MicroRNA dalam Perkembangan dan Penyakit Ginjal Ⅲ

MiRNA pada tumor Wilms

tumor wilms,ataunefroblastoma, adalah masa kanak-kanak yang paling umumkanker ginjal, dengan kejadian 1 dari 10,000 anak-anak di Amerika Utara (111). Penyakit ini terutama merupakan penyakit sporadis, meskipun bentuk familial terjadi pada sekitar 1% –2% kasus (112, 113). Tumor Wilms muncul dari nefrogenesis yang menyimpang, dimana prekursor ginjal embrionik pluripoten gagal berdiferensiasi dan bertahan.secara tidak normal dalam kehidupan pascakelahiran(111, 114, 115). Tumor ini secara histologis miripginjal yang sedang berkembangdenganmorfologi terganggu(116), dan mutasi pada gen yang terlibat dalam nefrogenesis janin, termasuk WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122), dan TP53 (123, 124), berhubungan dengan sekitar 40% dari Tumor Wilms (125). Penelitian terbaru yang menggunakan pengurutan seluruh genom dan seluruh exome tumor Wilms mengidentifikasi mutasi baru pada gen risiko kanker (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), gen yang mengkode protein yang memediasi modifikasi histone selama nefrogenesis (BCOR, MAP3K4) (126 ), dan gen pemroses miRNA (121, 122, 128, 129).

BERAPA LAMA CISTANCHE BEKERJA UNTUK PASIEN PENYAKIT GINJAL?

Di antara gen pemroses miRNA, mutasi pada DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2, dan XPO5 (mengkodekan ekspor 5) telah dilaporkan pada tumor Wilms yang belum pernah menggunakan pengobatan dan kemoterapi neoadjuvan (Gambar 3) (121, 122, 128, 129 ). Sekitar 33% tumor Wilms yang diperiksa menunjukkan mutasi yang merugikan pada gen jalur pemrosesan miRNA (128). Mutasi hotspot berulang (E1147K) pada residu met al-binding (Mg2+) dari domain RNase IIIb DROSHA, yang tampaknya unik untuk tumor Wilms, menghapuskan aktivitas katalitik domain ini, sehingga menghasilkan ketidaklengkapan pembelahan pri-miRNA dan penurunan maturasi miRNA (128). Mutasi hotspot somatik yang mempengaruhi domain RNase IIIb dari DICER1 mengganggu pemrosesan 5p miRNA (yang berasal dari lengan 5′ dari jepit rambut pra-miRNA) (129) dan sering ditemukan sebagai mutasi "serangan kedua" yang bekerja bersama-sama dengan DICER1 mutasi germline untuk menginduksi tumorigenesis Wilms pada sindrom DICER1 (kelainan yang meningkatkan kerentanan terhadap berbagai tumor) (130-132). Masih belum jelas mengapa gangguan fungsi DICER1 pada tumor Wilms menghasilkan nefrogenesis yang persisten dan menyimpang, tidak seperti hilangnya Dicer1 pada progenitor nefron tikus, yang menyebabkan peningkatan apoptosis dan penghentian dini nefrogenesis (72-75). Beberapa kemungkinan potensial termasuk bahwa aktivitas dosis gen mungkin penting dalam menentukan kelangsungan hidup sel atau bahwa mutasi pada domain RNase IIIb mungkin mempengaruhi spesifisitas pengikatan miRNA oleh DICER1.

