas rotenon juga menentukan retraksi neurit yang intens, seperti yang diamati pada panjang neurit. Kerusakan neurit yang ditimbulkan oleh pengobatan rotenon terutama terlihat pada evaluasi sel yang mengandung neurit, karena jumlah N1E-115 dengan neurit menurun hingga 50%. Hasil serupa diperoleh ketika sel N1E-115 dikultur dalam medium terkondisi U373-Ctrl, menunjukkan bahwa keberadaan supernatan yang berasal dari astrosit yang tidak distimulasi tidak cukup untuk melindungi sel saraf dari toksisitas yang dimediasi rotenon. Sebaliknya, penerapan media terkondisi yang berasal dari U373 yang diobati dengan NGF secara efektif mencegah kematian neuron, serta pengurangan sel-sel yang mengandung neurit dan panjang neurit yang disebabkan oleh pemberian rotenone (Gambar 5).

Lebih penting lagi, media terkondisi yang berasal dari sel U373 yang dibungkam ApoE benar-benar kehilangan efek menguntungkan yang diinduksi oleh media terkondisi U373-NGF, yang menunjukkan bahwa perlindungan saraf didorong oleh pelepasan ApoE yang dimediasi NGF dalam media kultur. Khususnya, media terkondisi dari U373 yang diberi perlakuan NGF yang ditransfeksi dengan siRNA acak sepenuhnya mempertahankan efek perlindungan yang diberikan oleh media terkondisi U373-NGF, menunjukkan bahwa hilangnya perlindungan saraf yang diamati dalam media terkondisi dari sel-sel yang dibungkam ApoE secara efektif bergantung pada ApoE downregulasi (Gambar S3C).

Gambar 5. Pengaruh media terkondisi U373 terhadap stres oksidatif pada neuron. Gambar representatif dalam bidang terang dan penilaian kuantitatif morfologi saraf N1E-115. Sel sebelumnya diberi perlakuan (+) atau tidak (−) dengan rotenone (0.1 µM) selama 16 jam, dan kemudian dikultur dalam DMEM segar (Ctrl), dalam media terkondisi yang berasal dari kontrol U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373 yang diberi perlakuan NGF (U373-NGF), dan U373 yang diberi perlakuan NGF dibungkam untuk apoE (U373-NGF ApoE siRNA) selama 48 jam. n=5 eksperimen berbeda. Data mewakili rata-rata ± SD. Analisis statistik dinilai dengan menggunakan ANOVA satu arah, diikuti dengan uji post hoc Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Untuk memperkuat hasil yang diperoleh dari media terkondisi, kami melakukan kultur bersama U373/N1E115. Untuk memulai, sel-sel U373 diberi pra-perawatan atau tidak dengan NGF selama 48 jam. Selanjutnya, sel N1E-115 yang berdiferensiasi diberi perlakuan awal atau tidak dengan rotenone selama 16 jam. Selanjutnya, media U373 diganti dengan media segar yang mengandung 0,5% FBS, dan kaca penutup yang diunggulkan dengan N1E-115 dipindahkan ke lapisan U373 untuk menyiapkan kultur bersama (Gambar 6A).

Kerusakan oksidatif yang ditimbulkan oleh pengobatan rotenone sangat mempengaruhi sel pembawa vibilineurite dan panjang kendali neurit N1E-115 dan N1E-115 yang dikultur bersama dengan astrosit U373-Ctrl (Gambar 6B). Konsisten dengan eksperimen medium terkondisi, sel N1E-115 yang dikultur bersama dengan sel U373-NGF terlindungi dari kerusakan oksidatif, sedangkan peredaman ApoE pada U373 menghapuskan perlindungan saraf yang didukung oleh NGF.

Gambar 6. Sekresi ApoE oleh sel U373 yang diobati dengan NGF memberikan perlindungan saraf dari stres oksidatif. (A) Skema representatif kultur astrosit-neuron disusun sebagaimana dijelaskan dalam Bagian Bahan dan Metode. Sel yang mengandung neurit, panjang neurit, dan jumlah sel dinilai beberapa jam setelah dilakukan kultur bersama. (B) Gambar representatif dalam bidang terang dan penilaian kuantitatif morfologi neuron sel N1E-115, yang sebelumnya diberi perlakuan (+) atau tidak (−) dengan rotenone (0.1 µM) selama 16 jam.

