Banyak penelitian telah mengkonfirmasi bahwa penyakit alergi adalah hasil dari tidak hanya aktivasi kekebalan bawaan 2

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

3. Diskusi

Patogenesis dermatitis atopik (AD) tidak sepenuhnya dipahami, tetapi penyakit ini dimediasi oleh respon imun globulin E (IgE) abnormal pada disfungsi sawar kulit. Di antara mereka, sel mast (MC) dapat menyebabkan penyakit alergi yang dimediasi IgE, termasuk AD. Ketika sel mast diaktifkan, mereka melepaskan partikel sitoplasma terikat membran, yang mengarah pada pelepasan berbagai molekul. Molekul-molekul ini memainkan peran penting dalam patogenesis AD dan pertahanan inang [27]. Karena menghambat aktivasi atau degranulasi sel mast membantu mengatur berbagai reaksi hipersensitivitas yang dimediasi IgE, sel mast adalah salah satu target ideal untuk mengeksplorasi obat anti-alergi. Dalam penelitian kami, sel mast mengalami degranulasi sebagai respons terhadap senyawa 48/80 dan kalsium ionofor A23187, dan anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Kami menemukan bahwa referensi secara efektif menghambat efek degranulasi sel mast, menunjukkan reaksi anti-alerginya. Selain itu, peningkatan kalsium intraseluler dan aktivasi MAPK dihambat oleh referensi. Selanjutnya, infiltrasi sel mast kulit yang disebabkan oleh DNCB dan perilaku menggaruk yang disebabkan oleh senyawa 48/80 juga berkurang. Oleh karena itu, mekanisme dermatitis anti-atopi neferin memiliki multiplier effect pada keratinosit dan sel mast.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) tidak ada informasi lengkap, tidak ada media untuk tidak respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) dan disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, termasuk EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de unavariablead de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activacion o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activacion de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Oleh karena itu, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos dan los mastocitos.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Sitoplasma sel mast yang ditemukan dalam jaringan diisi dengan partikel mediator inflamasi yang besar dan padat yang telah terbentuk sebelumnya [28]. Proses pelepasan mediator ini dari granula sekretorik di sel mast disebut degranulasi. Sejak menghambat degranulasi sel mast dapat mengatur berbagai reaksi hipersensitivitas yang dimediasi IgE, sel mast adalah salah satu target ideal untuk mengeksplorasi obat anti-alergi [29,30]. Hasil kami menunjukkan bahwa referensi memiliki efek yang sangat baik pada degranulasi sel mast terlepas dari penggunaan antigen, stimulator reseptor, atau ionofor. Ini menunjukkan bahwa referensi adalah agen anti-alergi yang potensial (Gambar 2).

Semua granul yang telah disimpan sebelumnya, mediator yang baru disintesis, dan bahkan granul dan komponennya dapat digunakan sebagai indikator aktivasi MC [31]. Selain itu, metode standar adalah pengukuran konsentrasi Ca4t intraseluler. Sebagian besar sekretagog MC (misalnya antigen, senyawa 48/80) yang telah umum digunakan di laboratorium menyebabkan peningkatan konsentrasi Ca2 plus intraseluler. Faktanya, peningkatan konsentrasi Ca2 plus intraseluler juga dapat memicu degranulasi MC. Biasanya, peningkatan Ca4t intraseluler diinduksi oleh pengaktifan MC dengan senyawa, seperti pompa thapsigargin (khususnya memblokir Sarco/endoplasma Ca2 plus ATPase, SERCA) dan ionofor (yaitu, ionomisin dan A23187) [32,33]. Oleh karena itu, dalam aktivasi MC yang bergantung pada Ca2t, pengukuran masuknya Ca2t juga dianggap sebagai metode untuk menentukan kondisi aktivasi MC. Dalam penelitian MC, Fura-2 banyak digunakan untuk penentuan perubahan Ca2 plus intraseluler. Dalam percobaan kami, kami menemukan bahwa intensitas fluoresensi sel mast yang diaktifkan ditekan secara signifikan setelah diperlakukan dengan referensi (Gambar 3). Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi Ca4t intraseluler sesuai dengan pelepasan histamin [34]. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa pelepasan histamin juga akan dihambat oleh pengobatan referensi. Eksperimen lebih lanjut diperlukan untuk memverifikasi hipotesis ini.