Mutasi pada gen pemroses miRNA dikaitkan dengan penurunan regulasi miRNA penting, termasuk anggota keluarga miR-200 (121) dan let-7 (Gambar 3) (121, 129). Biarkan-7 miRNA dan protein pengikat RNA Lin28 berfungsi bersama untuk mengontrol waktu penghentian nefrogenesis murine, kemungkinan melalui regulasi gen pemacu pertumbuhan Igf2 (133). Ekspresi Lin28 yang berlebihan selama perkembangan ginjal menyebabkan perluasan progenitor nefrogenik, dengan menghambat gelombang diferensiasi terakhirnya, yang berpuncak pada transformasi neoplastik yang sangat mengingatkan pada tumor Wilms manusia (134). Peningkatan jumlah salinan DNA LIN28B dan hilangnya salinan DNA let-7a masing-masing terlihat pada 25% dan 46% sampel tumor Wilms manusia (126). Sejalan dengan pengamatan ini, mutasi germline pada gen DISL3L2 manusia, yang mengkode eksoribonuklease yang bertanggung jawab untuk mendegradasi bentuk let-7 yang telah diproses sebelumnya, menyebabkan sindrom Perlman dan kecenderungan tumor Wilms (135, 136). Sindrom Perlman adalah sindrom pertumbuhan berlebih bawaan yang ditandai dengan makrosomia, polihidramnion, dismorfologi wajah, displasia ginjal, dan nefroblastomatosis (lesi pendahulu tumor Wilms) (137). Di antara bayi dengan sindrom Perlman yang bertahan hidup melewati periode neonatal, 64% mengembangkan tumor Wilms (138). Menariknya, penghapusan DISL3L2 secara lengkap atau sebagian ditemukan pada sekitar 30% tumor Wilms sporadis yang diperiksa (136).

Sebuah studi baru-baru ini memperkuat pentingnya jaringan regulasi miRNA dalam etiologi tumor Wilms. Para penulis menemukan bahwa gen adenoma pleiomorfik 1 (PLAG1) adalah salah satu gen yang paling konsisten diregulasi pada tumor Wilms dengan mutasi pada gen pemroses miRNA (125). Ekspresi ektopik PLAG1 pada ginjal tikus yang sedang berkembang menyebabkan neoplasia, yang disertai dengan transaktivasi gen targetnya, tumor onkogen Wilms IGF2. miR-16 dan miR-34, yang diturunkan regulasinya pada tumor Wilms, diidentifikasi sebagai pengatur potensial ekspresi PLAG1 (125). Tabel 2 merangkum penelitian lain yang melaporkan ekspresi miRNA spesifik yang menyimpang terkait dengan etiologi tumor Wilms. Menariknya, miRNA ini dapat berfungsi sebagai onkogen (disebut oncomiRs) atau penekan tumor dalam perkembangan tumor Wilms, bergantung pada sifat targetnya.

MiRNA sebagai biomarker potensial dan agen terapeutik

Terlepas dari lokasi intraselulernya, miRNA juga terdapat dalam jumlah besar dalam cairan biologis, termasuk darah, plasma, urin, ASI, dan air liur (139). MiRNA yang bersirkulasi ini ditemukan dikemas dalam mikropartikel (eksosom, mikrovesikel, dan badan apoptosis) (140, 141), terkonjugasi dengan protein AGO (142) atau nukleofosmin 1 (143), atau dimuat ke dalam HDL (144), yang membuatnya luar biasa stabil bahkan dalam kondisi yang tidak menguntungkan, seperti perebusan, variasi pH yang ekstrem, penyimpanan yang lama, dan beberapa siklus pembekuan-pencairan (145, 146). Dengan demikian, tanda miRNA dalam cairan biologis dapat mencerminkan hubungan dengan kondisi fisiologis atau penyakit (147). Bersama-sama, fitur-fitur ini membuat miRNA yang bersirkulasi menarik untuk digunakan sebagai biomarker non-invasif untuk diagnosis dan prognosis penyakit.

MiRNA yang bersirkulasi dapat diekstraksi langsung dari cairan biologis yang tidak terfraksi atau preparat vesikel ekstraseluler menggunakan peralatan ekstraksi yang tersedia secara komersial (148) atau TRIzol (149). Setelah diisolasi, miRNA dapat disimpan pada suhu –70 derajat dan tetap stabil hingga 1 tahun (148). Ada beberapa platform yang tersedia untuk pembuatan profil miRNA, termasuk hibridisasi microarray, qPCR, dan sequencing generasi berikutnya (150). Microarray dan qPCR adalah metodologi yang paling sering digunakan untuk menyelidiki ekspresi miRNA yang diketahui (151). Kedua metode ini memiliki keuntungan karena mudah digunakan, relatif cepat mulai dari pelabelan RNA hingga pembuatan data, dan relatif hemat biaya (152). Namun, mereka mengandalkan ketersediaan dan anotasi akurat dari urutan miRNA dalam database untuk desain probe dan primer (150). Meskipun lebih mahal, pengurutan generasi berikutnya memungkinkan deteksi simultan spesies miRNA yang dikenal dan yang baru serta menawarkan sensitivitas tinggi (153). Selain itu, resolusi nukleotida tunggal dari pengurutan generasi berikutnya memungkinkan identifikasi isomiR, yang merupakan isoform miRNA matang yang berbeda dari isoform kanonik dalam hal panjang, urutan, atau keduanya (154, 155), yang mengubah spesifisitas penargetan miRNA ( 156).

Beragam penelitian telah menyelidiki potensi sirkulasi miRNA sebagai biomarker untuk penyakit ginjal anak (157-160). Misalnya, sebuah penelitian mengidentifikasi 14 miRNA yang secara signifikan diregulasi dalam serum pasien dengan tumor Wilms. Menariknya, tanda tangan berdasarkan ekspresi miR-100-5p dan miR-130-3p dapat membedakan pasien ini dari kontrol yang sehat dengan akurasi, sensitivitas, dan spesifisitas (159). Meskipun temuan dari penelitian ini dan banyak penelitian lain telah memberikan motivasi yang kuat untuk mengeksplorasi potensi sirkulasi miRNA sebagai biomarker, beberapa kendala di lapangan perlu diatasi sebelum penerapan klinis secara luas. Pertama, terdapat kurangnya konsensus antar penelitian yang kemungkinan besar disebabkan oleh tidak adanya metodologi standar untuk pemurnian (161) dan analisis sampel (misalnya, perbedaan dalam platform pembuatan profil miRNA, referensi 162, 163; atau perbedaan dalam perpustakaan smRNA-Seq metode persiapan, ref.164). Kedua, kurangnya studi dengan ukuran sampel besar dan investigasi rinci secara spesifikpenyakit.Aspek penting lainnya adalah pengaruh variabel perancu seperti usia, jenis kelamin, dan faktor eksternal (misalnya tembakau, alkohol, dll.) pada profil miRNA belum sepenuhnya dieksplorasi (untuk tinjauan mendalam, silakan merujuk ke ref. 165).

Di sisi terapeutik, beberapa obat berbasis miRNA saat ini sedang dalam uji klinis namun belum mendapatkan persetujuan FDA (166, 167). Pendekatan utama untuk terapi miRNA melibatkan pemulihan kadar miRNA menggunakan peniruan miRNA, atau penghambatan miRNA spesifik menggunakan antagomiRs (168). Salah satu tantangan yang terkait dengan pengembangan terapi berbasis miRNA adalah identifikasi kandidat miRNA untuk setiap penyakit. Karena beberapa miRNA tidak diatur dalam setiap penyakit, analisis yang cermat terhadap sampel pasien yang dikombinasikan dengan uji in vitro dan in vivo yang membahas mekanisme patofisiologis yang dipengaruhi oleh miRNA tersebut harus dilakukan untuk mempersempit kandidat miRNA untuk intervensi terapeutik (168, 169). Tantangan lainnya melibatkan pengembangan strategi untuk meningkatkan stabilitas in vivo dan pemberian obat spesifik lokasi dengan toksisitas minimal dan efek di luar target. Molekul RNA secara kimia tidak stabil karena adanya gugus 2′-hidroksil pada cincin pentosa. Untuk memberikan stabilitas dan perlindungan yang lebih tinggi dari nuklease yang terdapat dalam serum atau kompartemen endositik sel, perusahaan bioteknologi telah menghasilkan molekul RNA dengan modifikasi kimia (gugus 2′-O-metil, fosforotioat, atau asam nukleat terkunci) di tulang punggungnya (166). Sedangkan untuk pengiriman in vivo, teknologinya mencakup berbasis lipid (misalnya nanopartikel lipid dan liposom netral) dan dendrimer yang dikonjugasikan ke bagian penargetan, di antara banyak strategi lainnya. Tantangan utama yang terkait dengan sistem pengiriman miRNA adalah imunotoksisitas dan afinitas spesifik target terhadap lokasi penyakit (170). Strategi penyampaian dengan berbagai metode pemberian (injeksi intraperitoneal, intravena, dan subkutan) atau dengan menggunakan vektor yang mengandung promotor spesifik ginjal dan dapat diinduksi telah berhasil digunakan untuk penargetan ginjal selektif dan untuk menghindari potensi efek samping pada jaringan dan organ lain (171, 172 ).

