Hilangnya JAK1 Mendorong Defisiensi Imun Bawaan

Jalur pensinyalan Janus kinase—transduser sinyal dan aktivator transkripsi (JAK-STAT) sangat penting dalam menyesuaikan respons imun dan disregulasinya terkait erat dengan kanker dan gangguan imun. Gangguan jalur pensinyalan interleukin (IL)-15/STAT5 karena hilangnya rantai reseptor IL-15, JAK3 atau STAT5 menyebabkan defisiensi imun dengan kelainan sel pembunuh alami (NK). JAK1, bersama dengan JAK3 mentransmisikan sinyal hilir IL-15, namun kontribusi pasti JAK1 terhadap biologi sel NK masih harus dijelaskan. Untuk mempelajari konsekuensi defisiensi JAK1 pada sel NK, kami membuat tikus dengan penghapusan JAK1 bersyarat dalam sel NKp46+ (Jak1fl/flNcr1Cre). Kami tunjukkan di sini bahwa penghapusan JAK1 intrinsik sel NK secara signifikan mengurangi jumlah sel NK di sumsum tulang dan mengganggu perkembangannya. Sejalan dengan itu, kami mengamati hampir hilangnya sel NK di limpa, darah, dan hati, membuktikan peran penting JAK1 dalam sel NK perifer. Sejalan dengan itu, tikus Jak1fl/+Ncr1Cre menunjukkan gangguan signifikan dalam pengawasan tumor yang dimediasi sel NK. Data kami menunjukkan bahwa JAK2 tidak mampu mengkompensasi hilangnya JAK1 dalam sel NK. Yang penting, penghapusan JAK2 bersyarat dalam sel NKp46+ tidak berpengaruh pada sel NK perifer yang mengungkapkan bahwa JAK2 intrinsik sel NK dapat digunakan untuk kelangsungan hidup sel NK. Singkatnya, kami mengidentifikasi bahwa hilangnya JAK1 dalam sel NK mendorong defisiensi imun bawaan, sedangkan defisiensi JAK2 membuat jumlah dan pematangan sel NK tidak berubah. Oleh karena itu, kami mengusulkan bahwa berbeda dengan inhibitor JAK1/JAK2 yang saat ini digunakan, penggunaan inhibitor spesifik JAK2-akan bermanfaat bagi pasien karena membiarkan sel NK tetap utuh.

Kata Kunci: JAK-STAT, sel pembunuh alami, JAK1, JAK2, surveilans tumor

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

PERKENALAN

Sel pembunuh alami (NK) adalah limfosit bawaan yang mengenali dan membunuh sel yang terinfeksi atau diubah oleh virus (1). Defisiensi sel NK merupakan subtipe imunodefisiensi primer (PID) yang jarang namun semakin banyak diketahui. Defisiensi sel NK klasik ditandai dengan tidak adanya sel NK dalam darah tepi dan mengakibatkan peningkatan kerentanan terhadap infeksi virus (2). Jalur pensinyalan Janus kinase (JAK)—transduser sinyal dan aktivator transkripsi (STAT) bertindak di hilir beberapa sitokin, faktor pertumbuhan, dan hormon sehingga secara kritis mengatur respons imun (3, 4). Setelah pengikatan ligan tertentu ke reseptor serumpunnya, perubahan konformasi menyebabkan oligomerisasi reseptor dan aktivasi JAK terkait reseptor. JAK melakukan auto- dan trans-fosforilasi satu sama lain dan memfosforilasi rantai reseptor, menyediakan tempat berlabuhnya molekul STAT. STAT kemudian menjalani fosforilasi yang dimediasi JAK, dimerisasi, dan translokasi ke nukleus, di mana mereka mengatur transkripsi gen target (5). JAK3 dan STAT5 adalah pemain penting dalam mentransduksi sinyal hilir sitokin yang memanfaatkan reseptor c (6). Mutasi "kehilangan fungsi" (LOF) pada gen yang mengkode JAK3 (7) atau STAT5B (8) menyebabkan PID dengan kelainan sel NK yang menggarisbawahi pentingnya jalur limfosit bawaan. Defisiensi imun pada pasien ini disebabkan oleh gangguan respons IL-7 dan IL-15 (6). Yang penting, JAK1 memiliki peran dominan dibandingkan JAK3 dalam mengaktifkan STAT5 di bagian hilir reseptor sitokin yang mengandung c (9). Menarik untuk berspekulasi bahwa mutasi LOF pada JAK1 juga dapat menyebabkan PID. Sampai saat ini, hanya satu pasien yang memiliki mutasi germline JAK1, dimana JAK1 berkurang namun tidak hilang, telah diidentifikasi dan memang mengalami penekanan kekebalan (10). Pada tikus, kehilangan total JAK1 menyebabkan kematian perinatal dan tikus yang baru lahir menunjukkan penurunan timosit dan sel B yang kuat (11). Pengamatan ini dikonfirmasi pada tikus dewasa: penghapusan JAK1 yang dapat diinduksi menyebabkan kerusakan homeostasis sel induk hematopoietik (HSCs) dan secara nyata mengurangi frekuensi sel B dan subset B220+CD11c+NK1.1+ sel NK (12). Namun, hingga saat ini, belum ada penelitian yang menganalisis secara langsung pengaruh hilangnya JAK1 pada sel NK konvensional.