Sel mast memiliki keluaran fungsional yang berbeda secara signifikan.dosis cistanche redditIni termasuk degranulasi, pembentukan prekursor asam arakidonat, kemotaksis, dan produksi sitokin, dan semuanya tergantung pada sinyal kalsium sampai batas tertentu, terlepas dari stimulan [32] MC teraktivasi melepaskan sitokin, yang merupakan mediator utama alergi dan penyakit inflamasi [32] 35]. Produksi sitokin oleh sel mast yang teraktivasi merupakan hasil dari induksi transkripsi gen sitokin dalam sel tersebut. Stimulasi sel mast menyebabkan aktivasi NF-kB dan AP-1 dan produksi banyak sitokin [36]. Jalur pensinyalan kaskade MAPK memainkan peran penting dalam regulasi ekspresi sitokin. Aktivasi jalur ini melalui aktivasi PKC oleh PI menghasilkan aktivasi berbagai gen, termasuk gen sitokin inflamasi seperti IL-1, IL-6, dan TNF [37]. Studi terbaru kami menunjukkan bahwa referensi dapat menghambat sitokin yang dilepaskan oleh aktivasi keratinosit. Pada saat yang sama, kami juga menemukan bahwa aktivasi jalur MAPK juga akan dihambat oleh pengobatan referensi [18]. Dalam penelitian kami saat ini, kami menunjukkan bahwa referensi juga dapat mengurangi ekspresi sitokin melalui penghambatan aktivasi MAPK dalam sel mast (Gambar 4 dan 5). Aktivasi NFkB juga berkurang karena penghambatan aktivasi MAPK (Gambar 6).

Cistanche dapat anti-penuaan

Sejumlah penelitian telah melaporkan bahwa berbagai sitokin pada pasien AD meningkat, menyebabkan disfungsi sawar kulit, termasuk sitokin yang disekresi oleh keratinosit dan sitokin yang diturunkan dari Th2-[38,39]. Selain itu, dilaporkan bahwa sitokin yang disekresikan ini juga dapat menurunkan ekspresi protein tight junction (T]) dan gen diferensiasi terminal, termasuk filaggrin (FLG), loricrin (LOR), dan involucrin (IVL) [39,40 Ekspresi ](Pro)filaggrin menurun pada AD dan berhubungan terbalik dengan MC tryptase dan IL-6[41]. IL-1 menengahi peradangan kronis pada tikus dengan gangguan penghalang kulit [35]. Dalam penelitian sebelumnya, dilaporkan bahwa ekspresi FLG, IVL, dan LOR diturunkan regulasinya setelah penerapan DNCB pada kulit punggung mencit NC/Nga[42,43]. Dalam penelitian ini, ekspresi FLG, IVL, dan LOR sangat berkurang di kulit punggung kelompok kontrol, yang menunjukkan bahwa penghalang epidermis terganggu. Pemberian referensi secara signifikan memulihkan penurunan ekspresi FLG, IVL, dan LOR setelah pengobatan DNCB, sementara pemberian referensi sedikit meningkatkan ekspresi IVL dan LOR dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 8). Diketahui bahwa senyawa 48/80 merupakan aktivator sel mast kulit yang efektif. Respon kulit yang dirangsang oleh senyawa 48/80 dapat menginduksi perilaku menggaruk dengan melepaskan histamin dari sel mast [44]. Histamin yang dilepaskan dari sel mast yang teraktivasi berperan penting dalam peningkatan permeabilitas vaskuler yang disebabkan oleh senyawa 48/80. Selama pruritus manusia, histamin dilepaskan dari sel mast melalui berbagai rangsangan juga dipertimbangkan. menjadi mediator penting. Oleh karena itu, menghambat degranulasi sel mast merupakan langkah penting dalam mengatur pelepasan histamin selama perilaku menggaruk. Dalam senyawa penelitian ini, 48/80 menyebabkan aktivasi efektif sel mast kulit. Namun, pretreatment dengan referensi secara signifikan mengurangi tingkat degranulasi sel mast (Gambar 2).manfaat ekstrak cistancheHasil ini menunjukkan bahwa efek perilaku anti gores dari referensi mungkin disebabkan oleh penurunan permeabilitas vaskular dengan mengatur degranulasi sel mast (Gambar 9).

