Natalenamides A–C, Cyclic Tripeptides Dari Actinomadura Sp. RB99

Abstrak:

Dalam beberapa tahun terakhir, penyelidikan biokimia bakteri terkait serangga telah meningkat. Ketika dikombinasikan dengan proses dereplikasi analitik, studi ini memberikan strategi yang kuat untuk mengidentifikasi senyawa baru secara struktural dan / atau biologis. Peptida siklik yang disintesis secara non-ribosom memiliki spektrum bioaktivitas yang luas dengan potensi pengobatan yang tinggi.

Di sini, kami melaporkan penemuan tiga tripeptida siklik baru: natalenamida A–C (senyawa 1–3). Senyawa-senyawa ini diidentifikasi dari kaldu kultur Actinomadura sp. RB99 menggunakan metode dereplikasi berbasis kromatografi cair (LC)/ultraviolet (UV)/spektrometri massa (MS). Struktur kimia senyawa baru (1–3) ditetapkan dengan analisis metode spektroskopi komprehensif, termasuk magnet nuklir satu dimensi (1H dan 13C) dan dua dimensi (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) spektroskopi resonansi (NMR), bersama dengan data spektrometri massa ionisasi elektrospray resolusi tinggi (HR-ESIMS). Konfigurasi absolut dari senyawa baru dijelaskan menggunakan analisis Marfey. Melalui beberapa uji bioaktivitas untuk tripeptida, kami menemukan bahwa senyawa 3 menunjukkan efek penghambatan yang signifikan pada produksi melanin yang diinduksi 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX). Efek senyawa 3 mirip dengan asam kojic, senyawa yang banyak digunakan sebagai bahan kosmetik dengan efek memutihkan kulit.

Kulit cerah, mulus, dan halus selalu menjadi tujuan yang dikejar oleh wanita oriental. Penelitian dan pengembangan bahan pemutih untuk produk perawatan kulit terutama didasarkan pada penghambatan aktivitas tirosinase.

Senyawa yang mengandung cincin benzena atau struktur hidroksil fenolik memiliki efek pemutihan potensial, seperti zat pemutih arbutin yang umum digunakan saat ini, yang dapat memberikan efek pemutihan dengan menghambat aktivitas tirosinase.

Dan kami menemukan bahwa Cistanche deserticola memiliki efek memutihkan. Bahan aktif utama Cistanche deserticola, glikosida feniletanoid, adalah sejenis senyawa glikosida alami. Studi telah menemukan bahwa glikosida feniletanoid dapat menghambat aktivitas tirosinase dan produksi melanin pada melanosit epidermal manusia, dan memiliki efek memutihkan. kemanjuran agen.

Klik bubuk ekstrak cistanche tubulosa

Kata kunci:

rayap yang tumbuh jamur; Actinomadura sp.; tripeptida; natalenamida A–C; efek pemutihan kulit.

1. Perkenalan

Analisis kimia simbion bakteri pelindung serangga pertanian telah menarik banyak perhatian di kalangan ahli kimia bahan alam dalam beberapa tahun terakhir [1-5]. Dengan menggunakan proses dereplikasi berbasis resonansi magnetik nuklir (NMR)/spektrometri massa (MS) yang canggih dan bioassay yang relevan secara ekologis, sejumlah besar produk alami yang menarik secara struktural, termasuk beberapa peptida siklik yang disintesis secara non-ribosom, telah ditemukan. dari simbion mikroba [6]. Contoh yang paling menonjol termasuk antijamur dentigerumycin, depsipeptida siklik yang diisolasi dari Pseudonocardia sp. [7], dan gerumycins A–C, depsipeptida siklik yang mengandung asam piperazat yang diidentifikasi dari Pseudonocardia sp. [8].

Peptida siklik telah terbukti menunjukkan berbagai aktivitas biologis, mendorong beberapa pendekatan sintetik terhadap struktur yang menjanjikan secara farmakologi ini [9-12]. Lebih dari 40 obat peptida siklik saat ini dipasarkan dan digunakan secara luas di lingkungan klinis, dan kira-kira satu obat peptida siklik baru memasuki pasar setiap tahun, rata-rata [13].

Sebagai bagian dari upaya berkelanjutan kami untuk mengidentifikasi struktur baru dan/atau metabolit sekunder bioaktif dari mikroba terkait rayap [14-17], kami fokus pada Actinomadura sp. RB99, diisolasi dari rayap yang tumbuh jamur, Macrotermes natalensis. Strategi dereplikasi berbasis kromatografi cair (LC)/ultraviolet (UV)/massa spektrometri (MS) kami menghasilkan produk alami bioaktif baru yang berpotensi. Dalam penelitian ini, kami melaporkan isolasi dan identifikasi kimia dari tiga tripeptida siklik baru, natalenamide A–C (senyawa 1–3, Gambar 1), menggunakan metode dereplikasi berbasis LC / UV / MS serta evaluasi biologisnya untuk sitotoksik. , aktivitas anti-inflamasi, dan pemutihan kulit.