Cistanche deserticola ma-Menjaga liver

Wawasan pertama mengenai kontribusi JAK1 terhadap biologi sel NK berasal dari penelitian yang menggunakan penghambat JAK—obat yang disetujui untuk pengobatan kanker dan penyakit autoimun (13). Baik tikus maupun pasien yang diobati dengan inhibitor JAK1/JAK2 Ruxolitinib menunjukkan penurunan jumlah sel NK, gangguan maturasi, dan fungsi (14, 15). Karena JAK2 juga terlibat dalam mendorong diferensiasi sel NK (14, 16), masih harus dijelaskan yang mana dari dua kinase yang bertanggung jawab atas efek yang diamati dari pengobatan Ruxolitinib. Menggunakan tikus dengan KO Jak1 atau Jak2 dalam sel NKp46+, kami menunjukkan di sini bahwa JAK2 dapat digunakan untuk kelangsungan hidup sel NK. Sebaliknya, penghapusan JAK1 pada sel NK dewasa menyebabkan defisiensi sel NK, dan hilangnya satu alel Jak1 sudah cukup untuk mengganggu pengendalian pertumbuhan tumor. Dengan demikian, kami mengidentifikasi JAK1 sebagai faktor kunci untuk sel NK dewasa dan menghasilkan model tikus yang mengalami defisiensi sel NK klasik.

BAHAN DAN METODE

Tikus dan Garis Sel

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; disediakan oleh Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Wina, Austria). Alel Jak1tm1c dari mutan dihasilkan dari tikus dengan alel pertama knockout Jak1tm1a (dijelaskan oleh Konsorsium Fenotip Tikus Internasional https://www.mousephenotype.org) dengan mengeluarkan kaset lacZ-neo melalui rekombinasi Flp.

Potensi kondisional tikus Jak1fl / fll diaktifkan oleh rekombinasi Cre dan eksisi ekson 3 Jak1 yang diapit loxP. Rekombinasi spesifik jaringan diinduksi oleh persilangan Jak1fl/fl atau Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] dengan B6NTg(Ncr1Cre); (18) tikus. Tikus Stat5fl/fl (19) dan Stat5fl/flNcr1Cre (18) telah dijelaskan sebelumnya. Tikus Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre berada pada latar belakang C57B6/N dan Jak2fl/fl berada pada latar belakang campuran. Hewan percobaan disesuaikan usianya (8-12 minggu) dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu di Universitas Kedokteran Hewan, Wina menurut pedoman Federasi untuk Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium (FELASA) (2014). Percobaan pada hewan telah disetujui oleh Komite Etika dan Kesejahteraan Hewan dari Universitas Kedokteran Hewan Wina dan otoritas nasional (Kementerian Ilmu Pengetahuan dan Penelitian Federal Austria) menurut §§ 26ff. Animal Experiments Act, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, di bawah lisensi BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 dan BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 dan dilakukan sesuai pedoman FELASA dan ARRIVE. Di seluruh makalah ini, Jak1WT mengacu pada data yang dikumpulkan dari mouse Jak1fl/+ dan Jak1fl/fl. Garis sel limfoma tikus RMA-Rae1 [disediakan oleh Prof. A. Cerwenka; (20)] dan YAC-1 dikultur dalam media lengkap RPMI1640 (Sigma) yang mengandung 10% FCS (Bio & Sell), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin (Sigma), dan 50µM {{58 }}merkaptoetanol (Sigma).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Model Tumor in vivo

Tikus Jak1fl/+ dan Jak1fl/+Ncr1Cre disuntik sc dengan 10 sel RMA-Rae1 ke kedua sisi dan pertumbuhan tumor dipantau setiap dua hari sekali. Sepuluh hari pasca injeksi, tikus dikorbankan dan berat tumor ditentukan. Untuk analisis aliran sitometri sel NK yang menginfiltrasi tumor, tumor dipotong menjadi potongan berukuran ∼5 mm2, dan suspensi sel tunggal diperoleh dengan menggunakan MACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) yang lembut dengan buffer pencernaan yang mengandung Kolagenase D (1 mg/mL; Sigma Aldrich) dan DNAse I (20 mg/mL; Roche).

Isolasi, Ekspansi, dan Stimulasi Sel NK

Sel NK diisolasi dari suspensi sel tunggal limpa menggunakan manik-manik MACS berlabel DX5-sesuai dengan instruksi pabrik (Miltenyi Biotec). Sel NK diperluas dalam media lengkap RPMI1640 yang dilengkapi dengan 5,000 U/mL rhIL-2 (Proleukin, Novartis) selama 7 hari. Jumlah sel CD3−NK1.1+ dinilai dengan flow cytometry pada hari ke 0, 3, 5, dan 7. Pada hari ke 7 sel dilisiskan untuk analisis Western blot. Untuk analisis pSTAT5, 106 splenosit distimulasi dengan 50 ng/ml rmIL-15 (PeproTech) selama 15 menit dan sel difiksasi dalam PFA 2% diikuti dengan permeabilisasi metanol dan rehidrasi.

Uji Sitotoksisitas Sel NK

Untuk uji sitotoksisitas in vitro, sel NK yang diurutkan DX5-MACS diperluas selama 7 hari dalam IL-2 seperti dijelaskan di atas dan dicampur pada efektor yang ditunjukkan: rasio target dengan carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE, Molecular Probe , Kit Proliferasi Sel CellTrace CFSE) berlabel sel target. Setelah 4 jam inkubasi pada suhu 37◦C, sel diwarnai dengan Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer), dan lisis sel target spesifik dinilai dengan flow cytometry.