Secara umum diketahui bahwa pasien DA menderita disfungsi sawar kulit, peradangan kulit, atau keduanya, sehingga sulit untuk menemukan metode pengobatan yang tepat. Oleh karena itu, terapi kombinasi biasanya dianjurkan. Penelitian terbaru kami telah membuktikan bahwa tidak pernah memiliki fungsi imunomodulator dan kemampuan perbaikan penghalang. Oleh karena itu, fitur referensi penting dalam pengobatan AD di masa depan adalah pemeliharaan fungsi kulit dan peningkatan hidrasi kulit dan perbaikan penghalang. Referensi juga dapat mengurangi perilaku menggaruk yang disebabkan oleh alergen dan iritan. Apalagi atopic march adalah penyakit terkait fenomena yang terjadi dan berkembang selangkah demi selangkah. Dermatitis atopik sering terlihat pada masa bayi. Alergi makanan sering terjadi setelah usia 1-2tahun. Rinitis alergi sering dapat dimulai sebelum dan sesudah sekolah. Gejala asma muncul pada waktu yang berbeda, tetapi kebanyakan setelah rinitis alergi. Setelah masa kanak-kanak, dermatitis atopik dan alergi makanan tertentu dapat membaik atau hilang. Rinitis alergi dan asma tidak mudah disembuhkan[45,46]. Oleh karena itu, mereka adalah fenomena komorbiditas pada penyakit. Produk alami termasuk referensi memiliki potensi terapeutik komorbiditas, dan efektivitasnya dalam penyakit terkait layak dipelajari di masa depan.

4. Bahan dan Metode

4.1.Sel Leukemia Basofilik Tikus

Sel leukemia basofilik tikus (RBL-2H3) adalah hadiah dari TLHwang, Universitas Chang Gung, Taoyuan, Taiwan. RBL-2Sel H3 adalah sel mast mukosa yang digunakan untuk mempelajari antigen atau degranulasi yang diinduksi kalsium ionofor, Ca4t intraseluler, dan transduksi sinyal [29]. Sel-sel dikultur dalam EMEM yang mengandung 10 persen FBS, dengan penisilin dan streptomisin pada 37 derajat ,5 persen CO2. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) dan fetal bovine serum (FBS) dibeli dari Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2.MTT Assay

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay digunakan untuk mengukur aktivitas metabolisme sel. Sel-sel RBL-2H3 diunggulkan dalam cawan kultur sumur 24-pada 5 × 10 plus /sumur. Setelah 24 jam pengobatan, 30 L MTI per sumur ditambahkan dan ditempatkan pada inkubator sel 37 derajat selama 2-4 jam, kemudian kristal formazan ungu dilarutkan dengan DMSO. Pembaca ELISA digunakan untuk mengukur intensitas absorbansi pada panjang gelombang 550 nm sebagai uji viabilitas sel.

4.3.Pengukuran Ca2 Intraseluler plus Level

[Ca2t] Saya diukur dengan fura-2 seperti yang dijelaskan sebelumnya[47].RBL-2Sel H3 disuspensi ulang dalam IMDM yang mengandung 5 uM Fura 2-AM dan 1,2 mM CaClz pada 37 derajat untuk 30 menit. Setelah pemuatan Fura-2, keratinosit dibuat pelet dan disuspensikan kembali dalam DMEM segar. Sebuah alikuot (2 mL) dipindahkan ke kuvet berpengaduk yang mengandung 1.2mM CaClz.Fura-2-Ca fluoresensi diuji pada panjang gelombang eksitasi 340 dan 380 nm (panjang gelombang emisi, 505 nm) dalam PerkinElmer LS{{19 }} spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Data direkam pada interval 5 detik[47].