Tabel 2. Daftar miRNA yang diubah pada tumor Wilms

Daftar miRNA, sampel/spesimen yang dianalisis, kadar miRNA yang diamati dalam sampel/spesimen tersebut dibandingkan dengan kontrol yang sesuai, gen target, konsekuensi perubahan miRNA, dan referensi. CAMKK2, protein kinase kinase 2 yang bergantung pada kalsium/kalmodulin; CDC7, siklus pembelahan sel 7; CDH1, kaderin 1; CREB1, protein pengikat elemen respons cAMP 1; EYA1, mata tidak ada homolog 1; E2F3, faktor transkripsi E2F 3; FRS2, substrat reseptor FGF 2; Glut1, pengangkut glukosa 1; IGF1R, reseptor IGF1; Jag1, bergerigi1; MET, transisi mesenkim-epitel; MKNK1, serin/treonin kinase 1 yang berinteraksi dengan MAPK; PTEN, homolog fosfatase dan tensin; PUMA, p53-modulator apoptosis yang diregulasi; p73, protein tumor p73; ENAM1, homolog homeobox sineoculis 1; TGFBR1, TGF-reseptor 1; WT, tumor Wilms.

Ringkasan

Telah terjadi ledakan informasi mengenai biogenesis miRNA, regulasi ekspresi miRNA, dan fungsi miRNA sejak penemuan awal miRNA pada tahun 1993 (6, 7). Hal ini disertai dengan pemahaman yang semakin meningkat tentang bagaimana fungsi miRNA baik dalam fisiologi normal maupun dalam patofisiologi banyak penyakit. Telah menjadi jelas bahwa disregulasi ekspresi miRNA mengganggu perkembangan awal ginjal dan berimplikasi pada patogenesis penyakit ginjal perkembangan, seperti tumor CAKUT dan Wilms. Dengan perkembangan terkini dalam penggunaan miRNA sebagai biomarker dan sebagai target obat baru, wawasan tentang bagaimana miRNA mengatur perkembangan dan penyakit ginjal sangat penting untuk memahami bagaimana miRNA dapat digunakan dalam pendekatan diagnostik dan terapeutik baru terhadap penyakit-penyakit ini. Untuk mewujudkan upaya ini sepenuhnya, penelitian di masa depan yang mengidentifikasi fungsi miRNA spesifik dalam perkembangan ginjal sangatlah penting, selain teknologi untuk mengoptimalkan penargetan terapi oligonukleotida kecil pada ginjal.

Ucapan Terima Kasih

Laboratorium JH didukung oleh hibah dari NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK125015 dan R01DK102843). DMC didukung oleh Penghargaan Pengembangan Karir Jaringan Studi Sindrom Nefrotik dan Beasiswa Postdoctoral Dewan Penasihat Penelitian Rumah Sakit Anak Pittsburgh. MT didukung oleh Program Magang Penelitian Musim Panas Universitas Pittsburgh (R25DK119180). Angka-angka tersebut dibuat dengan BioRender.com. Alamat korespondensi ke: Jacqueline Ho, Divisi Nefrologi, Departemen Pediatri, Rumah Sakit Anak UPMC Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, AS. Telepon: 412.692.9440; Surel: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A, dkk. miRBase: dari urutan microRNA hingga berfungsi. Asam Nukleat Res. 2019;47(h1): D155–D162.

2. Friedman RC, dkk. Kebanyakan mRNA mamalia adalah target mikroRNA yang dilestarikan. Res Genom. 2009;19(1):92–105.

3.Ghildiyal M, Zamore PD. RNA kecil yang membungkam: alam semesta yang mengembang. Nat Rev Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovic S, dkk. pembungkaman gen yang dimediasi miRNA dengan represi translasi diikuti dengan deadenilasi dan pembusukan mRNA.

Sains. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Pembungkaman gen oleh microRNA: kontribusi represi translasi dan peluruhan mRNA. Nat Rev Genet. 2011;12(2):99–110. 6.Lee RC, dkk. Gen heterokronik C. elegans lin-4 mengkodekan RNA kecil dengan antisense yang saling melengkapi dengan lin-14. Sel.