Aliran Sitometri

Suspensi sel tunggal dibuat dari limpa, sumsum tulang, atau hati. Hati diperfusi melalui vena portal dengan 5–10 mL PBS steril. Pemisahan limfosit dilakukan dengan menggunakan 37,5% personal (GE Healthcare). Untuk analisis darah, eritrosit dilisiskan menggunakan BD FACS Lysing Solution sesuai dengan protokol pabrikan (BD Bioscience). Antibodi (klon) yang menargetkan protein berikut dibeli dari eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136), dan Ter119 (TER-119). Antibodi CD49a (Ha31/8) dan pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] dibeli dari BD Pharminogen dan pan-Rae1 (186107) dibeli dari R&D Systems. Jumlah sel total dinilai dengan flow cytometry menggunakan penghitungan manik Count Bright Beads (Invitrogen). Eksperimen aliran sitometri dilakukan pada BD FACSCanto II (BD Bioscience) atau Cytoflex (Beckman Coulter) dan dianalisis menggunakan perangkat lunak BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) atau FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

GAMBAR 1|Hilangnya JAK1 dalam sel NKp46+ menyebabkan hampir tidak adanya sel NK perifer. (A) Frekuensi (panel kiri) dan jumlah total (panel kanan) sel Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ NK di sumsum tulang dinilai berdasarkan aliran sitometri. (B) Sel Lin−CD122+ sumsum tulang dibagi lagi menjadi prekursor NK (NKP: NKp46−NK1.1−), sel NK yang belum matang (iNKs: NKp46−NK1.1+), dan sel matang Sel NK (mNK: NKp46+NK1.1+). (C) Frekuensi sel CD3−NKp46+ NK di limpa dinilai dengan flow cytometry dan plot yang representatif ditampilkan. (D, E) Frekuensi (panel kiri) dan jumlah total (panel kanan) sel CD3−NKp46+ NK dalam limpa (D) dan (E) darah dinilai dengan flow cytometry. (F) Frekuensi sel NK konvensional (CD3−NK1.1+NKp46+CD49b+, panel kiri) dan sel ILC1 (CD3−NK1.1+NKp46+CD49a+ , panel kanan) dianalisis pada hati tikus Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre, dan Jak1fl/flNcr1Cre dengan flow cytometry. (A, B,D – F) Grafik batang mewakili rata-rata ± SEM dari 1–2 percobaan independen; n=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001.

GAMBAR 2|Sel NK Jak1fl/flNcr1Cre yang tersisa menunjukkan fenotip yang belum matang. (A, B) Sel CD3−NKp46+ NK limpa dianalisis untuk ekspresi CD27 dan CD11b dengan flow cytometry. (A) Frekuensi sel di setiap tahap pematangan ditampilkan: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}}CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). Jumlah total sel di setiap tahap pematangan ditunjukkan pada Gambar S1C. (B) Plot representatif ditampilkan. (C) sel pSTAT5(Y694)+ dianalisis dalam populasi CD3−NKp46+NK1.1+ ex vivo setelah 15 menit stimulasi dengan IL-15 dengan flow cytometry. (D) Sel CD3−NKp{{30}} NK limpa dianalisis untuk ekspresi reseptor pengaktif dan penghambat yang ditunjukkan dengan flow cytometry. Persentase sel NK positif untuk setiap reseptor ditampilkan. Data median intensitas fluoresensi disajikan pada Gambar S1D. (A – D) Grafik batang dan angka pada plot mewakili rata-rata ± SEM dari 2 percobaan independen; n=5–8. **p < 0,01, ***p < 0,001.

noda barat

Lisis sel, SDS-PAGE, dan Western blots dilakukan seperti dijelaskan sebelumnya (21). Deteksi chemiluminescence dilakukan menggunakan substrat Clarity Western ECL (BioRad) dan ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) dan dianalisis dengan perangkat lunak Image Lab (BioRad). Antibodi berikut digunakan: anti– -aktin (C4, sc-47778) dari Santa Cruz sebagai kontrol pemuatan, anti-JAK2 (D2E12; #3230), antiPerforin (#3693), dan anti-JAK1 (#3332 ) dari Teknologi Sinyal Sel.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Analisis statistik

Uji-t tidak berpasangan atau ANOVA satu arah dengan pasca-tes Tukey dilakukan menggunakan GraphPad Prism versi 5.00 (Perangkat Lunak GraphPad). Tingkat signifikansi ditunjukkan untuk setiap percobaan (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p < 0.001).

HASIL

Penghapusan JAK1 Mengurangi Jumlah Sel NK dan ILC1 dengan Cara yang Tergantung Dosis

Inhibitor JAK1/JAK2 Ruxolitinib telah terbukti mengurangi jumlah, maturasi, dan fungsi sel NK (14, 15). Untuk membandingkan dan mengatasi kontribusi JAK1 dan JAK2 terhadap biologi sel NK, kami membuat tikus dengan penghapusan bersyarat JAK1 atau JAK2 dalam sel NKp46+. Kami kemudian menyilangkan tikus Ncr1Cre (18) dengan tikus Jak1fl/fl atau Jak2fl/fl [lihat bagian Bahan dan Metode dan (17)] tikus. Sel NK berkembang di sumsum tulang dari prekursor sel NK (NKP), yang didefinisikan sebagai Lin−CD122+NK1.1−NKp46−. Mereka berkembang menjadi sel NK yang belum matang (iNKs) yang menjadi NK1.1+ sedangkan hanya sel NK yang matang (mNKs) yang merupakan NK1.1+NKp46+ (22). Karena ekspresi Cre recombinase pada tikus Ncr1Cre didorong oleh promotor NKp46, penghapusan yang dimediasi Cre terbatas pada sel NK. Kami mengamati penurunan yang signifikan dalam persentase dan jumlah total sel NK sumsum tulang pada tikus Jak1fl/flNcr1Cre (Gambar 1A). Sel Lin−CD122+ NK pada tikus Jak1fl/flNcr1Cre menunjukkan persentase prekursor sel NK (NKP) yang diperkaya dan sel NK yang belum matang, sementara mNK berkurang secara signifikan di sumsum tulang sejalan dengan blok perkembangan pada sel iNK tahap mencegah perkembangan ke tahap sel mNK (Gambar 1B). Penghapusan satu alel Jak1 menyebabkan jumlah sel NK sumsum tulang antara (Gambar 1A). Secara konsisten, perkembangan sel NK menunjukkan fenotip perantara yang menunjukkan efek dosis gen Jak1 pada perkembangan sel NK (Gambar 1B). Penghambatan dalam pengembangan sel NK sumsum tulang menyebabkan berkurangnya jumlah sel NK di perifer secara drastis. Hilangnya JAK1 menyebabkan defisiensi sel NK limpa dan darah yang hampir lengkap (Gambar 1C – E). Sejalan dengan efek dosis gen Jak1, tikus Jak1fl/+Ncr1Cre menunjukkan penurunan persentase sel NK dan jumlah total hingga 50% dibandingkan dengan tipe liar di limpa dan darah (Gambar 1C – E). Penghapusan efektor hilir JAK1 dan faktor transkripsi STAT5 dalam sel NKp46+ juga menyebabkan pengurangan sel NK dewasa (18). Perbandingan langsung tikus Jak1fl/flNcr1Cre dan Stat5fl/flNcr1Cre mengungkapkan bahwa penghapusan JAK1 memicu defisiensi sel NK yang lebih parah pada limpa dan darah daripada penghapusan STAT5 (Gambar S1A, B). Limfosit bawaan NKp46+ hati terdiri dari dua kelompok garis keturunan yang berbeda (23). Sel NK konvensional (cNK) dicirikan oleh ekspresi CD49b dan bersirkulasi dengan bebas sedangkan limfosit bawaan tipe 1 yang tinggal di hati (ILC1) dicirikan oleh ekspresi CD49a dan terbatas pada hati (24). Mirip dengan limpa dan darah, cNK hati dan ILC1 yang ada di jaringan hampir sepenuhnya hilang setelah hilangnya JAK1 (Gambar 1F). Sekali lagi penghapusan satu alel Jak1 menghasilkan limfosit bawaan hati yang berlimpah (Gambar 1F). Singkatnya, temuan ini mengarahkan kami pada kesimpulan bahwa ekspresi JAK1 dalam sel NKp46+ sangat diperlukan untuk pengembangan dan pemeliharaan sel NK di organ perifer dengan cara yang bergantung pada dosis.

JAK1 Sangat Penting untuk Pematangan Sel NK

Di pinggiran, sel NK mengalami tahap pematangan yang ditandai dengan ekspresi berurutan dari penanda permukaan CD27 dan CD11b (22). Satu alel Jak1 cukup untuk mendorong pematangan sel NK karena kami tidak mendeteksi perbedaan persentase sel di setiap tahap pematangan antara sel Jak1WT dan Jak1fl/+Ncr1Cre (Gambar 2A, B). Sel Jak1fl/flNcr1Cre NK yang tersisa menunjukkan peningkatan populasi yang belum matang (CD27+CD11b−) dan penurunan populasi CD27−CD11b+ dewasa (Gambar 2A, B, dan Gambar S1C). Hasil ini menunjukkan bahwa sel yang tersisa mungkin kehilangan JAK1 dan belum menerima sinyal IL{19}} yang cukup untuk matang sepenuhnya. Memang, sel-sel Jak1fl/flNcr1Cre NK yang tersisa menunjukkan penurunan fosforilasi STAT5 ex vivo setelah stimulasi jangka pendek dengan IL-15 (Gambar 2C). Aktivitas sel NK dikendalikan oleh keseimbangan antara reseptor pengaktif dan penghambat. Penghapusan salah satu atau kedua alel Jak1 tidak berpengaruh pada persentase sel NK yang mengekspresikan reseptor pengaktif dan penghambat berikut: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E, dan Ly49A (Gambar 2D). Perbedaan yang paling menonjol adalah sedikit penurunan sel Ly49G2+ NK dan peningkatan sel DNAM-1+ NK pada tikus Jak1fl/flNcr1Cre (Gambar 2D). Demikian pula, tidak ada perbedaan besar yang terdeteksi pada tingkat ekspresi (MFI) masing-masing reseptor, selain peningkatan MFI DNAM1 dan Ly49G2 (Gambar S1D). Selain perannya sebagai reseptor pengaktif, ekspresi DNAM- 1 menandai langkah perkembangan; Sel DNAM-1+ menimbulkan sel DNAM-1− (25). Kami beralasan bahwa perubahan DNAM-1+ mencerminkan blok pematangan sel Jak1fl/flNcr1Cre NK.

GAMBAR 3|JAK2 dapat digunakan untuk kelangsungan hidup dan pematangan sel NK. (A) Frekuensi (panel kiri) dan jumlah total (panel kanan) sel CD3 −NKp46+ NK di limpa tikus Jak2WT dan Jak2fl/flNcr1Cre dinilai dengan flow cytometry. (B) Sel CD3−NKp46+ NK limpa dianalisis untuk ekspresi CD27 dan CD11b dengan flow cytometry. Frekuensi sel pada setiap tahap pematangan ditunjukkan: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (C) Ekspresi JAK2 dan -aktin dianalisis dengan Western blot pada sel NK setelah 6 hari ekspansi di IL-2. Pemindaian noda penuh tersedia di Materi Tambahan. (A,B) Grafik batang mewakili rata-rata ± SEM dari 2–3 percobaan independen; n=5–12.

GAMBAR 4|Hilangnya satu alel Jak1 mengganggu aktivitas sel NK. (A) Sel NK dimurnikan MACS dari limpa dan dikultur dalam IL-2 selama 7 hari. Jumlah sel CD3−NK1.1+NKp46+ hidup dinilai setiap 2–3 hari. Simbol dan bilah kesalahan menunjukkan rata-rata ± SEM dari 2–4 ulangan biologis. (B) Ekspresi JAK1, Perforin, dan -aktin dianalisis dalam sel NK yang diperluas dari dua percobaan independen dengan Western blot. Pemindaian noda penuh tersedia di Materi Tambahan. (C) Sel NK yang diperluas dari tikus Jak1WT dan Jak1fl/+Ncr1Cr dicampur dengan sel target YAC{{20}} (panel kiri) atau RMA-Rae1 (panel kanan) yang diwarnai CFSE pada rasio target efektor yang ditunjukkan . Lisis spesifik dinilai dengan flow cytometry. Untuk YAC-1, grafik yang mewakili salah satu dari dua eksperimen independen ditampilkan. Simbol dan bilah kesalahan menyajikan rata-rata ± SEM dari 2 ulangan teknis. Untuk RMA-Rae1, rata-rata dari dua percobaan independen ditampilkan. Simbol dan bilah kesalahan menunjukkan rata-rata ± SEM dari 2–3 ulangan biologis. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 Dapat Digunakan untuk Kelangsungan Hidup dan Pematangan Sel NK

Sejauh ini kami telah menunjukkan bahwa penghapusan JAK1 intrinsik sel NK menyebabkan defisiensi sel NK. Untuk menjelaskan apakah JAK2 berdampak pada kelangsungan hidup dan pematangan sel NK, kami menganalisis sel NK limpa pada tikus Jak2fl/flNcr1Cre dan teman serasah tipe liarnya. Kami gagal mendeteksi dampak penghapusan JAK2 pada frekuensi atau jumlah total sel CD3−NKp46+ di limpa (Gambar 3A). Lebih lanjut, tikus Jak2fl/flNcr1Cre menunjukkan pematangan sel NK yang normal, karena persentase sel CD27−CD11b+ yang serupa terdeteksi pada kedua genotipe (Gambar 3B). Karena penghapusan protein JAK2 dalam sel NK sangat efisien (Gambar 3C), data ini dengan tegas mendefinisikan bahwa tidak seperti JAK1, JAK2 intrinsik sel NK dapat digunakan untuk kelangsungan hidup dan pematangan sel NK.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Hilangnya Satu Alel Jak1 Merusak Fungsi Sel NK

Untuk mendapatkan wawasan lebih lanjut tentang bagaimana JAK1 mengatur fungsionalitas sel NK, kami menganalisis pertumbuhan sel NK limpa yang dimurnikan MACS dari Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre, dan Jak1fl/flNcr1Cre. Sel NK yang kekurangan JAK1-tidak berkembang, yang menunjukkan bahwa bahkan dengan dosis IL-2 yang sangat tinggi, JAK lain tidak dapat mengkompensasi hilangnya JAK1 (Gambar 4A). Hilangnya satu alel Jak1 mengakibatkan sedikit defisiensi pertumbuhan (Gambar 4A). Analisis Western blot mengkonfirmasi penurunan ekspresi protein JAK1 dalam perluasan sel Jak1fl/+Ncr1Cre NK yang disejajarkan dengan penurunan kadar perforin (Gambar 4B). Sejalan dengan itu, sel Jak1fl/+Ncr1Cre NK menunjukkan gangguan aktivitas sitotoksik terhadap garis sel target YAC-1 dan RMA-Rae1 (Gambar 4C). Hasil ini membuktikan bahwa JAK1 tidak hanya diperlukan untuk mempertahankan sel NK di perifer tetapi juga berkontribusi terhadap aktivitas sitotoksiknya.

Penipisan Sel NK yang Disebabkan oleh Hilangnya Satu Alel Jak1 Mengganggu Pengawasan Tumor

Sel NK sangat penting untuk pengenalan dini dan eliminasi sel yang ditransformasi. Untuk menyelidiki apakah pengurangan sel NK dan gangguan fungsinya pada tikus Jak1fl/+Ncr1Cre menghasilkan peningkatan kerentanan terhadap pertumbuhan tumor dan tidak dikompensasi dengan cara lain, kami menggunakan sel limfoma RMA-Rae1. Garis sel ini adalah alat untuk mempelajari pengawasan tumor yang bergantung pada sel NK dengan cara yang kuat dan efisien (20). Kami secara subkutan mentransplantasikan sel limfoma RMA-Rae1 ke kedua sisi tikus Jak1fl/+ dan Jak1fl/+Ncr1Cre. Kurangnya satu alel Jak1 mengganggu kemampuan sel NK untuk mengendalikan pertumbuhan tumor seperti yang diilustrasikan oleh peningkatan ukuran tumor (Gambar 5A) dan berat tumor pada Jak1fl/+Ncr1Cre (Gambar 5B). Sejalan dengan itu, tumor-tumor ini menunjukkan penurunan infiltrasi sel NK secara signifikan (Gambar 5C, D). Kami gagal mendeteksi perbedaan dalam frekuensi sel NK yang menginfiltrasi tumor NKG2D+ (Gambar 5E), yang sangat penting untuk mengenali tumor RMA-Rae1. Singkatnya, hasil kami menunjukkan berkurangnya jumlah sel NK dikombinasikan dengan gangguan fungsi sel NK pada tikus Jak1fl/+Ncr1Cre cukup untuk secara signifikan mengganggu pengendalian pertumbuhan tumor in vivo.

GAMBAR 5|Hilangnya satu alel Jak1 mengganggu pengawasan tumor. (A, B) Tikus Jak1fl/+ dan Jak1fl/+Ncr1Cre disuntik sc dengan 106 sel RMA-Rae1 dan setelah 10 hari berat tumor dinilai. Yang ditampilkan adalah (A) gambar tumor yang representatif dan (B) plot titik dengan garis horizontal yang mewakili rata-rata bobot tumor ± SEM dari 2 percobaan independen; n=6–8 (C, D) Sel NK yang menginfiltrasi tumor dianalisis dengan flow cytometry. (C) Plot representatif sel CD3−NKp46+ yang menginfiltrasi tumor dan persentasenya di antara sel Rae1− ditampilkan. (D) Jumlah total sel CD3−NKp46+ yang menginfiltrasi tumor per gram tumor dan (E) persentase sel NKG2D+ NK disajikan dalam bentuk grafik batang yang menunjukkan rata-rata ± SEM dari satu percobaan n=4– 5. ***p < 0,001.

DISKUSI

Disregulasi jalur pensinyalan JAK-STAT sangat erat kaitannya dengan perkembangan kanker serta gangguan kekebalan (7). Penyakit terkait JAK pertama yang ditemukan adalah defisiensi imun gabungan parah (SCID) yang ditandai dengan kelainan sel NK yang disebabkan oleh mutasi LOF JAK3 (26, 27). Kami di sini menunjukkan bahwa penghapusan JAK1 dalam sel NKp46+ menyebabkan defisiensi imun bawaan dengan hilangnya sel NK dan ILC1 di organ perifer, sedangkan JAK2 berlebihan untuk kelangsungan hidup dan pematangan sel NK. Penelitian kami sebelumnya menemukan bahwa hilangnya STAT5 pada sel NK menyebabkan penurunan jumlah sel NK pada organ perifer (18). Hilangnya sel NK pada tikus Stat5fl/flNcr1Cre diselamatkan dengan memaksakan ekspresi molekul pro-survival BCL2 (28). Studi ini mendefinisikan STAT5 sebagai faktor kelangsungan hidup yang penting untuk sel NK. Tikus yang kekurangan STAT5B sebagian besar kekurangan sel NK (29), sejalan dengan fakta bahwa STAT5 memberi sinyal hilir sitokin yang penting untuk biologi sel NK, seperti IL-2 atau IL-15 (30). IL-15 sangat penting untuk pengembangan dan kelangsungan hidup sel NK karena tikus Il15−/− sebagian besar tidak memiliki sel NK perifer (31). IL-15 memberi sinyal melalui kompleks reseptor rantai reseptor c, IL-2R , dan IL-15r (32). Tikus knockout dari setiap rantai reseptor membuktikan peran yang sangat penting untuk sinyal yang dikirim ke hilir IL-15 untuk pengembangan sel NK (33, 34). Sampai saat ini, kontribusi JAK3 yang terkait dengan c terhadap pengembangan sel NK telah diketahui dengan baik. Tikus dengan defisiensi JAK3 menunjukkan fenotip SCID serupa seperti yang diamati pada pasien manusia dan perkembangan sel NK terhambat pada tahap progenitor pra-NK (35, 36). Sekarang kami menempatkan JAK1 yang sebelumnya kurang dihargai sebagai bagian penting dari sumbu IL-15/STAT5 di sel NK. Sel NK Jak1fl/flNcr1Cre menunjukkan hambatan perkembangan pada tahap sel iNK dan hilangnya sel NK hampir seluruhnya di organ perifer.

Menariknya, konsekuensi penghapusan JAK1 pada sel NK melebihi efek defisiensi STAT5-. Penurunan aktivasi gabungan STAT3 dan STAT5 mungkin mendasari hilangnya sel NK yang lebih parah, karena STAT3 telah terbukti menginduksi ekspresi gen kelangsungan hidup sel NK Mcl1 yang penting (37, 38). Alternatifnya, JAK1 dan STAT5 mungkin memiliki waktu paruh berbeda yang menjelaskan frekuensi berbeda dari "penghapus saja"—sel NK yang baru saja kehilangan gen tetapi masih membawa protein, yang mungkin menjelaskan perbedaannya. Efek dosis gen dari defisiensi JAK1-tercermin dalam jumlah sel NK, sedangkan hilangnya satu alel JAK1 dapat digunakan untuk pematangan sel NK. Hal ini menunjukkan bahwa STAT5 yang teraktivasi membatasi laju kelangsungan hidup sel NK tetapi tidak untuk maturasi. Penghapusan satu alel Jak1 juga cukup untuk mengganggu pengawasan tumor secara signifikan berdasarkan penurunan jumlah sel NK dikombinasikan dengan berkurangnya fungsi sel NK yang tersisa. Sesuai dengan data kami, penghapusan spesifik sel NK dari gen target STAT5 Mcl1 menyebabkan defisiensi sel NK yang parah yang menyebabkan peningkatan beban metastasis yang signifikan (38).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

JAK mungkin menunjukkan fungsi yang berlebihan dan saling mengimbangi. Hilir reseptor interferon JAK1 dapat mengkompensasi sebagian hilangnya aktivitas kinase JAK2 (39). JAK2 juga telah terbukti memfosforilasi STAT5 di bagian hilir IL-15 selama diferensiasi in vitro sel NK (16). Di sisi lain, JAK2 yang aktif secara konstitutif hanya dapat mengkompensasi hilangnya JAK1 dalam sel induk yang menunjukkan peran JAK1 dan 2 yang tidak berlebihan dalam HSC. Sejalan dengan itu, kami mengamati bahwa dengan tidak adanya JAK1, JAK2 gagal memberikan kompensasi dalam mengaktifkan STAT5, bahkan di bawah IL-2 dosis tinggi secara in vitro, untuk memungkinkan kelangsungan hidup sel NK. Masih harus dijelaskan apakah efek kompensasi dapat dicapai dengan menyatakan bentuk JAK2 yang aktif secara konstitutif. Lebih penting lagi, kami menunjukkan bahwa hilangnya JAK2 dalam sel NKp46+ dapat diabaikan untuk kelangsungan hidup sel NK. Sel NK yang kekurangan JAK2-sudah matang sepenuhnya, membuktikan bahwa JAK2 intrinsik sel NK tidak mendorong pematangan sel NK. Hal ini juga menunjukkan bahwa gangguan pematangan sel NK pada tikus Jak2fl/flMx1Cre (14) kemungkinan besar disebabkan oleh fungsi ekstrinsik sel NK dari JAK2. Orang mungkin berspekulasi bahwa penghapusan JAK2 secara konstitutif mengubah lingkungan sitokin.

REFERENSI

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Sel pembunuh alami: pengembangan, pematangan, dan pemanfaatan klinis. Imunol Depan. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. JS Oranye. Defisiensi sel pembunuh alami. J Alergi Klinik Imunol. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK dan molekul pemberi sinyal STAT dalam imunoregulasi dan penyakit yang dimediasi kekebalan. Imunitas (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Stark GR, Darnell JE. Jalur JAK-STAT jam dua puluh. Imunitas (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Shuai K, Liu B. Regulasi pensinyalan JAK-STAT dalam sistem kekebalan tubuh. Nat Rev Imunol. (2003) 3:900–11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAK dan STAT dalam imunitas, imunodefisiensi, dan kanker. N Engl J Med. (2013) 368:161–70. doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. Regulasi JAK dalam pensinyalan sitokin dan pemecahannya pada penyakit. Sitokin (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [Epub sebelum dicetak].

8. Mutasi Lorenzini T, Dotta L, Giacomelli M, Vairo D, Badolato R. STAT sebagai pengalih program: mengubah defisiensi imun primer menjadi penyakit autoimun. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G, dkk. Jak1 memiliki peran dominan dibandingkan Jak3 dalam transduksi sinyal melalui reseptor sitokin yang mengandung c. Kimia Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Eletto D, Burns SO, Angulo I, Plagnol V, Gilmour KC, Henriquez F, dkk. Mutasi JAK1 biallelic pada pasien imunodefisiensi dengan infeksi mikobakteri. Nat Komuni. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, dkk. Gangguan pada gen Jak1 menunjukkan peran Jak yang wajib dan tidak berlebihan dalam respons biologis yang diinduksi sitokin. Sel (1998) 93:373–83.

12. Kleppe M, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi E, dkk. Jak1 Mengintegrasikan penginderaan sitokin untuk mengatur fungsi sel induk hematopoietik dan menekan hematopoiesis. Sel Induk Sel (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Schwartz DM, Kanno Y, Villarino A, Ward M, Gadina M, O'Shea JJ. Penghambatan JAK sebagai strategi terapi untuk penyakit imun dan inflamasi. Penemuan Narkoba Nat Rev. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos A, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli A, Frei A, Tzankov A, dkk. Penurunan pengawasan imunosurvei tumor sel NK akibat penghambatan JAK meningkatkan metastasis pada model kanker payudara. Nat Komuni. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Schönberg K, Rudolph J, Vonnahme M, Parampalli Yajnanarayana S, Cornez I, Hejazi M, dkk. Penghambatan JAK merusak fungsi sel NK pada neoplasma mieloproliferatif. Res Kanker. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.BISA-14-3198

16. Kim WS, Kim MJ, Kim DO, Byun JE, Huy H, Song HY, dkk. Penekan sinyal sitokin 2 secara negatif mengatur diferensiasi sel NK dengan menghambat aktivitas JAK2. Rep Sains (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Krempler A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Generasi alel knockout bersyarat untuk gen Janus kinase 2 (Jak2) pada tikus. Kejadian (2004) 40:52–7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart E, Warsch W, Zebedin E, Simma O, Stoiber D, Kolbe T, dkk. Tikus Ncr1 -Cre yang baru mengungkap peran penting STAT5 untuk kelangsungan hidup dan perkembangan sel NK. Darah (2011) 117:1565–74. doi: 10.1182/darah-2010-06-291633

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C, dkk. Inaktivasi Stat5 pada epitel mammae tikus selama kehamilan menunjukkan fungsi berbeda dalam proliferasi sel, kelangsungan hidup, dan diferensiasi. Biol Sel Mol. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.8037-8047.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Ekspresi ektopik gen -1 yang dapat diinduksi awal asam retinoat (RAE-1) memungkinkan penolakan yang dimediasi sel pembunuh alami terhadap tumor yang mengandung MHC kelas I secara in vivo. Proc Natl Acad Sci AS. (2001) 98:11521–6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz E, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar A, Wirth S, Berger A, dkk. Fosforilasi STAT1-S727 yang dimediasi CDK menahan sitotoksisitas sel NK dan pengawasan tumor. Perwakilan Sel (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Geiger TL, Sun JC. Perkembangan dan pematangan sel pembunuh alami. Opini Imunol Saat Ini. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel M, Artyomov MN, Ivanova Y, dkk. Sel pembunuh alami (NK) yang tinggal di jaringan adalah garis keturunan sel yang berbeda dari sel NK limpa timus dan konvensional. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng H, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei H, Gao X, dkk. Sel NK yang tinggal di hati memberikan kekebalan adaptif pada peradangan kontak kulit. J Clin Investasikan. (2013) 123:1444–56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Martinet L, Ferrari De Andrade L, Guillerey C, Lee JS, Liu J, Souza-Fonseca Guimaraes F, dkk. Ekspresi DNAM-1 menandai program alternatif pematangan sel NK. Perwakilan Sel (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F, dkk. Mutasi gen Jak-3 pada pasien dengan defisiensi imun gabungan parah (SCID) autosomal. Alam (1995) 377(6544):65–8.

27. Russell SM, Tayebi N, Nakajima H, Riedy MC, Roberts JL, Aman MJ, dkk. Mutasi Jak3 pada pasien dengan SCID: peran penting Jak3 dalam perkembangan limfoid. Sains (1995) 270:797–800.

28. Gotthardt D, Putz EM, Grundschober E, Prchal-Murphy M, Straka E, Kudweis P, dkk. STAT5 adalah pengatur utama dalam sel NK dan bertindak sebagai saklar molekuler dari pengawasan tumor ke promosi tumor. Penemuan Kanker. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino AV., Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti B, Robinson GW, dkk. Ambang batas STAT5 yang ditentukan subset dan jaringan mengontrol homeostasis dan fungsi sel limfoid bawaan. J Exp Med. (2017) 214:2999–3014. doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais A, Viel S, Grau M, Henry T, Marvel J, Walzer T. Regulasi pengembangan dan fungsi sel NK tikus oleh sitokin. Imunol Depan. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M, dkk. Cacat yang dapat dibalik pada garis keturunan sel T CD8 pembunuh alami dan memori pada tikus yang kekurangan interleukin 15-. J Exp Med. (2000) 191:771–80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ikemizu S, Chirifu M, Davis SJ. Kompleks pensinyalan IL-2 dan IL-15: berbeda tetapi sama. Nat Imunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett M, dkk. Diferensiasi sel pembunuh alami: wawasan dari model tikus knockout dan transgenik serta sistem in vitro. Imunol Pendeta (1998) 165:47–61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, dkk. Reseptor IL-15 mempertahankan homeostasis limfoid dengan mendukung homing dan proliferasi limfosit. Imunitas (1998) 9:669–76.

35. Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, dkk. Cacat perkembangan sel limfoid pada tikus yang kekurangan Jak3 kinase. Imunitas (1995) 3:771–82.

36. Robinette ML, Cella M, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder K, dkk. Defisiensi Jak3 menghambat perkembangan sel limfoid bawaan. Imunol Mukosa. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD, dkk. Sorafenib membuat tumor padat peka terhadap antibodi agonis reseptor Apo2L/TRAIL dan Apo2L/TRAIL melalui sumbu Jak2-Stat3-Mcl1. PLoS SATU (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ, dkk. Imunodefisiensi bawaan setelah ablasi genetik Mcl1 dalam sel pembunuh alami. Nat Komuni. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil E, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling M, Liebfried P, Strobl B, dkk. Fungsi perancah penting dari Janus kinase 2 ditemukan oleh model tikus baru yang menyimpan mutasi loop aktivasi Jak2. Darah (2014) 123:520–9. doi: 10.1182/darah-2013-03-492157