4.4. Reaksi Rantai Polimer Kuantitatif (qPCR)

RBL{{0}}Sel H3 ditanam dalam cawan kultur 3,5 cm. Setelah sel tumbuh hingga 90 persen penuh, sel ditumbuhkan dalam keadaan statis selama 24 jam. Setelah sel-sel diperlakukan dengan referensi selama 20 menit, mereka distimulasi dengan TNF-a/IFN-y masing-masing selama 1 atau 24 jam. Sel-sel dikerok, disentrifugasi (16,000×g,10 menit,4 derajat), dan supernatannya diekstraksi. RNA dimurnikan menggunakan kit isolasi RNA total (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). Menurut prosedur operasi skrip cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), reagen ditambahkan secara berurutan dan dioperasikan sesuai dengan kondisi yang ditunjukkan untuk mengubah RNA menjadi cDNA. Selanjutnya, PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) digunakan. Sebanyak 7,5 uL ddH20,2 uL cDNA, 0,25 L primer forward dan reverse, dan 10 uL SYBR GREEN ditambahkan dan dicampur secara merata. Urutan primer ditunjukkan pada Tabel 1 dan 2. Kemudian, RNA dikuantifikasi menggunakan ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System.

4.5. Uji Western Blot

Western blotting digunakan untuk menganalisis perubahan berbagai protein dalam sel. Sel-sel RBL{{0}}H3 diunggulkan dalam cawan kultur 3,5 cm. Setelah sel tumbuh hingga 90 persen penuh dan kelaparan selama 24 jam, mereka diperlakukan dengan referensi selama 20 menit, dan kemudian distimulasi dengan TNF-a atau IFN-y masing-masing selama 30 menit atau 1 jam. Setelah mengikis, mereka dihaluskan dengan ultrasound dan disentrifugasi (13.200 rpm, 10 menit, 4 derajat). Setelah sentrifugasi, supernatan diambil dan protein diukur dengan kit uji protein Pierce (Pierce, Rockford, IL, USA). Itu dielektroforesis pada 10 persen gel SDS-poliakrilamida dan kemudian dielektroporasi dengan membran PVDF. Setelah transfer selesai, membran PVDF dimasukkan ke dalam larutan TBS-T (Tris-buffered saline/0.05 persen tween 20) yang mengandung 5 persen susu bubuk skim dan dikocok selama 1 jam untuk menghindari ikatan yang tidak spesifik. Kemudian, TBS-T digunakan untuk mencuci 3 kali, 10 menit setiap kali. Kemudian, antibodi primer (pengenceran 1:1000) ditambahkan dan ditempatkan pada suhu 4 derajat semalam dan kemudian dicuci 3 kali dengan TBS-T setiap 10 menit. Setelah menambahkan antibodi sekunder (diencerkan 1:1000) selama 1 jam, membran PVDF dicuci 3 kali dengan TBS-T selama 10 menit setiap kali. Akhirnya, pengembang ditambahkan, dan membran ditempatkan dalam sistem ekstraksi pendaran kimia (BIOSTEP Celvin") untuk pemotretan.