2. Hasil dan Pembahasan

2.1. Kromatografi cair (LC)/Ultraviolet (UV)/Spektrometri Massa (MS)-Isolasi Senyawa Berbasis 1–3

Actinomadura sp. RB99 diisolasi dari permukaan rayap pekerja (M. natalensis). Analisis filogenetik dari urutan asam ribonukleat (rRNA) ribosomal 16S yang hampir lengkap menunjukkan bahwa strain RB99 termasuk dalam genus Actinomadura, dengan tetangga terdekat Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Analisis berbasis LC/UV/MS selanjutnya dari ekstrak kultur yang diperkaya mengungkapkan serangkaian karakteristik penyerapan UV dengan puncak ion molekuler unik yang mengandung atom nitrogen.

Untuk mengidentifikasi masing-masing metabolit dan menyelidiki aktivitasnya, fermentasi skala besar menggunakan kondisi pertumbuhan yang dioptimalkan (piring agar 100 dari agar 2 L ISP2, pH 6, 10 hari pada suhu 30 ◦C) dan prosedur pengerjaan dan pra-pemurnian yang telah ditetapkan. diterapkan [17]. Fraksinasi yang dipandu LC-UV/MS selanjutnya dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) semi-preparatif berulang menghasilkan isolasi tiga metabolit dengan pola NMR/MS yang unik. Kami melakukan studi pertumbuhan dan media menggunakan garam yang berbeda (NaCl, KBr 1–3 persen ) dan komposisi media (media ISP1-6) untuk meniru lingkungan alami dan merangsang produksi metabolit, yang juga menyebabkan adanya tiga jenis baru metabolit (lihat Gambar Tambahan S19).

2.2. Penjelasan Struktural Senyawa

Natalenamide A (1) diperoleh sebagai bubuk amorf. Rumus molekul 1 ditentukan menjadi C19H25N3O5 dari ion molekul yang teradduksi natrium pada m/z 398.1691 [M plus Na] plus (dihitung untuk C19H25N3O5Na, 398.1692) menggunakan mode ion positif spektrometri massa ionisasi elektrospray beresolusi tinggi (HR- data ESIMS). Spektrum inframerah (IR) menunjukkan pita serapan yang kuat pada 1670 cm−1, menunjukkan adanya gugus amida dalam molekul. Analisis terperinci dari data 1H NMR dari 1 (Tabel 1) menunjukkan sinyal tipikal kerangka peptida, menampilkan dua sinyal metil (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) dan 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), tiga sinyal metilena (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a), dan 3.20 (1H, dd, J=14.0, 5.0 Hz, H-12b)), empat sinyal metin (δH 2.02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8.5, 4,5 Hz, H-6), dan 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)), dan lima proton aromatik yang tumpang tindih (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18), dan 7,24 (2H, m, H-15/17)).

Spektrum 13C NMR (Tabel 1), dengan bantuan dari spektra HSQC dan HMBC, menunjukkan total 19 resonansi karbon yang bertanggung jawab atas dua sinyal metil (δC 18.9 dan 19.9), tiga sinyal metilen (δC 27.0, 30.6, dan 38.8), sembilan sinyal metin (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2), dan 130.6 (×2)), termasuk lima karbon aromatik, satu karbon olefin sinyal (δC 138.8), dan empat sinyal karbon karbonil (δC 173.2, 173.3, 174.8, dan 181.3). Dikombinasikan dengan data spektroskopi di atas, pemeriksaan mendetail NMR dua dimensi (2D) (percobaan 1H-1H COSY, HSQC, dan HMBC) mengungkapkan adanya tiga asam amino dalam 1: glutamat (Glu), fenilalanin ( Phe), dan valin (Val) (Gambar 2). Konektivitas asam amino ini ditentukan oleh korelasi HMBC dari H-1/C-5 dan C-19, H-11/C-10 dan C{ {50}}, dan H-6/C-5 dan C-10 (Gambar 2).

Untuk mengidentifikasi konfigurasi mutlak 1, metode Marfey diterapkan untuk menentukan stereokimia kelipatan -H (C-1, C-6, dan C-11). Hidrolisat asam dari 1 dan asam amino standar (L/D-Glu, Phe, dan Val) diturunkan dengan 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanin amida (L-FDAA). Secara berturut-turut, campuran turunan dari 1 dan asam amino standar dianalisis dengan LC/MS untuk memeriksa waktu retensinya. Konfigurasi absolut gugus Glu, Phe, dan Val semuanya ditentukan sebagai bentuk-L, berdasarkan waktu retensi turunan L-FDAA dari 1 dibandingkan dengan asam amino standar. Dengan demikian, struktur 1 dijelaskan sebagai tripeptida siklik yang ditunjukkan pada Gambar 1.

Natalenamide B (2) diisolasi sebagai bubuk amorf. Rumus molekulnya (C20H27N3O5) diturunkan dari puncak ion molekul hidrogen dan natrium pada 390.2032 [M plus H] plus (dihitung untuk C20H28N3O5, 390.2029) dan 412.1849 [M plus Na] plus (dihitung untuk C20H27N3O5Na, 412.1848). Dibandingkan dengan rumus molekul dan data spektral NMR dari 1, senyawa 2 tampaknya memiliki gugus CH2 tambahan dalam kerangka peptida. Pengamatan menyeluruh terhadap spektrum satu dimensi (1D) (1H dan 13C NMR) dan 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC, dan HMBC) dari 2 mengungkap adanya tiga residu asam amino: Glu, Phe, dan Leu (leusin). Urutan asam amino ini dibangun berdasarkan korelasi HMBC dari H-1/C-6 dan C-20, H-12/C-11 dan C -20, dan H-7/C-6 dan C-11 (Gambar 2). Untuk menentukan konfigurasi mutlak 2, dilakukan derivatisasi residu Glu, Phe, dan Leu dengan L-FDAA dan kemudian dianalisis dengan LC/MS. Pada data LC/MS, L-Glu, L-Phe, dan L-Leu dideteksi dengan membandingkan waktu retensi untuk turunan L-FDAA dari 2 dengan asam amino standar. Dengan demikian, struktur kimia 2 ditetapkan sebagai tripeptida siklik yang ditunjukkan pada Gambar 1.

Data HR-ESIMS mode positif dari natalenamide C (3) menampilkan ion molekul hidrogen dan natrium yang teradduksi pada 424.1870 [M plus H] plus (dihitung untuk C23H26N3O5, 424.1872) dan 446.1694 [M plus Na] plus (dihitung untuk C23H25N3O5Na, 424.1692). Ini menunjukkan bahwa rumus molekulnya adalah C23H25N3O5. Analisis terperinci dari spektra 1D dan 2D NMR dari 3 menunjukkan bahwa struktur kimianya mirip dengan 2, kecuali Leu diganti dengan Phe dalam 3. Konektivitas dari tiga asam amino yang diidentifikasi dalam 3 diverifikasi menggunakan korelasi HMBC dari H-1/C-9 dan C-23, H-15/C-14 dan C-23, dan H-10/ C-9 dan C-14 (Gambar 2). Dengan menerapkan metode Marfey ke senyawa 3, konfigurasi absolut dari kelipatan -H (C-1, C-10, dan C-15) dijelaskan menjadi satu L-Glu dan dua L Bagian -Phe. Dengan demikian, struktur lengkap dari 3 ditentukan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.

Natalenamida A–C adalah peptida trisiklik, diduga berasal dari non-ribosom. Saat ini, beberapa tripeptida siklik bioaktif telah dicirikan sebagai produk alami: sitotoksik 17-tripeptida siklik beranggota (misalnya, OF4949 I–IV) yang diisolasi dari Penicillium rugulose [18]; sklerotomi antijamur A−K, diidentifikasi dari kaldu fermentasi bakteri halotoleran [10]; dan antiproliferatif psychrophilic E, diisolasi dari kultur campuran dari dua galur jamur turunan alga marinir dari genus Aspergillus [19].

2.3. Aktivitas Biologis Senyawa 1-3

Karena peptida siklik telah dilaporkan menunjukkan berbagai aktivitas biologis, efek biologis dari tripeptida siklik terisolasi ({{0}}) dievaluasi menggunakan tiga bioaktivitas. Sitotoksisitas senyawa 1-3 diselidiki terhadap empat jalur sel kanker (sel kanker payudara MCE7, sel kanker serviks HeLa, sel kanker paru-paru manusia A549, dan sel kanker hati HepG2) pada konsentrasi yang berbeda (0, 6.25 , 12,5, 25, 50, dan 100 uM). Senyawa 1 tidak memengaruhi kelangsungan hidup sel MCF-7, HeLa, atau sel A549. Namun, pengobatan sel HepG2 dengan 100 M senyawa 1 menurunkan viabilitas sel menjadi 78,5 ditambah 3,2 persen (Gambar 3). Senyawa 2 mengurangi viabilitas sel HeLa dan sel A549 menjadi 82.9  2.1 persen dan 73.5=3.0 persen , masing-masing, tetapi tidak memengaruhi viabilitas MCF-7 atau Sel HepG2 (Gambar 3). Senyawa 3 tidak mempengaruhi kelangsungan hidup salah satu garis sel (Gambar 3).

Selanjutnya, makrofag RAW264.7 digunakan untuk menyelidiki efek anti-inflamasi dari senyawa yang diisolasi. Untuk menghilangkan kesalahan dalam produksi NO yang disebabkan oleh perubahan tingkat kelangsungan hidup sel, konsentrasi non-toksik dari setiap senyawa diperiksa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, senyawa 1–3 memiliki sedikit efek sitotoksik dalam sel RAW264.7 (Gambar 4A–C) dan tidak memberikan efek penghambatan pada produksi NO dalam sel RAW264.7 yang distimulasi lipopolisakarida (LPS) (Gambar 4D–F) .

Efek penghambatan senyawa 1-3 pada kandungan melanin dalam sel B16F10 diperiksa sebagai bukti aktivitas pemutihan kulitnya (Gambar 5). Karena perubahan viabilitas sel menyebabkan kesalahan dalam produksi dan pengukuran melanin, pertama-tama kami meneliti efek senyawa 1–3 pada kelangsungan hidup sel B16F10. Senyawa 1–3 tidak memberikan efek sitotoksik pada sel B16F10 pada konsentrasi mana pun yang digunakan (Gambar 5A–C). Kami kemudian menilai efek penghambatan senyawa pada produksi melanin yang diinduksi 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) dalam sel B16F10 (Gambar 5D–F). IBMX, stimulator melanogenesis yang terkenal, menginduksi peningkatan produksi melanin yang signifikan setelah pengobatan tunggal pada sel melanoma. Di antara senyawa yang dievaluasi, senyawa 3 (pada 5–100 µM) menunjukkan efek penghambatan yang signifikan pada sintesis melanin yang dimediasi IBMX dengan cara yang bergantung pada dosis. Asam kojic, kontrol positif kami, telah banyak digunakan sebagai bahan kosmetik dengan efek memutihkan kulit [20]. Efek penghambatan senyawa 3 pada produksi melanin yang diinduksi IBMX mirip dengan asam kojic (Gambar 5F), menunjukkan bahwa senyawa 3 berfungsi sebagai penghambat kuat produksi melanin yang diinduksi IBMX dalam sel melanoma B16F10.

Selanjutnya, senyawa 3 terkontaminasi dengan sejumlah kecil pengotor, yang ditentukan sebagai analog asam lemak dengan interpretasi data spektroskopi NMR dan analisis LC/MS (Bahan Pelengkap, Gambar S11-S15 dan S23). Untuk mengidentifikasi aktivitas pengotor, percobaan tambahan dengan analog asam lemak dilakukan untuk efek penghambatannya pada produksi melanin yang diinduksi IBMX dalam sel B16F10, yang mengungkapkan bahwa senyawa yang diuji tidak memiliki efek pemutihan (Bahan Pelengkap, Gambar S24). Jadi, meskipun kami tidak dapat mengecualikan bahwa ketidakmurnian dalam senyawa 3 bertanggung jawab atas efek penghambatan pada produksi melanin yang diinduksi IBMX, ini tampaknya tidak mungkin.

3. Bahan dan Metode

3.1. Prosedur Eksperimental Umum

Spektra inframerah diperoleh pada spektrometer Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA). Spektra ionisasi elektrospray dan HR-ESIMS diukur pada spektrometer massa SI-2/LCQ DecaXP liquid chromatography (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Spektrum NMR, termasuk eksperimen 1H–1H COSY, HSQC, dan HMBC, dilakukan menggunakan spektrometer Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, USA) yang beroperasi pada 800 MHz (1H) dan 200 MHz (13C), dengan pergeseran kimia diberikan dalam ppm (δ). HPLC preparatif menggunakan pompa Waters 1525 Binary HPLC dengan Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Silica gel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) dan silika gel RP-C18 (230–400 mesh, Merck, digunakan untuk kromatografi kolom. HPLC semi-preparatif menggunakan Shimadzu Prominence HPLC System dengan SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultraviolet–visible (UV–Vis) Detectors (Shimadzu, Tokyo, Jepang). Analisis LC/MS dilakukan pada sistem HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) yang dilengkapi dengan detektor susunan dioda dan spektrometer massa ESI Seri 6130 dengan Kinetex analitik (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Pelat F254 gel silika berlapis Merck dan pelat RP-18 F254s digunakan untuk kromatografi lapis (KLT) Bintik-bintik terdeteksi pada KLT di bawah sinar UV atau dengan pemanasan setelah disemprot dengan larutan anisaldehida-asam sulfat.

3.2. Bahan Mikroba

Actinomadura sp. RB99 diisolasi dari permukaan rayap pekerja dari genus, M. natalensis, (koloni Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) pada 2 Januari{ {13}}10. Biomaterial dimasukkan ke dalam kantong plastik bersih dan diproses dalam satu hari setelah pengumpulan. Rayap dicuci dalam air deionisasi steril, dan bakteri diisolasi dengan melapisi suspensi yang dihasilkan pada media rendah nutrisi dengan kitin (per liter: 4 g kitin, 0.7 g K2HPO4, 0.3 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.001 g ZnSO4, 0.001 g MnCl2, dan 20 g agar) [21]. Isolat dengan morfologi mirip Actinobacteria dipindahkan ke agar ISP2 (per liter: 10 g ekstrak malt, 4 g ekstrak ragi, 4 g glukosa, dan 20 g agar), dan disubkultur hingga diperoleh isolat murni.

3.3. Ekstraksi DNA dan Amplifikasi Polymerase Chain Reaction

Actinomadura sp. RB99 ditumbuhkan dalam media cair kaya nutrisi ISP2 selama lima sampai tujuh hari pada suhu 30 ◦C. Sel dipanen, dan DNA genom diekstraksi menggunakan kit pemurnian DNA genom GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) mengikuti instruksi pabrik dengan perubahan berikut: (a) perawatan lisozim diperpanjang hingga 40 menit, dan (b) pengobatan proteinase K diperpanjang hingga 40 menit. DNA dikuantifikasi secara fotometrik menggunakan spektrometer Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Untuk studi filogenetik, gen 16S rRNA diamplifikasi menggunakan set primer, 1492R/27F. Setiap reaksi amplifikasi disiapkan dalam volume reaksi akhir 25 µL yang mengandung 7,25 µL air suling, 5 µL buffer HF, 5 µL setiap primer (2,5 µM), {{10}}.5 µL dNTP (10 µM), 0,25 µL Phusion High-Fidelity DNA polimerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), dan 2 µL DNA yang diekstraksi (templat). Polymerase chain reaction (PCR) dilakukan pada kondisi berikut: 98 ◦C selama 38 detik; 32 siklus 98 ◦ selama 30 detik, 52 ◦C selama 45 detik, 72 ◦C selama 1 menit 20 detik; dan perpanjangan akhir 72 ◦C selama 8 menit. Produk PCR divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa, dan reaksi PCR dimurnikan menggunakan kit pemurnian PCR (Thermo Scientific). Fragmen DNA diurutkan di GATC (Konstanz, Jerman).

3.4. Sekuensing dan Identifikasi Spesies

Urutan dinilai untuk kemurnian dan ketidakcocokan menggunakan BioEdit [22]. Urutan maju dan mundur yang diperoleh untuk setiap regangan dirakit dengan BioEdit dan diuji untuk chimera menggunakan DECIPHER (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Urutan yang dihasilkan disimpan di GenBank (nomor aksesi: KY558684). Analisis ledakan dengan urutan 16S rRNA yang hampir lengkap (1368 bp) dilakukan dengan menggunakan database National Center for Biotechnology Information (NCBI) (referensi urutan RNA). Hasil menunjukkan bahwa strain RB99 adalah anggota dari genus Actinomadura. Urutan 10 hit pertama diunduh dari database NCBI dan diselaraskan dengan urutan 16S rRNA dari Actinomadura sp. RB99 menggunakan layanan penyelarasan urutan Sina [23]. Dua pohon filogenetik yang berbeda direkonstruksi dengan algoritma neighbor-joining atau maximum-likelihood menggunakan perangkat lunak MEGA versi 7.0.26 [24-26]. Model jarak evolusioner Tamura dan Nei digunakan untuk menghasilkan matriks jarak evolusioner untuk kemungkinan maksimum dan algoritma yang bergabung dengan tetangga, dengan penghapusan celah lengkap dan data yang hilang [27]. Untuk algoritme kemungkinan maksimum, distribusi gamma diskrit digunakan (ditambah G), dan model variasi laju memungkinkan beberapa situs menjadi tidak berubah secara evolusioner (ditambah I). Untuk algoritma penggabungan tetangga, variasi laju antar situs dimodelkan dengan distribusi gamma (ditambah G). Nilai kepercayaan node dievaluasi dengan analisis bootstrap berdasarkan 1000 langkah resampling [28].

3.5. Ekstraksi dan Isolasi

Actinomadura sp. RB99 ditumbuhkan dalam 50 mL kaldu ISP2 selama tujuh hari pada suhu 30 ◦C (pra-kultur) dan digunakan untuk menginokulasi 100 cawan agar ISP2. Pelat diinkubasi selama 10 hari pada suhu 30 ◦C, dipotong kecil-kecil, dikonsolidasikan, dan direndam semalaman dalam MeOH. Fase MeOH disaring dan diuapkan di bawah tekanan yang dikurangi. Ekstrak MeOH (20 g) dilarutkan dalam air suling (700 mL) dan kemudian dipartisi pelarut dengan EtOAc (700 mL) tiga kali, menghasilkan 1,1 g residu. Fraksi yang larut dalam EtOAc (1,1 g) dari ekstrak MeOH dimasukkan ke dalam kolom silika gel (230–400 mesh) untuk kromatografi dan dielusi dengan sistem pelarut gradien CH2Cl2-MeOH (100:1 hingga 1: 1, v/v). Ini memberikan enam fraksi (A – F), yang menjadi sasaran analisis berbasis LC-UV / MS. Analisis dereplikasi menggunakan perpustakaan spektral UV in-house menyarankan keberadaan analog peptida minor dalam fraksi E. Ini menampilkan pola UV sederhana di sekitar 220 nm dan puncak ion rumus molekul unik yang mengandung atom nitrogen. Fraksi polar E (233 mg) difraksinasi oleh HPLC fase terbalik preparatif (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA) menggunakan CH3CN/H2O (1:9 hingga 9:1, v /v, sistem gradien, laju alir: 5 mL/menit) untuk menghasilkan lima sub-fraksi (E1–E5). Sub-fraksi E2 (27 mg) dimurnikan dengan HPLC fase terbalik semi-preparatif (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) dengan 33 persen MeOH/H2O (sistem isokratik, laju alir: 2 mL/menit ) untuk menghasilkan senyawa 1 (5,8 mg, tR=57.0 menit). Senyawa 2 (1,6 mg, tR=42.0 menit) dan 3 (1,5 mg, tR=55.0 menit) diisolasi dari sub-fraksi E3 (15 mg) dengan fase terbalik semi-preparatif HPLC mengelusi 43 persen MeOH/H2O (sistem isokratik, laju alir: 2 mL/menit).

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Hidrolisis Asam Senyawa 1–3

Sejumlah total 0.4 mg dari setiap senyawa (1–3) dihidrolisis dengan 6 N HCl (500 µL) selama 1 jam pada 110 ◦C. Setelah didinginkan hingga suhu kamar, hidrolisat 1-3 diuapkan untuk menghilangkan jejak HCl. Air suling (500 µL) ditambahkan ke campuran hidrolisat dan kemudian diuapkan untuk menghilangkan jejak HCl; proses ini dilakukan sebanyak tiga kali.

3.7. Penentuan Konfigurasi Mutlak Asam Amino pada 1–3

Campuran hidrolisat (1–3), serta asam amino standar (L/D-Leu, Glu, Phe, dan Val), dilarutkan dalam 1 N NaHCO3 (100 µL) dan kemudian diolah dengan 50 µL L-FDAA (10 mg/mL dalam aseton). Berturut-turut, masing-masing hidrolisat dipanaskan selama 10 menit pada suhu 80 ◦C. Setiap campuran didinginkan dengan 2 N HCl (50 µL) dan dipekatkan dalam vakum. Residu dilarutkan dalam 300 µL MeOH. Setiap alikuot (5 µL) yang diperoleh dari campuran hidrolisat disuntikkan langsung ke LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, laju alir 0,3 mL/menit), dan pemindaian penuh dalam positif dan negatif mode ion (rentang pemindaian dari m/z 100 hingga 1000) diterapkan untuk mengidentifikasi waktu retensi asam amino turunan L-FDAA.

Fase gerak, terdiri dari asam format dalam air suling ({{0}}.1 persen v/v) (A) dan asetonitril (B), dibawa dengan sistem pelarut gradien sebagai berikut: 20–40 persen (B) selama 10 menit, 100 persen (B) isokratik selama 5 menit, dan kemudian 20 persen (B) isokratik selama 5 menit, untuk melakukan prosedur pencucian pasca operasi untuk kolom. Waktu retensi asam amino turunan L-FDAA yang digunakan sebagai standar adalah 16,7 menit (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 18,2 menit (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 22,1 menit (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,1 menit (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,6 menit (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus ), 27,0 menit (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus ), 25,5 menit (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ), dan 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M ditambah H] ditambah ). Waktu retensi dari hidrolisat turunan dari 1–3 adalah L-Glu (16,9 menit), L-Phe (25,7 menit), dan L-Val (22,5 menit) dari 1; L-Glu (16,7 menit), L-Phe (25,7 menit), dan L-Leu (25,6 menit) dari 2; dan L-Glu (16,9 mnt) dan L-Phe (25,7 mnt) dari 3.

3.8. Tes Sitotoksik Menggunakan Sel Kanker

Sel MCF7, HeLa, dan A549 dibeli dari American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Sel HepG2 dibeli dari Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Sel MCF7 dikultur dalam media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi. Sel HeLa dan A549 dikultur dalam medium esensial minimal Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi. Sel HepG2 dikultur dalam Minimum Essential Medium yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi. Kondisi kultur dipertahankan pada suhu 37 ◦C dalam atmosfer lembab yang mengandung 5 persen CO2. Sitotoksisitas diuji pada empat jalur sel manusia ini (MCF7, HeLa, A549, dan HepG2) menggunakan alat uji viabilitas sel EZ-CyTox (Laboratorium Dojindo, Kumamoto, Jepang). Secara singkat, 5 × 103 sel/sumur diunggulkan dalam pelat sumur 96-. Setelah 24 jam, sel diperlakukan dengan senyawa pada konsentrasi yang ditunjukkan. Setelah 72 jam inkubasi, kit uji viabilitas sel EZ-CyTox digunakan. Setelah 2 jam inkubasi, absorbansi diukur pada 450 nm dengan acuan pada 620 nm. Viabilitas sel dihitung sebagai persentase dari kontrol.

3.9. Aktivitas Anti-Inflamasi

Garis sel makrofag tikus RAW264.7 dibeli dari American Type Culture Collection. Sel dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi (FBS), 100 unit/mL penisilin, dan 100 µg/mL streptomisin, dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam suasana lembab dengan 5 persen CO2. Viabilitas sel diukur menggunakan kit deteksi viabilitas sel Ez-Cytox. Sel diinkubasi dalam pelat sumur 96-pada konsentrasi 2500 sel per sumur selama 24 jam dan diperlakukan dengan konsentrasi senyawa yang ditunjukkan 1–3 selama 24 jam. Selanjutnya, reagen Ez-Cytox ditambahkan ke masing-masing sumur. Kepadatan optik pada 450 nm diukur setelah 1 jam menggunakan pembaca pelat mikro (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) untuk memperkirakan viabilitas sel. Dalam eksperimen terpisah, sel RAW264.7 diinkubasi dalam 96-pelat sumur dengan konsentrasi 30,000 sel per sumur selama 24 jam. Setelah kelaparan serum selama 12 jam, sel diberi perlakuan awal dengan senyawa 1–3 selama 1 jam dan kemudian distimulasi dengan 1 µg/mL LPS selama 24 jam. Absorbansi media kultur dalam reaksi Griess diukur pada 540 nm menggunakan pembaca pelat mikro PowerWave XS untuk memperkirakan level NO.

3.10. Pengukuran Konten Melanin

Garis sel melanoma tikus, B16F10, dibeli dari American Type Culture Collection. Sel dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan FBS 10 persen, penisilin 100 unit/mL, dan streptomisin 100 µg/mL, dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5 persen CO2. Sel B16F10 diinkubasi dalam cawan kultur 6 cm pada 250,000 sel per sumur dalam DMEM yang dilengkapi dengan FBS 10 persen, streptomisin 100 µg/mL, dan penisilin 100 U/mL selama 24 jam. Sel-sel dicuci dua kali dengan phosphate-buffered saline (PBS) dan kemudian distimulasi oleh IBMX dan diinkubasi dengan konsentrasi senyawa 1–3 atau asam kojic (kontrol positif) yang berbeda dalam media RPMI bebas fenol merah yang dilengkapi dengan 10 persen FBS, 100 unit /mL penisilin, dan 100 µg/mL streptomisin selama 24 jam dan 48 jam. Absorbansi media kultur diukur pada 405 nm menggunakan pembaca pelat mikro PowerWave XS untuk memperkirakan kandungan melanin. Hasil dinyatakan sebagai perubahan lipat dibandingkan dengan kontrol (sel tidak distimulasi oleh IBMX).

3.11. Analisis statistik

Semua data termasuk viabilitas sel, NO, dan produksi melanin disajikan sebagai nilai rata-rata dan standar deviasi (SD). Semua tes dilakukan dalam rangkap tiga dan diulang setidaknya tiga kali. Dalam penelitian ini, hanya beberapa pengulangan dari setiap percobaan sel yang dimasukkan, sehingga metode analisis non-parametrik diadopsi untuk analisis statistik. Uji Kruskall-Wallis digunakan untuk analisis statistik setiap variabel. Paket statistik SPSS digunakan untuk semua analisis (statistik International Business Machines Corporation (IBM) SPSS versi 21, Boston, MA, USA). Signifikansi statistik dianggap pada nilai p lebih rendah dari 0.05.

4. Kesimpulan

Laporan kami memberikan analisis kimia isolat mikroba dari rayap yang tumbuh jamur. Tiga tripeptida siklik baru, natalenamida A – C (1–3), diisolasi dan dikarakterisasi secara struktural dari kaldu kultur dari Actinomadura sp. RB99 menggunakan metode dereplikasi berbasis LC-UV/MS. Semua senyawa yang diisolasi dievaluasi untuk aktivitas biologis menggunakan tes berbasis sel. Senyawa 1 dan 2 masing-masing menunjukkan sitotoksisitas lemah terhadap sel HepG2 dan HeLa/A549. Tak satu pun dari senyawa yang diisolasi menunjukkan efek penghambatan yang signifikan pada produksi NO dalam sel RAW264.7 yang dirangsang oleh LPS. Senyawa 3 menunjukkan efek penghambatan yang signifikan pada sintesis melanin yang dimediasi IBMX dengan cara yang bergantung pada dosis. Efeknya mirip dengan kojic acid yang digunakan sebagai bahan kosmetik dengan efek memutihkan kulit.

Ucapan terima kasih:

Kami sangat berterima kasih kepada Michael Thomas-Poulsen (Departemen Biologi, Universitas Kopenhagen, Denmark) untuk mendukung kerja lapangan kami.

Konflik kepentingan:

Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Referensi

1. Newman, DJ; Cragg, GM Produk alam sebagai sumber obat baru dari tahun 1981 hingga 2014. J. Nat. Melecut. 2016, 79, 629–661. [Referensi Silang] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Produk alami: Peran yang berkembang dalam penemuan obat di masa depan. eur. J.Med. kimia 2011, 46, 4769–4807. [Referensi Silang] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Produk alami dari mikroba yang berasosiasi dengan serangga. Beilstein J.Org. kimia 2016, 12, 314–327. [Referensi Silang] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Simbion bakteri dalam sistem pertanian menyediakan sumber strategis untuk penemuan antibiotik. J. Antibiotik. 2014, 67, 53–58. [Referensi Silang] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Munculnya kembali produk alami untuk penemuan obat di era genomik. Nat. Pendeta Obat Discov. 2015, 14, 111–129. [Referensi Silang] [PubMed]

6. Dengan sopan, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Biosintesis total: Rekonstitusi in vitro jalur poliketida dan peptida nonribosomal. Nat. Melecut. Rep. 2008, 25, 757–793. [Referensi Silang] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, poliena peroksida dari Streptomyces sp mutualis. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [Referensi Silang] [PubMed]

8. Duduk, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhan, TR; Currie, CR; Clardy, J. Arsitektur genetik variabel menghasilkan molekul yang hampir identik dalam simbion bakteri semut yang tumbuh jamur. Proses Natl. Acad. Sains. AS 2015, 112, 13150–13154. [Referensi Silang] [PubMed]

9. Rendah, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Cupang, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Rancangan rasional inhibitor calpain berdasarkan peptidomimetik calpastatin. J.Med. kimia 2016, 59, 5403–5415. [Referensi Silang] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cyclic Tripeptides dari jamur halotoleran Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J.Nat. Melecut. 2010, 73, 1133–1137. [Referensi Silang] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, peptida siklik peka-pH Novel YK. Sains. Rep.2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosintesis psikrofilik tripeptida siklik yang mengandung -nitro. J. Antibiotik. 2016, 69, 571–573. [Referensi Silang] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Terapi peptida siklik: Masa lalu, sekarang dan masa depan. Kur. Opin. kimia Biol. 2017, 38, 24–29. [Referensi Silang] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhan, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin dari Streptomyces sp terkait rayap. kimia Sains. 2014, 5, 4333–4338. [Referensi Silang] [PubMed]

15. Kang, SDM; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, glikosida isoflavonoid dari Streptomyces sp. RB1. J.Nat. Melecut. 2016, 79, 3072–3078. [Referensi Silang] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhan, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Macrotermycins A – D, macrolactams glikosilasi dari Amycolatopsis sp. yang berhubungan dengan rayap. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [Referensi Silang] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Isolasi, biosintesis, dan modifikasi kimia rubterolon A–F: Alkaloid tropolon langka dari Actinomadura sp. 5–2. kimia eur. J.2017, 23, 9338–9345. [Referensi Silang] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, penghambat baru aminopeptidase B. II. Penjelasan Struktur. J. Antibiotik. 1986, 39, 1685–1696. [Referensi Silang] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, tripeptida siklik dari spons Vanuatu Reniera n. sp. J.Nat. Melecut. 2002, 65, 407–410. [Referensi Silang] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Agen hipopigmentasi: Tinjauan terbaru tentang aspek biologis, kimia, dan klinis. Pigm. Sel Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [Referensi Silang] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Menjelajahi potensi actinobacteria sebagai simbion pertahanan pada rayap yang tumbuh jamur. Mikroba. Ekol. 2012, 63, 975–985. [Referensi Silang] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Program analisis dan editor penyelarasan urutan biologis yang mudah digunakan untuk Windows 95/98/NT. Gejala Asam Nukleat. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Penjajaran sekuens multi-throughput tinggi yang akurat dari gen RNA ribosom. Bioinformatika 2012, 28, 1823–1829. [Referensi Silang] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Metode penggabungan tetangga: Metode baru untuk merekonstruksi pohon filogenetik. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Pohon evolusioner dari urutan DNA: Pendekatan kemungkinan maksimum. J.Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [Referensi Silang] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Analisis genetika evolusi molekuler versi 7.0 untuk kumpulan data yang lebih besar. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [Referensi Silang] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Estimasi jumlah substitusi nukleotida di wilayah kontrol DNA mitokondria pada manusia dan simpanse. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Keyakinan membatasi filogeni: Pendekatan menggunakan bootstrap. Evolusi 1985, 39, 783–791. [Referensi Silang] [PubMed]

Ketersediaan Sampel:

Sampel senyawa tidak tersedia dari penulis.

For more information:1950477648nn@gmail.com