N1E-115 kemudian disimpan dalam DMEM segar (Ctrl), atau dikultur bersama dengan kontrol U373 (U373-Ctrl), U373 yang telah diolah dengan NGF (U373-NGF), dan U373 yang telah diberi perlakuan NGF dibungkam untuk ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) selama 48 jam. n=5 percobaan yang berbeda. Data mewakili rata-rata ± SD. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan one way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji post hoc Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3. Diskusi

Ketidakseimbangan jalur sinyal neurotropin, serta perubahan metabolisme kolesterol otak, sangat terkait dengan penyakit neurologis dan neurodegeneratif, seperti sindrom Rett, HD, penyakit Alzheimer (AD), dan penyakit Parkinson (PD) [2,38,39] . Dalam konteks ini, penelitian mendasar tentang aktivitas biologis neurotropin sangat penting untuk membedah mekanisme molekuler yang menghubungkan metabolisme kolesterol dan fisiopatologi otak. Selama beberapa tahun terakhir, sebuah penelitian menarik melaporkan peran BDNF dalam regulasi metabolisme kolesterol pada astrosit [38].

Meskipun terdapat gagasan ini, tidak ada informasi tersedia mengenai dugaan keterlibatan NGF dalam regulasi kolesterol astrositik. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami fokus pada peran prospektif yang diberikan oleh NGF dalam regulasi metabolisme kolesterol, dengan referensi khusus pada pengaruh sekresi ApoE pada diferensiasi dan kelangsungan hidup saraf. U373, garis sel astrositoma yang digunakan sebagai model eksperimental astrosit manusia, mempertahankan potensi untuk merespons NGF sepenuhnya, karena ia mengekspresikan tingkat TrkA dan p75NTR yang cukup besar.

Hasil utama menunjukkan bahwa NGF meningkatkan regulasi kadar protein utama yang terlibat dalam biosintesis kolesterol (HMGCR), perdagangan intraseluler (NPC1), dan sekresi (ABCA1). Peristiwa ini disertai dengan peningkatan ApoE dan kolesterol lein secara bersamaan ke dalam media kultur, menunjukkan bahwa NGF meningkatkan biosintesis kolesterol dan ekstrusi dari sel glial. Telah dilaporkan bahwa NGF menginduksi ekspresi protein ApoE dengan meningkatkan transkripsinya [40]. Namun, kami tidak melihat adanya perubahan signifikan dalam ekspresi ApoE intraseluler. Ketidakkonsistenan yang nyata ini dapat dijelaskan karena penumpukan ApoE tidak dapat diapresiasi karena peningkatan efflux dari UIn yang diberi NGF.
Dalam upaya untuk membedah mekanisme molekuler dengan lebih baik, kami memperlakukan U373 dengan LM11A-31 dan menemukan bahwa modulator p75NTR hanya mampu meniru peningkatan ekspresi HMGCR yang dimediasi oleh NGF. Keterlibatan p75NTR dalam modulasi kadar HMGCR konsisten dengan data sebelumnya yang diperoleh pada tipe sel lain, menunjukkan bahwa reseptor ini mengontrol transkripsi enzim kolesterogenik [41]. Namun, LM11A-31 tidak menyebabkan perubahan apa pun pada protein lain yang dianalisis dalam penelitian ini, termasuk ABCA1, atau pada kadar kolesterol dan ApoE ke dalam media kultur, yang menunjukkan bahwa modulasi selektif p75NTR tidak cukup untuk meningkatkan kolesterol. ekstrusi melalui partikel kaya ApoE yang diamati dalam sel yang diobati dengan NGF. Hasil ini membawa kita pada hipotesis bahwa NGF mengatur metabolisme kolesterol dalam sel glial melalui keterlibatan reseptor p75NTR dan TrkA.

Telah diketahui bahwa pengikatan neurotropin pada reseptor Trk mengaktifkan ERK1/2, sehingga mengatur beberapa jalur yang terlibat dalam diferensiasi sel, proliferasi, dan kelangsungan hidup [2,38]. Menariknya, telah diamati bahwa aktivasi ERK1/2 juga mengatur ekspresi ABCA1 dan ApoE pada tipe sel yang berbeda [38,42,43]. Temuan ini, bersama dengan bukti bahwa sumbu BDNF/TrkB/ERK mendorong ekstrusi ApoE dan ekspresi ABCA1 dalam sel glial [38], menunjukkan bahwa jalur transduksi sinyal yang melibatkan sumbu TrkA/ERK dapat menjelaskan sebagian dari efek yang diberikan oleh NGF. dalam penelitian kami.

Meskipun tidak ada perubahan yang diamati pada pertumbuhan neurit, penggunaan media terkondisi U373- dan pembuatan eksperimen kultur bersama menunjukkan bahwa peningkatan sekresi ApoE dari sel glial yang dimediasi oleh NGF merupakan penentu untuk mencegah hasil merugikan yang disebabkan oleh oksidatif stres pada sel saraf. Untuk menginduksi sitotoksisitas, kami menggunakan rotenone, pestisida yang biasa digunakan dalam penelitian praklinis untuk menginduksi spesies oksigen reaktif (ROS) yang diturunkan dari mitokondria dan apoptosis berikutnya (44).

Hasil kami menyoroti bahwa NGF menstimulasi sekresi ApoE oleh sel glial, yang diperlukan untuk menjamin efek neuroprotektif terhadap pemberian rotenon pada sel N1E-115 yang berdiferensiasi. Peran ApoE dalam pencegahan stres oksidatif telah terdokumentasi dengan baik. Misalnya, penipisan ApoE pada model tikus memperburuk cedera oksidatif pada jaringan otak [45,46]. Oleh karena itu, pemberian ApoE eksogen melindungi terhadap kerusakan oksidatif ireversibel dari pengobatan hidrogen peroksida dengan melawan toksisitas glutamat sekunder [18]. Selain itu, lipoprotein yang mengandung ApoE efektif dalam melemahkan apoptosis yang disebabkan oleh penarikan dukungan trofik pada neuron ganglion retina [47].

Dalam penelitian kami, penggunaan rotenone menunjukkan bahwa perlindungan saraf yang dimediasi ApoE, yang dipromosikan oleh sel glial yang dirangsang oleh NGF, mungkin relevan dalam konteks kondisi neurodegeneratif seperti PD. Khususnya, rotenone mereproduksi degenerasi neuron dopaminergik serupa dengan yang diamati pada PD, baik pada model hewan dan kultur sel, termasuk neuron turunan N1E-115- [48-50]. Secara koheren, hasil kami mendukung bukti sebelumnya yang menunjukkan bahwa ApoE menimbulkan perlindungan saraf pada pemberian 6-hidroksidopamin (6-OHDA), neurotoksin lain yang mampu menginduksi fenotip mirip PD [51]. Secara kolektif, penelitian kami menunjukkan bahwa NGF adalah modulator penting metabolisme kolesterol dan ekstrusi ApoE dari sel glial. Yang paling penting, peningkatan sekresi ApoE yang didorong oleh neurotropin ini diperlukan untuk menjamin perlindungan saraf terhadap sitotoksisitas rotenone.

BDNF adalah neurotropin paling melimpah di otak orang dewasa. Terlepas dari bukti ini, NGF telah terbukti memainkan peran penting tidak hanya selama perkembangan tetapi juga pada sistem saraf pusat orang dewasa. Misalnya, NGF mempengaruhi aktivitas hipokampus dan, sebagai konsekuensinya, memori spasial dan pembelajaran [52]. Temuan lain menunjukkan bahwa NGF menunjukkan efek neuroprotektif pada neuron dopaminergik nigrostriatal dan aktivitas ini dapat menjadi dasar pendekatan terapi baru berbasis NGF untuk PD [53].

Menurut gagasan ini, telah ditunjukkan bahwa produksi NGF sangat diatur dalam astrosit selama masa dewasa dan memberikan tindakan modulasi pada peradangan saraf, cedera otak, dan degenerasi saraf [54-56]. Dalam konteks ini, akan menarik untuk mengevaluasi, dalam penelitian selanjutnya, apakah efek ini dapat dimediasi, setidaknya sebagian, oleh modulasi kolesterol glial yang dipromosikan oleh NGF. Penelitian ini menyajikan beberapa keterbatasan yang harus diatasi dalam penyelidikan eksperimental berikutnya; misalnya, penting untuk membedah dengan lebih baik mekanisme molekuler yang menghubungkan pengobatan NGF dan metabolisme kolesterol dalam sel glial.

Pemahaman yang luas berguna untuk mengidentifikasi target molekuler spesifik yang dapat menerima manipulasi farmakologis yang dapat digunakan dalam konteks neurodegeneratif. Selain itu, meskipun sel U373 dan N1E-115 banyak digunakan sebagai garis sel yang dapat dikelola untuk mereproduksi fitur astrositik dan neuron [27–29,57], temuan ini harus dikonfirmasi lebih lanjut dalam kultur sel primer. Meskipun upaya lebih lanjut harus dilakukan untuk memperkuat keterlibatan sinyal neurotropin dalam homeostasis kolesterol otak, penelitian ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa NGF secara tidak langsung dapat memberikan perlindungan saraf dengan mempengaruhi metabolisme kolesterol glial.

4. Bahan dan Metode

4.1. Budaya sel

Sel neuroblastoma N1E-115 dan sel U373 dikultur pada 5% CO2 dalam DMEM dengan glukosa tinggi (Merck Life Science, Milan, Italia), dengan 10% (v/v) serum janin sapi (FBS) (Merck Life Science , Milan, Italia), dan ditambah dengan larutan penisilin/streptomisin.

Untuk menginduksi diferensiasi neuron, sel N1E-115 diunggulkan pada pertemuan 30% dan dialihkan ke DMEM dengan FBS 0,5% selama 96 jam.

Untuk menginduksi diferensiasi neuron, sel N1E-115 diunggulkan pada pertemuan 30% dan dialihkan ke DMEM dengan FBS 0,5% selama 96 jam.

Kultur astrosit-neuron diatur sesuai dengan protokol yang dijelaskan oleh Ioannou dan rekannya, dengan modifikasi (59). Spacer parafin ditekan pada kaca penutup untuk memastikan kepatuhan; kami menggunakan spacer pada penutup saraf untuk secara efisien mencegah kerusakan mekanis ketika sel ditempatkan saling berhadapan. Kaca penutup kemudian disterilkan dalam etanol dan dilapisi dengan poli-D-lisin (Merck Life Science, Milan, Italia). N1E-115 diunggulkan pada kaca penutup yang dilapisi dengan kepadatan yang diinginkan dan, setelah siap untuk kultur bersama, tang steril digunakan untuk mengangkat kaca penutup dengan neuron N1E-115 dan menempatkannya menghadap ke bawah ke dalam { {10}}sumur yang diunggulkan dengan astrosit U373.

Pra-perawatan pada sel N1E-115 dilakukan dengan memberikan rotenone 0.1 µM (Sigma-Aldrich, Milan, Italia, R8875) selama 16 jam. Sel kontrol menerima DMSO (pengenceran 1:1000 dalam media kultur sel) sebagai wahana. Sel U373 diobati dengan NGF (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, N-245) dengan dosis 100 ng/mL selama 48 jam di semua percobaan.

4.2. Persiapan Lisat dan Analisis Western Blot

Sel-sel U373 disonikasi (siklus kerja 20%, keluaran 3) dalam buffer sampel (0,1Tris-HClisHCl yang mengandung 10% SDS, campuran protease inhibitor, pH 6,8) agar diperoleh total lisat, seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 60,61]. Buffer Laemmli ditambahkan, dan sampel didenaturasi pada suhu 95 ◦C selama 5 menit. Ekstrak protein (dua puluh mikrogram protein) diselesaikan pada SDS-PAGE, dan transfer ke membran nitroselulosa dilakukan dengan menggunakan sistem transfer turbo trans-blot (Biorad Laboratories, Milan, Italia), seperti yang dilaporkan sebelumnya [62].

Selanjutnya, membran diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dengan 5% susu kering tanpa lemak dalam larutan salin Tris (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.05% Tween{ {10}}, pH 6,8) dan diperiksa semalaman pada suhu 4 ◦C dengan antibodi primer berikut: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, pengenceran 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, pengenceran 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , pengenceran 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, pengenceran 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, pengenceran 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, pengenceran 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, pengenceran 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, pengenceran 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, pengenceran 1 :400), anti-vinculin (SigmaAldrich, Milan, Italy, V9264, pengenceran 1:10.000), dan anti- -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, pengenceran 1 :10.000).

Membran diinkubasi secara berturut-turut selama 1 jam pada suhu kamar dengan antibodi anti-tikus atau anti-kelinci sekunder terkonjugasi HRP (Laboratorium Bio-Rad, Milan, Italia). Antibodi yang terikat protein divisualisasikan dengan kejelasan ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, Milan, Italia, #1705061), dan chemiluminescence didaftarkan melalui sistem ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Milan, Italia). Analisis densitometri yang berasal dari Western blots kemudian dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ versi 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) untuk Windows. Vinculin atau -aktin digunakan sebagai protein rumah tangga, yang berfungsi sebagai kontrol internal untuk pemuatan protein. Perhitungan densitometri diperoleh sebagai satuan arbitrer, yang berasal dari rasio antara intensitas pita protein dan masing-masing protein rumah tangga.

4.3. Pewarnaan Minyak Merah O

Sel-sel U373 diunggulkan pada kaca penutup yang dilapisi poli-L-lisin (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) dalam pelat sumur 6-, dan pewarnaan O merah minyak dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [60]. Secara singkat, sel difiksasi dalam paraformaldehyde (larutan 4%) selama 10 menit dan dibilas perlahan tiga kali dengan PBS. Sel-sel tetap diinkubasi dengan 60% isopropanol selama 5 menit dan kemudian dicuci dengan air suling. Selanjutnya, sel diperiksa dengan 1 mL larutan kerja Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) selama 15 menit pada suhu kamar dengan meletakkan pelat sumur 6-ke dalam pengocok rotator orbital. Setelah inkubasi dengan larutan pewarna, sumuran dicuci tiga kali dengan air suling untuk menghilangkan sisa noda.

Kaca penutup akhirnya dipasang dengan media pemasangan Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182), dan autofluoresensi Oil red O divisualisasikan melalui mikroskop confocal (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Jerman). Gambar diambil menggunakan Leica TCS SP8 yang dilengkapi dengan pembesaran 63x dan Software Leica LAS X (Milan, Italia). Kuantifikasi pewarnaan Minyak merah O dilakukan melalui perangkat lunak ImageJ untuk Windows dan dihitung sebagai intensitas fluoresensi rata-rata per area sel.
4.4. Pewarnaan Filipina

Pewarnaan Filipina dilakukan menggunakan kompleks Filipina (Sigma-Aldrich, F9765). Larutan stok Filipina (10 mg/mL dalam PBS) selalu disiapkan segera sebelum digunakan. Sel difiksasi dalam paraformaldehyde (larutan 4%) selama 10 menit dan dicuci dengan PBS. U373 kemudian diwarnai dengan 1 mL larutan kerja Filipina (0,05 mg/mL dalam PBS) selama 1 jam dalam gelap, pada suhu kamar. Selanjutnya, sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS, dan kaca penutup dipasang dengan media pemasangan Fluoroshield dan segera dianalisis melalui mikroskop confocal menggunakan set filter UV (eksitasi 340-380 nm). Gambar diperoleh pada pembesaran 40X. Kuantifikasi Filipina dihitung sebagai intensitas fluoresensi rata-rata per luas sel dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ untuk Windows.

4.5. Kuantifikasi Kolesterol

Kuantifikasi kolesterol dilakukan dengan menggunakan uji kolorimetri (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milan, Italia) mengikuti instruksi pabrik.

4.6. ELISA
Tingkat ApoE dalam media kultur dinilai dengan menggunakan Human Apolipoprotein E ELISA Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), sesuai dengan instruksi pabrik.

4.7. Imunofluoresensi

Imunofluoresensi sel U373 dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (60). U373 difiksasi dalam paraformaldehyde (4% dalam PBS) dan diperiksa semalaman dengan antibodi primer: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, pengenceran 1:100), dan anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, pengenceran 1:100). Selanjutnya, sel diinkubasi selama 1 jam dengan antibodi sekunder anti-tikus kambing Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) dan dengan antibodi sekunder anti-kelinci kambing Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA , A27034). Pewarnaan DAPI dilakukan untuk memvisualisasikan inti, dan kaca penutup akhirnya dipasang dengan media pemasangan Fluoroshield. Sampel dianalisis melalui mikroskop confocal, seperti dijelaskan di atas.

4.8. Pembungkaman ApoE

Pembungkaman mRNA ApoE dilakukan pada sel U373 menggunakan siRNA ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) sesuai dengan instruksi pabrik. Transfeksi dilakukan di 6-piring kultur jaringan sumur di mana 100,000 sel per sumur diunggulkan dalam media pertumbuhan bebas antibiotik DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS selama 24 jam. Untuk setiap sumur, Media Transfeksi siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-36868) ​​ditambahkan ke larutan Reaksi Transfeksi siRNA, disiapkan menggunakan dupleks siRNA dan Reagen Transfeksi siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, AS, sc29528). Sel kemudian dicuci satu kali dengan Media Transfeksi siRNA dan ditutup dengan campuran transfeksi yang dibuat sebelumnya. Selanjutnya, pelat kultur diinkubasi selama 7 jam pada suhu 37 ◦C dalam inkubator CO2 5%.

Media pertumbuhan DMEM dengan 20% FBS dan antibiotik (2-kali lipat konsentrasi normal) ditambahkan ke dalam campuran transfeksi di setiap sumur dengan rasio 1:1. Sel diinkubasi selama 18 jam, dan kemudian media dibuang dan diganti dengan media pertumbuhan normal yang segar; 24 jam setelah langkah terakhir ini, sel siap digunakan untuk percobaan lebih lanjut. Efisiensi pembungkaman ApoE dinilai dengan RT-qPCR dalam sel U373 dan dengan ELISA dalam supernatan sel; SiRNA ApoE secara efisien mencegah induksi ApoE oleh NGF jika dibandingkan dengan siRNA pengacak (ApoE mRNA: penurunan 83%; ApoE ELISA: penurunan 78%). Khususnya, ekspresi ApoE pada pembungkaman siRNA lebih rendah daripada tingkat ekspresi basal yang diamati pada kontrol U373 (ApoE mRNA: penurunan 72%; ApoE ELISA: penurunan 58%) (Gambar S 3A, B).

4.9. Ekstraksi RNA dan PCR Waktu Nyata

Analisis mRNA dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [22,63]. Secara singkat, total RNA dari sel U373 diekstraksi dengan Reagen TRI (Merck Life Science, Milan, Italia) sesuai dengan instruksi pabrik. Perawatan DNAse (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milan, Italia) dilakukan, dan kemudian RNA dimurnikan menggunakan Kit pembersih RNA (Zymo, Italia). RNA secara berturut-turut ditranskripsi terbalik menjadi cDNA melalui Kit Sel Transkripsi Terbalik cDNA Berkapasitas Tinggi (Bio-System Terapan, Foster City, CA, USA) dan digunakan untuk analisis qPCR.

Primer yang digunakan dalam qRT-PCR untuk apoE adalah: meneruskan 5 0 -GGGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 dan membalikkan 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0 . Primer yang digunakan dalam qRT-PCR untuk gapdh (dipilih sebagai gen referensi) adalah: meneruskan 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 dan membalikkan 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Produksi amplikon yang benar dinilai dengan evaluasi kurva leleh. Setiap sampel biologis dijalankan rangkap tiga dengan reagen SYBR green IQ (Laboratorium Bio-Rad, Milan, Italia) dan menggunakan sistem deteksi CFX Connect (Laboratorium Bio-Rad, Milan, Italia).

4.10. Penilaian Kuantitatif Morfologi Neuronal

Morfologi neuron dalam sel N1E-115 diperkirakan dengan menangkap gambar dengan mikroskop terbalik. Analisis morfometrik dilakukan melalui perangkat lunak ImageJ untuk Windows, dan jumlah sel total (dinyatakan sebagai persentase variasi kontrol), panjang neurit rata-rata (dinyatakan sebagai persentase kontrol), dan sel yang mengandung neurit diperkirakan. Untuk sel yang mengandung neurit, persentasenya dihitung dengan membagi jumlah sel yang berdiferensiasi dengan jumlah total sel per bidang. N1E-115 adalah dewa yang dibedakan ketika mereka memiliki setidaknya satu neurit a dengan panjang sama dengan atau lebih besar dari diameter soma. Evaluasi morfologi dilakukan pada setidaknya lima percobaan independen, di mana setidaknya tiga gambar dianalisis.

4.11. Analisis statistik

Semua hasil yang disajikan dalam penelitian ini dinyatakan sebagai rata-rata ± SD (distribusi normal deviasi standar data diperiksa dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Ketika dua kelompok eksperimen dibandingkan, Tes tidak berpasangan diterapkan. Namun, ketika tiga atau lebih kelompok dibandingkan, digunakan analisis varians satu arah (ANOVA) yang diikuti dengan uji post hoc Tukey. Mengenai percobaan dengan rotenone, di mana terdapat dua variabel, digunakan ANOVA dua arah yang diikuti dengan post-test Bonferroni. p <0.05 dianggap berbeda secara statistik. Analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) untuk Windows.

Kontribusi Penulis:

Konseptualisasi, MS; metodologi, MS dan MC; validasi, MS dan MC; analisis formal, MS, MC, DP, dan MP; penyidikan, MC, NM, LL, MP, dan DP; sumber daya, MS dan VP; kurasi data, MS dan MC; penulisan—penyiapan draf asli, MS dan MC; menulis—review dan editing, MP, LL, DP, NM dan VP; visualisasi, MS, MC, dan MP; pengawasan, MS; administrasi proyek, MS; perolehan pendanaan, MS Semua penulis telah membaca dan menyetujui versi naskah yang diterbitkan.

Pendanaan:

Penelitian ini didanai oleh Funds for Departmental Research 2021 (University of Molise) kepada MS, dan oleh Jerome Lejeune Foundation call for Grants sesi 2021a, #2043 kepada MS

Pernyataan Dewan Peninjau Kelembagaan:

Tak dapat diterapkan.

Pernyataan Persetujuan yang Diinformasikan:

Tak dapat diterapkan.

Pernyataan Ketersediaan Data:

Tak dapat diterapkan.

Ucapan Terima Kasih:

Kami berterima kasih kepada Claudia Tonini atas bantuannya dalam pemeriksaan kolesterol

Konflik kepentingan:

Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Referensi

1. Björkhem, I.; Berarti, S.; Fogelman, AM Kolesterol Otak: Rahasia Panjang Kehidupan di Balik Penghalang. Arterioskler. bekuan darah. Vas. biologi. 2004, 24, 806–815. [Ref Silang] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Penasabene, D.; Situsni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotropin sebagai pengatur utama metabolisme sel: Implikasi terhadap homeostasis kolesterol. Int. J.Mol. Sains. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Berbagai mekanisme memediasi sinaptogenesis yang diinduksi kolesterol dalam neuron SSP. mol. Sel. ilmu saraf. 2005, 29, 190–201. [Ref Silang] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Ekspansi membran plasma: Tugas raksasa sebuah neuron. Nat. Pendeta Neurosci. 2009, 10, 251–261. [Referensi Silang]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brugger, B.; Ringler, P.; dkk. Anatomi Molekuler Organel Perdagangan Manusia. Sel 2006, 127, 831–846. [Ref Silang] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Faktor neurotropik yang diturunkan dari otak mengatur metabolisme kolesterol untuk pengembangan sinapsis. J. Ilmu Saraf. 2007, 27, 6417–6427. [Referensi Silang]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. Kegagalan Homeostasis Kolesterol di Otak: Implikasinya terhadap Disfungsi Sinaptik dan Penurunan Kognitif. Saat ini. medis. kimia. 2014, 21, 2788–2802. [Ref Silang] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM Regulasi laju sintesis kolesterol in vivo di hati dan bangkai tikus diukur menggunakan air [3H]. J.Res Lipid. 1980, 21, 364–376. [Referensi Silang]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Metabolisme kolesterol di neuron dan astrosit. Prog. Res Lipid. 2011, 50, 357–371. [Referensi Silang]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Menandai perbedaan sintesis kolesterol antara neuron dan sel glial dari tikus pascakelahiran. J. Neurokimia. 2009, 109, 125–134. [Referensi Silang]

11. Oram, JF; Heinecke, JW Pengangkut kaset pengikat ATP A1: Pengekspor kolesterol sel yang melindungi terhadap penyakit kardiovaskular. Fisiol. Pdt. 2005, 85, 1343–1372. [Referensi Silang]

12. Pfrieger, FW Outsourcing di otak: Apakah neuron bergantung pada pengiriman kolesterol oleh astrosit? BioEsai 2003, 25, 72–78. [Referensi Silang]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; Sial, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Trombospondin adalah protein yang disekresi astrosit yang mendorong sinaptogenesis SSP. Sel 2005, 120, 421–433. [Referensi Silang]

For more information:1950477648nn@gmail.com