4.6.Dinitrochlorobenzene(2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB)Induksi Peradangan Kulit Seperti Dermatitis Atopik pada Tikus

Pertama, mencit dibagi menjadi empat kelompok: kelompok kontrol, kelompok DNCB (kelompok negatif), referensi (3 mg/kg dan 10 mg/kg) dengan kelompok DNCB, dan deksametason (0,2 mg/kg) dengan Kelompok DNCB (kelompok positif). Deksametason adalah hormon kortikosteroid yang dapat mengurangi pembengkakan dan reaksi alergi. Dalam percobaan in vivo ini, referensi dan deksametason dilarutkan dalam DMSO, sedangkan DNCB dilarutkan dalam etanol 75 persen dengan kejutan ultrasonik. Yang pertama diberikan melalui injeksi intraperitoneal, dan untuk yang kedua, 100 uL dioleskan ke kulit punggung dan 20 L dioleskan ke telinga kanan. Tiga hari sebelum percobaan, tikus dibius dan bulu belakang dihilangkan, dan magnet pengukur kecil (SCT-MAG-TF) disematkan di bagian belakang kaki belakang tikus.cistanche genghis khanSetelah diistirahatkan selama tiga hari, dipastikan bahwa kondisi fisik mencit dalam keadaan baik dan kulit pada daerah pencabutan punggung normal, maka percobaan pun dimulai. Selama percobaan, foto diambil untuk merekam perubahan penampilan kulit. Tahap pertama ({{0}} hari) adalah periode dermatitis atopik alergi. Setelah dilakukan pengukuran nilai dasar mencit kelompok DNCB, kelompok eksperimen referensi (3 dan 10 mg/kg) dan DNCB, serta kelompok eksperimen deksametason 0,2mg/kg dan DNCB, DNCB 1 persen dioleskan merata pada kulit punggung dan telinga kanan. Pada hari kelima, obat referensi dan deksametason disuntikkan secara intraperitoneal. Tahap kedua (hari ke-5 hingga hari ke-14) adalah induksi ulang dermatitis atopik.perpanjangan hidup cistanchePada 3 kelompok eksperimen, 00,5 persen DNCB dioleskan secara merata pada kulit punggung dan telinga kanan mencit. Keesokan harinya, nilai fisiologis kulit dan gambar diambil dan direkam. Setelah tikus di-eutanasia dengan karbon dioksida (CO2) berlebihan pada hari ke-15, jaringan kulit punggung dihilangkan untuk analisis eksperimental selanjutnya.

4.7.Compound 48/80-Perilaku Menggaruk yang Diinduksi pada Tikus BALB/c

Rambut dari kulit punggung mencit dipotong, dan 20 L senyawa 48/80 larutan disuntikkan secara intrakutan. Tikus kontrol menerima suntikan garam sebagai gantinya. Segera setelah disuntik, hewan ditempatkan dalam kandang observasi (diameter 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Jepang), dan perilaku menggaruk tikus secara otomatis dan objektif dideteksi dan dievaluasi. Perilaku awal diukur selama 60 menit. MicroAct menggunakan parameter analisis berikut untuk mendeteksi gelombang yang sesuai dengan perilaku menggaruk tikus yang terus menerus: ambang batas,0,05 V; celah kejadian,0,05 s; durasi minimum, 0,25 detik; frekuensi maksimum, 30 Hz; frekuensi minimum, 5Hz. 4.8.Analisis Statistik

Perangkat lunak Sigma-Plot (Versi 10.0) digunakan untuk analisis statistik.cistanche nzData dinyatakan sebagai mean ± SEM, dengan(*)dan(#) sebagai catatan. Signifikansi statistik dari data dianalisis dengan nilai Student t-tests.p tidak berpasangan dua sisi kurang dari 0.05 dan 0,01 dianggap signifikan.

5. Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami menentukan bahwa referensi secara efektif menghambat degranulasi sel mast dan mengurangi ekspresi sitokin pro-inflamasi, yang dapat mengurangi gejala seperti dermatitis atopik, memulihkan penghalang kulit, dan mengurangi goresan kulit. Kami telah membuktikan lebih lanjut bahwa referensi tidak hanya dapat bekerja pada keratinosit kulit tetapi juga mempengaruhi aktivasi sel mast. Ini memiliki lebih banyak potensi untuk aplikasi pada penyakit kulit alergi dan inflamasi.

Artikel ini diambil dari Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms